Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropieexperimente zur Inversierung von MHC-II-Peptid-Komplexen
©2012
Bachelorarbeit
31 Seiten
Zusammenfassung
Inhaltsangabe:Einleitung:
Der menschliche Körper verfügt über ein Immunsystem, das dafür vorgesehen ist Krankheitserreger zu bekämpfen, fremde Substanzen zu entfernen aber auch körpereigene, fehlerhafte Zellen zu zerstören. Es kann grob in zwei Arten von Mechanismen eingeteilt werden. Zum Einen gibt es die unspezifische Immunabwehr.
Dazu zählen anatomische/physiologische Barrieren wie z.B. die Haut genauso wie unspezifische Lymphozyten wie Phagozyten und natürliche Killerzellen, aber auch jede Form von Inflammation. Diese Form der Immunabwehr ist primär darauf ausgelegt Infektionen frühzeitig zu verhindern.
Die spezifische Immunantwort basiert darauf, dass T-Lymphozyten in der Lage sind Krankheitserreger an charakteristischen Strukturen, den Antigenen, die von einer Vielzahl von Zelltypen präsentiert werden, zu erkennen und die Bildung von spezialisierten Antikörpern in B-Lymphozyten zu organisieren. Die Aufgabe der Antikörper ist es dann den Erreger an der Vermehrung zu hindern, sodass sie letztendlich abgebaut werden können und keine weitere Gefahr mehr von ihnen ausgeht. Die Struktur von einmal entwickelten Antikörpern wird anschließend in Gedächtniszellen gespeichert um bei erneuter Infektion mit dem gleichen Krankheitserreger schneller und angemessen reagieren zu können.
Nicht immer funktioniert das Immunsystem korrekt. Richtet sich eine Immunantwort gegen körpereigenes Gewebe, das fälschlicherweise als Fremdkörper erkannt wurde, spricht man von einer Autoimmunerkrankung.
Ein Beispiel ist die rheumatoide Arthritis (RA). Sie ist die häufigste entzündliche Krankheit der Gelenke und wird mit der HLA-DR1 Antigenpresentation in seropositiven Patienten in Zusammenhang gebracht. HLA-DR1 ist in der Lage Peptidbruchstücke zu binden und wird von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) produziert um T-Lymphozyten gegenüber den Befall von Krankheitserregern zu signalisieren.
Seit 2010 ist bekannt, dass, entgegen der vorherigen Meinung, das CLIP (Class II-associated invariant chain peptide), mit dem HLA-DR1 nativerweise beladen ist, nicht nur in einer kanonischen Konformation gebunden werden kann, sondern ebenfalls in einen geflippten Zustand wechseln kann. Dieser Vorgang wird katalysiert von HLA-DM. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Konformationsänderungen von MHC-II Proteinen durch Bindung von CLIP veränderte Immunantworten hervorrufen können. Auf Basis dessen soll nun in dieser Arbeit der Flipprozess vom natürlich vorkommenden CLIP102-120 […]
Der menschliche Körper verfügt über ein Immunsystem, das dafür vorgesehen ist Krankheitserreger zu bekämpfen, fremde Substanzen zu entfernen aber auch körpereigene, fehlerhafte Zellen zu zerstören. Es kann grob in zwei Arten von Mechanismen eingeteilt werden. Zum Einen gibt es die unspezifische Immunabwehr.
Dazu zählen anatomische/physiologische Barrieren wie z.B. die Haut genauso wie unspezifische Lymphozyten wie Phagozyten und natürliche Killerzellen, aber auch jede Form von Inflammation. Diese Form der Immunabwehr ist primär darauf ausgelegt Infektionen frühzeitig zu verhindern.
Die spezifische Immunantwort basiert darauf, dass T-Lymphozyten in der Lage sind Krankheitserreger an charakteristischen Strukturen, den Antigenen, die von einer Vielzahl von Zelltypen präsentiert werden, zu erkennen und die Bildung von spezialisierten Antikörpern in B-Lymphozyten zu organisieren. Die Aufgabe der Antikörper ist es dann den Erreger an der Vermehrung zu hindern, sodass sie letztendlich abgebaut werden können und keine weitere Gefahr mehr von ihnen ausgeht. Die Struktur von einmal entwickelten Antikörpern wird anschließend in Gedächtniszellen gespeichert um bei erneuter Infektion mit dem gleichen Krankheitserreger schneller und angemessen reagieren zu können.
Nicht immer funktioniert das Immunsystem korrekt. Richtet sich eine Immunantwort gegen körpereigenes Gewebe, das fälschlicherweise als Fremdkörper erkannt wurde, spricht man von einer Autoimmunerkrankung.
Ein Beispiel ist die rheumatoide Arthritis (RA). Sie ist die häufigste entzündliche Krankheit der Gelenke und wird mit der HLA-DR1 Antigenpresentation in seropositiven Patienten in Zusammenhang gebracht. HLA-DR1 ist in der Lage Peptidbruchstücke zu binden und wird von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) produziert um T-Lymphozyten gegenüber den Befall von Krankheitserregern zu signalisieren.
Seit 2010 ist bekannt, dass, entgegen der vorherigen Meinung, das CLIP (Class II-associated invariant chain peptide), mit dem HLA-DR1 nativerweise beladen ist, nicht nur in einer kanonischen Konformation gebunden werden kann, sondern ebenfalls in einen geflippten Zustand wechseln kann. Dieser Vorgang wird katalysiert von HLA-DM. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Konformationsänderungen von MHC-II Proteinen durch Bindung von CLIP veränderte Immunantworten hervorrufen können. Auf Basis dessen soll nun in dieser Arbeit der Flipprozess vom natürlich vorkommenden CLIP102-120 […]
Leseprobe
Inhaltsverzeichnis
Stellmacher, Johannes: Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropieexperimente zur
Inversierung von MHC-II-Peptid-Komplexen, Hamburg, Diplomica Verlag GmbH 2013
PDF-eBook-ISBN: 978-3-8428-4843-6
Herstellung: Diplomica Verlag GmbH, Hamburg, 2013
Zugl. Freie Universität Berlin, Berlin, Deutschland, Bachelorarbeit, Dezember 2012
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http://www.diplom.de, Hamburg 2013
Printed in Germany
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2
2 Biologische Grundlagen
3
2.1 Das HLA-System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
2.2 HLA-DR1, HLA-DM und deren Rolle in der Immunreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
3 Physikalische Grundlagen
4
3.1 Absorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
3.2 Emission . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
3.2.1 Fluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
3.2.2 Phosphoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
3.3 Fluoreszenzquenching . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
3.4 Fluoreszenzanisotropie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
4 Material und Methoden
10
4.1 Puer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
4.2 Lucifer Yellow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
4.3 CLIP
102-120
-C11-LY und CLIP
102-120
-C12-LY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
4.4 HLA-DR1 und HLA-DM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
4.5 Absorptionspektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
4.6 Fluoromax . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
4.7 Tsunami 3950 ps-Laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
5 Resultate
14
5.1 Quenching . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
5.2 Anisotropiemessungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
6 Zusammenfassung und Diskussion
25
1
1 Einleitung
Der menschliche Körper verfügt über ein Immunsystem, das dafür vorgesehen ist Krankheitserreger zu
bekämpfen, fremde Substanzen zu entfernen aber auch körpereigene, fehlerhafte Zellen zu zerstören.Es
kann grob in zwei Arten von Mechanismen eingeteilt werden.Zum Einen gibt es die unspezische Immu-
nabwehr.Dazu zählen anatomische/physiologische Barrieren wie z.B.die Haut genauso wie unspezische
Lymphozyten wie Phagozyten und natürliche Killerzellen, aber auch jede Form von Inammation.Diese
Form der Immunabwehr ist primär darauf ausgelegt Infektionen frühzeitig zu verhindern.Die spezische
Immunantwort basiert darauf, dass T-Lymphozyten in der Lage sind Krankheitserreger an charakteristi-
schen Strukturen, den Antigenen, die von einer Vielzahl von Zelltypen präsentiert werden, zu erkennen
und die Bildung von spezialisierten Antikörpern in B-Lymphozyten zu organisieren.Die Aufgabe der An-
tikörper ist es dann den Erreger an der Vermehrung zu hindern, sodass sie letztendlich abgebaut werden
können und keine weitere Gefahr mehr von ihnen ausgeht.Die Struktur von einmal entwickelten Anti-
körpern wird anschlieÿend in Gedächtniszellen gespeichert um bei erneuter Infektion mit dem gleichen
Krankheitserreger schneller und angemessen reagieren zu können[1].
Nicht immer funktioniert das Immunsystem korrekt.Richtet sich eine Immunantwort gegen körperei-
genes Gewebe, das fälschlicherweise als Fremdkörper erkannt wurde, spricht man von einer Autoimmuner-
krankung.Ein Beispiel ist die rheumatoide Arthritis (RA).Sie ist die häugste entzündliche Krankheit der
Gelenke und wird mit der HLA-DR1 Antigenpresentation in seropositiven Patienten in Zusammenhang
gebracht [2].HLA-DR1 ist in der Lage Peptidbruchstücke zu binden und wird von Antigen-präsentierenden
Zellen (APC) produziert um T-Lymphozyten gegenüber den Befall von Krankheitserregern zu signalisie-
ren.Seit 2010 ist bekannt, dass, entgegen der vorherigen Meinung, das CLIP (Class II-associated invariant
chain peptide), mit dem HLA-DR1 nativerweise beladen ist, nicht nur in einer kanonischen Konformati-
on gebunden werden kann, sondern ebenfalls in einen geippten Zustand wechseln kann.Dieser Vorgang
wird katalysiert von HLA-DM [3].Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Konformationsänderungen von
MHC-II Proteinen durch Bindung von CLIP veränderte Immunantworten hervorrufen können[4].
Auf Basis dessen soll nun in dieser Arbeit der Flipprozess vom natürlich vorkommenden CLIP
102-120
untersucht werden.Dazu wird das CLIP mit dem Fluoreszenzfarbsto Lucifer Yellow markiert.Es soll
sowohl der Farbsto als auch das CLIP, insbesondere im Komplex mit HLA-DR1 untersucht und biophy-
sikalisch näher charakterisiert werden.Hierfür werden Absorptions- und Emissionspsektren und speziell
auch Fluoreszenzanisotropiemessungen genutzt.
2
Abbildung 1:
Struktur von HLA-DR1 mit CLIP (rot)(links, PDB: 3QXD)[6] und HLA-DM (rechts, PDB:
2BC4)[7]; HLA-DR1 besteht wie alle MHC-Klasse II Moleküle aus 4 extrazellulären Domänen, 2 -Domänen
und 2 -Domänen. Es ist mit den
2
und
2
Domänen in der Membran befestigt, während die
1
und
1
Dö-
mänen ein Mulde bilden in der Peptide gebunden werden können, in diesem Bild jedoch ist noch das CLIP (rot)
gebunden. HLA-DM hat als MHC-Klasse II Molekül eine ähnliche Grundstruktur wie HLA-DR1, allerdings ist
seine Bindungstasche stets geschlossen und es bindet keine Peptide. Stattdessen verfügt es über die 3 Liganden
2-(Acetylamino)-2-Deoxy-A-D-Glucopyranosm, -D-Mannose und ein Chlorid-Ion
2 Biologische Grundlagen
2.1 Das HLA-System
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) fasst eine Reihe von
Genen zusammen, die für die Funktion des Immunsystems eine zentrale Rolle spielen. Beim Menschen wird
der MHC als HLA-System (Humanes Leukozyten Antigen-System) bezeichnet und umfasst ca 4000 Kilo-
basen (kb) die sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 benden. Man unterscheidet im Wesentlichen
zwischen den Hauptregionen HLA-Klasse I und HLA-Klasse II, welche für unteschiedliche funktionelle
Gruppen von HLA-Molekülen kodieren. HLA-Klasse I unterscheidet man weiter in HLA-Kasse Ia, Ib und
Ic während sich HLA-Klasse II in HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP aufspaltet. Auch die Genorte HLA-
DMA/B und HLA-DOA/B, die für HLA-Klasse II ähnliche Moleküle kodieren, gehören in die HLA-Klasse
II Region[5]. Das HLA-System weist für die meisten Genorte eine Vielzahl von Allelen auf und ist damit
hoch polymorph, was die Relevanz für den Organismus unterstreicht.
2.2 HLA-DR1, HLA-DM und deren Rolle in der Immunreaktion
Sowohl HLA-DR1 als auch HLA-DMgehören zu den MHC Typ II Proteinen und werden damit nur
von exklusiven Zelltypen, sogenanten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) ausgebildet. Dazu gehören
u.a. Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen. Wie viele andere Proteine werden sie im En-
doplasmatischen Retikulum (ER) gebildet. Während des Aufenthalts von HLA-DR1 im ER schützt die
invariante Kette dessen Bindungstasche vor der Aufnahme von anderen Peptiden. Währenddessen werden
an der Zellmembran über Endozytose extrazelluläre Antigene aufgenommen und in den Endosomen von
Proteasen weiter zerlegt. Sowohl HLA-DR1 als auch HLA-DMwerden vom ER ebenfalls zu Endosomen
3
Abbildung 2:
Schematische Übersicht über die Antigenpräsentation von MHC I (links) und MHC II (rechts)[9]
transportiert, wo die invariante Kette vom HLA-DR1 abgespalten wird und lediglich das CLIP (Class II-
associated invariant chain peptide) in der Bindungstasche zurück lässt.Hier kann HLA-DM an HLA-DR1
binden, was von der Anwesenheit von höher anen Peptiden zusätzlich gefördert wird, und katalysiert
somit die Dissoziation des CLIP aus der Bindungstasche und die Bindung neuer Peptide [8]. HLA-DR1
verfügt über 9 Bindungstaschen, die es ihm ermöglichen über ein Wasserstobrückenbindungsnetzwerk
verschiedenste Peptide zu binden. Über Vesikel gelangt HLA-DR1 anschlieÿend an die Zelloberäche und
präsentiert dort die gebundenen Peptide nach auÿen. Diese Epitope können über den CD4-Rezeptor von
T-Helferzellen gebunden werden, welche dann das gebundene Peptid als körpereigen oder körperfremd
erkennen (Abb. 2). Sollte ein körperfremdes Peptid erkannt werden, kann eine Immunantwort eingeleitet
werden.
3 Physikalische Grundlagen
Jedem Molekül kann in jedem Zustand und jeder Konformation eine spezische Wellenfunktion zuge-
schrieben werden. Diese Wellenfunktion beschreibt das Molekül in seiner Gänze mit allen Eigenschaften
der Elektronen und Atomkerne. Zu bemerken ist dabei, dass sich die Elektronen um ein vielfaches schneller
bewegen als die Kerne, welche eine Schwingunsperiode von typischerweise 10
-13
s
haben. Dadurch stellt
sich zu jeder Konstellation der Kerne R praktisch instantan eine wohldenierte Elektronenkonguration
mit der Wellenfunktion
el
n
(r, R) ein, die seperiert von der Kernwellenfunktion behandelt werden kann.
Betrachtet man nun elektronische Übergänge, die im Bereich von 10
-15
s
ablaufen, kann der Abstand der
Elektronen zu den Kernen während des Übergangs als konstant angesehen werden. Mit diesem konstantem
Abstand der Elektronen zum Kern verlaufen Übergänge im Potentialkurvendiagramm (Abb. 3) also immer
senkrecht (Franck-Condon-Prinzip). Und zwar immer so, dass die Übergänge mit dem gröÿten Überlap-
pintegral der Zustände, den Übergängen mit der höchsten Wahrscheinlichkeit entsprechen. Da man sich
im Folgenden für das Abstrahlverhalten (und Absorptionsveralten) bei elektronischen Übergängen inter-
4
essieren, werde ich mich nun analog zum klassischen Herz'schen Dipol mit dem quantenmechanischen
Dipolmoment p befassen. Sein mittelwert im Zustand i beschreibt sich durch:
p
= e · r = e ·
^
i
r
i
d
(1)
wobei r der Ortsvektor des Elektrons ist und d = dxdydz. Beim Übergang E
i
E
k
müssen allerdings
die Erwartungswerte r von beiden Zuständen berücksichtigt werden. Daher führt man das Übergangsdi-
polmoment p
ik
ein:
p
ik
= e ·
^
i
r
k
d
(2)
Hierbei stehen die Indizes i und k für die beteiligten quantenmechanischen Zustände (n
i
, l
i
, m
l
i
, m
s
i
) und
(n
k
, l
k
, m
l
k
, m
s
k
). Aus Symmetriegründen gilt p
ik
= p
ki
, sodass mit:
1
2
(| p
ik
| + | p
ki
|)
2
= 2| p
ik
|
2
(3)
für ein Atom im Zustand E
i
für den den Übergang E
i
E
k
sich im Mittel folgende abgestrahlte Leistung
ergibt:
P
ik
=
4
3
4
ik
4
0
c
3
| p
ik
|
2
(4)
Was genau dem klassischen Analogon entspricht, wenn p
2
durch 2| p
ik
|
2
ersetzt wird. Integriert man nun
über alle Frequenzen
ik
die an einem elektronischen Übergang beteiligt sind und nutzt die Identität für
die gesamte abgestrahlte Intensität I =
P
4r
2
gelangt man zu einem Ausdruck der weitläug als Fermis
goldene Regel bekannt ist und welcher die Abhängigkeit der Intensität eines Übergangs mit der elektrischen
Feldstärke und dem elektrischen Dipolmoment in Zusammenhang bringt:
I
E
2
| p
ik
|
2
(5)
Während nun das elektrische Feld eine Eigenschaft der einfallenden Strahlung ist, ist das Dipolmoment
vollkommen abhängig vom jeweiligen Molekül und spiegelt im wesentlichen die Beweglichkeit der Elek-
tronen wieder. In Hinblick auf die experimentelle Untersuchung von Stoen ist es praktisch immer wün-
schenswert eine hohe Intensität zu erreichen, daher soll nun besprochen werden welche Beschaenheit ein
Molekül haben muss, um eine hohe Mobilität von Elektronen aufzuweisen um damit das Dipolmoment
und letztendlich die Intensität zu erhöhen. Zu diesem Zweck führe ich den Begri der Hybridisierung
ein. Durch die Wechselwirkung zwischen den an Bindungen beteiligten Atomen werden deren Elektronen-
hüllen verformt und verlieren ihre ursprünglich Kugelform. Man kann dies näherungsweise beschreiben
indem man die Molekülorbitale durch Linearkombinationen aus den s,p,d, ... -Atomorbitalen approximiert.
Werden dabei bespielsweise s- und p- Orbitale verwendet spricht man von s-p-Hybridisierung.
Auf Basis diesr Theorie lassen sich die Eigenschaften von konjugierten und aromatischen Molekülen
erklären. Diese weisen eine enorm erhöhte Polarisierbarkeit entlang der Bindungsebene auf. Es stellt sich
heraus dass diese oensichtlich leicht beweglichen, delokalisierten Elektronen aus p-Orbitalen stammen
und -Bindungen bilden. Man spricht von delokalisierten -Elektronen-Systemen. Elektronen aus diesen
Orbitalen können keinem Kern eindeutig zugeordnet werden, sondern können sich viel mehr frei entlang
des gesamten -Elektronen-Systems bewegen. Viele Farbstoe und Fluorophore weisen diese konjugierten
oder aromatischen Bindungen auf.
3.1 Absorption
Die Absorption bezeichnet in diesem Fall eine mögliche Wechselwirkung zwischen elektromagnetischer
Strahlung und Materie. Hierbei wird ein einfallendes Photon mit der Energie E = h vollständige von der
Materie aufgenommen. Mit dieser Energie können an dieser Stelle eine vielzahl von Prozessen eingeleitet
werden. Im Weiteren soll hier die Anregung von höheren elektronischen Zuständen diskutiert werden.
Dabei wird die gesamte Energie des Photons auf ein Elektron übertragen und dafür genutzt es von einem
5
E
i
E
i
E
P hoton
= h = |E
i
- E
i
|
I
= I
0
e
-
cd
-ln
I
I
0
=
cd
log
10
(e) 2, 3
E
= log
10
I
0
I
= cd
E
S
1,2
T
1
= 10 ns
S
1
S
0
S
1
S
2
S
3
S
1
S
0
S
1
T
1
Wenn ein Fluorophor mit konstanter Intensität angeregt wird, wird sich nach hinreichender Zeit eine
konstante Konzentration an angeregten Fluorophoren [F
] einstellen:
d
[F
]
dt
= f(t) - [F
]
0
= 0
(10)
Wobei f(t) die konstante Anregung und [F
]
0
=
-1
0
die Zerfallsrate des angeregten Zustandes des
Fluorophors bei Abwesenheit eines Quenchers ist. Bei Anwesenheit des Quenchers kommt ein weiterer
Term für den Zerfall k
q
[Q] hinzu:
d
[F
]
dt
= f(t) - ( + k
q
[Q])[F
] = 0
(11)
Die Division der Glg. 10 und 11 ergibt schlieÿlich:
F
0
F
=
+ k
q
[Q]
(12)
= 1 +
0
k
q
[Q]
(13)
= 1 + K
D
[Q]
(14)
Was die Stern-Volmergleichung für dynamische Quenchingprozesse darstellt. Sie stellt die Verminderung
der Fluoreszenzintensität quantitativ mit der Quencherkonzentration in Verbindung. Analog gilt für die
Fluoreszenzlebenszeiten :
0
= 1 + K
D
[Q]
(15)
K
D
, die Stern-Volmer-Quenchingkonstante, charakterisiert hierbei den dynamischen Quenchingprozess.
Überlicherweise wird der Quotient aus ungequenchter und gequenchter Fluoreszenzintensität F
0
/F
über
die Konzentration des Quenchers aufgetragen, sogenante Stern-Volmer-Plots, um aus der Steigung K
D
zu
erhalten.
Um von vornherein statisches von dynamischem Quenching zu unterscheiden ist es möglich Stern-
Volmer-Plots zu betrachten. Während die Komplexe bei statischem Quenching meist wenig bis gar nicht
von der Konzentration des Quenchers abhängig sind und somit ein konstanter Wert für F
0
/F
zu erwarten
ist, liegt bei dynamischem Quenching ein linearer Zusammenhang mit der Konzentration des Quenchers
vor (Glg. 14). In Einzelfällen könnnen auch statische Quenchingprozesse einen linearen Stern-Volmer-Plot
erzeugen. Die Steigung ist hier
F
0
F
= 1 + K
S
[Q]
(16)
Wobei K
S
das chemische Gleichgewicht zwischen Fluorophor und Quencher darstellt. Um denitive Aussa-
gen über die Art des Quenchings machen zu können, kann man beispielsweise Messungen bei verschiedenen
Temperaturen machen. Bei höheren Temperaturen werden sich die Quenchermoleküle schneller bewegen
wodurch Stöÿe mit dem Fluorophor wahrscheinlicher werden, was in einem Anstieg der Steigung resultiert,
da der Fluorophor besser gequencht wird. Andererseits führen höhere Temperaturen auch zur Dissoziati-
on von schwachen Bindungen zwischen Quencher und Fluorophor wodurch eventuelle Komplexe getrennt
werden können und im Zweifelsfall zur Verringerung der Steigung führt. Des Weiteren ist es auch mög-
lich zur Unterscheidung Fluoreszenzlebenszeiten zu messen. Die Komplexe von Fluorophor und Quencher
bei statischem Quenching sind nicht uoreszent, die einzige zu beobachtende Fluoreszenz stammt also
von ungequenschten Fluorophoren, die demnach ihre Lebenszeit nicht verändern. Bei statischem Que-
ning beobachtet man also
0
/
= 1 hingegen erwartet man bei dynamischem Quenching
0
/
= F
0
/F
.
Für den Fall das ein Fluorophor gleichzeitig statisch und dynamisch gequenscht wird, zu erkennen an
einer Krümmung des Stern-Volmer-Plots hin zur y-Achse, können wieder Lebenszeitmessungen genutzt
werden um K
D
zu bestimmen. Nach wie vor gillt
0
/
= 1 + K
D
. Zusätzlich kann K
D
auch über den
Stern-Volmer-Plot bestimmt werden mittels einer modizierten Stern-Volmer-Gleichung. Es gilt nun
F
0
F
= (1 + K
D
[Q])(1 + K
S
[Q])
(17)
= 1 + (K
D
+ K
S
)[Q] + K
D
K
S
[Q]
2
(18)
= 1 + K
App
[Q]
(19)
8
Details
- Seiten
- Erscheinungsform
- Originalausgabe
- Jahr
- 2012
- ISBN (eBook)
- 9783842848436
- Dateigröße
- 5.2 MB
- Sprache
- Deutsch
- Institution / Hochschule
- Freie Universität Berlin – Physik
- Erscheinungsdatum
- 2014 (April)
- Note
- 1,0
- Schlagworte
- fluoreszenz anisotropie mhc-ii tisa-laser
