Aufbau und Erprobung eines Messplatzes zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer von NIR- Farbstoffen

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Grundlagen
2.1 Fluoreszenz
2.2 Quantenausbeute und Fluoreszenzlebensdauer
2.3 Stokes´sche Verschiebung
2.4 Fluoreszenz-Anisotropie
2.5 Farbstoffe
2.5.1 Indocyaningrün (ICG)
2.5.2 Omocyanin (SF-64)
2.5.3 SIDAG
2.6 Messmethoden zur Fluoreszenzlebensdauerbestimmung
2.6.1 Messung im Zeitbereich
2.6.2 Messung im Frequenzbereich

3 Messaufbau
3.1 Femtosekundenlaser
3.2 Einzelphotonenzählung
3.3 Mikrokanalplattendetektor(MCP-PMT)
3.4 Messaufbau in der Fluoreszenzbox
3.5 Optische Bank
3.6 Interferenzfilter
3.7 Polarisations-Strahlteilerwürfel
3.8 Messprogramm „SPC_Control.vi“
3.9 Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer

4 Optimierung des Messaufbaus
4.1 SPC-Moduleinheit
4.1.1 Einstellung des Zero-Crossing-Levels des Constant Fraction Discriminators
4.1.2 Einstellung des Schwellenwertes des Constant Fraction Discriminators
4.2 Vergleichsmessungen für unterschiedliche Polarisatorstellungen –Überprüfung der Fluoreszenz-Anisotropie
4.3 Einfluss des Messortes innerhalb der Küvette auf das Messsignal
4.3.1 Responsemessungen
4.3.2 Messungen mit ICG
4.4 Einfluss der Blendenöffnung auf das Messsignal
4.4.1 Responsemessungen
4.4.2 Messungen mit ICG

5 Responsemessungen
5.1 Wasser
5.2 Ludox
5.3 Wasser-Albumin Gemisch
5.4 Ethanol
5.5 Resultat

6 Farbstoffmessungen
6.1 ICG
6.1.1 ICG gelöst in Wasser
6.1.2 ICG gelöst in einem Wasser-Albumin Gemisch
6.1.3 ICG gelöst in Ethanol
6.2 Omocyanin (SF-64)
6.2.1 SF-64 gelöst in Wasser
6.3 SIDAG
6.3.1 SIDAG gelöst in Wasser
6.4 Diskussion

7 Zusammenfassung und Ausblick

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Literaturverzeichnis

Danksagung

1 Einleitung

Cyaninfarbstoffe, wie Indocyaningrün, Omocyanin und SIDAG, finden eine große Anwendung als optische Marker in Bereichen der medizinischen Diagnostik. So zum Beispiel in der Ophthalmologie als Kontrastmittel zur Darstellung des Augenhintergrundes. In der Forschung werden ICG wie auch Omocyanin zur Diagnose und Früherkennung von Brusttumoren eingesetzt. Der Farbstoff SIDAG wird ausschließlich in Tierversuchen verwendet. Die Arbeitsgruppe 8.31 „Gewebeoptik und molekulare Bildgebung“ der Physikalisch Technischen Bundesanstalt (PTB) beschäftigt sich seit mehreren Jahren mit der fluoreszenzgestützen Laserimpuls-Mammografie. Bei diesem Verfahren wird der fluoreszierende Farbstoff intravenös in die Blutbahn gegeben. Durch Bestrahlung der Brust mit einem gepulsten Laser werden diese Farbstoffe angeregt und die anschließende Fluoreszenzemission gemessen. Wenn der Farbstoff sich vorranging im Karzinom anreichert, so können Bereiche mit erhöhter Fluoreszenz auf bösartige Läsionen hinweisen. Der Vorteil dieser Farbstoffe ist, dass diese bei Wellenlängen um die 750 nm - 810 nm ihre Absorptionsmaxima aufweisen. Genau in diesem Wellenlängenbereich weist wiederum menschliches Gewebe eine geringe Absorption auf, wodurch hohe Eindringtiefen erreicht werden können. Die Emissionsmaxima der Farbstoffe liegen je nach Farbstoff im Bereich zwischen 780 nm - 830 nm.

Neben den Fluoreszenzintensitäten, welche von der Farbstoffkonzentration wie auch von der Temperatur abhängig sind, kann auch die Fluoreszenzlebensdauer, welche eine wichtige Eigenschaft von Farbstoffen ist, gemessen werden. Diese gibt Informationen über das umliegende Gewebe und ist dabei konzentrationsunabhängig. Sie ist somit nur von den Stoffeigenschaften des Gewebes, in welchem der Farbstoff gelöst ist, abhängig. Dadurch können Fluoreszenzlebensdauermessungen Aussagen über die chemischen Eigenschaften des umliegenden Gewebes geben (pH-Wert, Sauerstoffsättigung, Polarität etc.). Dabei weist die Fluoreszenzlebensdauer eine hohe Empfindlichkeit auf und reduziert so das Signal-Rausch Verhältnis. Ein Vorteil ist auch, dass die Messungen der Fluoreszenzlebensdauer nicht so stark von den Streueffekten beeinflusst werden, wie es bei Messungen von Fluoreszenzintensitäten der Fall ist [Akers et al.2008].

Eine Möglichkeit zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer bietet die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Messplatz zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauern von NIR- Farbstoffen aufgebaut und getestet. Nach dem Aufbau wurden alle zur Messung beitragenden Komponenten hinsichtlich der Zeitauflösung optimiert (Kapitel 4). Mithilfe einer Einzelphotonenzählungseinheit konnte das Fluoreszenzsignal mit hoher Zeitauflösung gemessen und ausgewertet werden. Zum Anpassen des gemessenen Zeitverlaufs an die Theoriekurve wurden mit Hilfe des Programms Matlab exponentielle Fits durchgeführt. Zum Fitten der Messkurven wurde die Impulsantwortfunktion (Response) des Messsystems benötigt. Diese gibt Informationen über den zeitlichen Versatz, der durch den Messaufbau und die damit verbundenen Techniken entsteht. Zur Messung der Response wurde anstatt des Farbstoffs ein streuendes Medium als Probe verwendet. Es wurden unterschiedliche Lösungsmittel dafür verwendet und untereinander verglichen (Kapitel 5). Anschließend wurden Lebensdauermessungen von drei Farbstoffen, gelöst in unterschiedlichen Flüssigkeiten, durchgeführt (Kapitel 6). Diese waren Indocyaningrün, Omocyanin und SIDAG.

2 Grundlagen

Dieses Kapitel soll einen Einblick in die Theorie der Fluoreszenz und die damit verbundenen Eigenschaften geben. Zusätzlich wird noch auf Messmethoden zur Bestimmung von Fluoreszenzlebensdauern wie auch auf fluoreszierende Kontrastmittel, die bei in vivo Messungen benutzt werden, eingegangen.

2.1 Fluoreszenz

Der Fluoreszenzprozess ist ein Vorgang bei dem ein Molekül oder Atom von einem angeregten Zustand in einen energetisch günstigeren Zustand übergeht. Die dabei freiwerdende Energie kann die Emission eines Photons zur Folge haben. Im Gegensatz zur Phosphoreszenz erfolgen dabei die Übergänge zwischen Zuständen, deren Spins die gleiche Orientierung haben. Meist tritt Fluoreszenz in Molekülen auf.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2 . 1 Jablonski-Diagramm, welches den Fluoreszenz- und Phosphoreszenzvorgang beschreibt. In den elektronischen Zuständen S0 und S1 (Singulettzustände) haben die Elektronenpaare im Gegensatz zum Triplettzustand T1 unterschiedliche Spinorientierungen. (ISC = Inter System Crossing und IC = Internal Conversion)

Die Anregung des Fluorophors erfolgt durch die Absorption eines Photons mit der Energie E=h*fex (schwarzer Pfeil). Der Fluorophor geht daraufhin in einen höheren elektronischen Zustand (S1) über.

Die elektronischen Niveaus (S0, S1) unterteilen sich jeweils in Vibrationszustände und den dazwischen befindlichen Rotationszuständen. Diese entstehen durch die Vibration der Atomkerne bzw. die Rotation des Moleküls. Nach der Anregung kann sich der Fluorophor in einem beliebigen Vibrations-Rotationszustand befinden. Dieser Zustand ist allerdings sehr instabil, so dass sich der Fluorophor innerhalb von wenigen Picosekunden strahlungslos auf das unterste Vibrations-Rotationsniveau von S1 abregt.

Von hier aus erfolgt unter Emission des Fluoreszenzphotons der Übergang in einen unteren Vibrations-Rotationszustand des elektronischen Grundzustandes S0. Durch die geringere Energiedifferenz im Vergleich zum Anregungsvorgang ist die Wellenlänge größer als zuvor. Somit findet eine Verschiebung des Emissionsspektrums zum Absorptionsspektrum statt (Stokes-Verschiebung, siehe Kapitel 2.3).

Neben der Emission eines Fluoreszenzphotons kann es auch zu strahlungslosen Übergängen kommen. Dabei findet ein Übergang von einem niedrigen Vibrations-Rotationszustand von S1 zu einem hohen Vibrations-Rotationszustand des Grundzustandes S0 statt. Diesen Vorgang bezeichnet man als interne Umwandlung (IC = I nternal C onversion) [Lakowicz, Seite 5].

Nach der Anregung mittels einer gepulsten Lichtquelle befindet sich eine gewisse Anzahl (n0) an Fluorophoren im angeregten Zustand. Diese kehren mit der Rate Γ+knr in den Grundzustand zurück, wobei Γ der Anteil der strahlenden Übergänge ist und knr den Anteil der Fluorophore beschreibt, die strahlungslos in den Grundzustand übergehen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Da die Intensität proportional zur Anzahl n der angeregten Fluorophore ist, lässt sich der zeitliche Verlauf eines Fluoreszenzsignals nach seiner Anregung somit durch eine Exponentialfunktion beschreiben:

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Dabei ist I die Intensität des Fluoreszenzsignales und τ die Fluoreszenzlebensdauer .

Konkurrierend zur Fluoreszenz steht die Phosphoreszenz. Hierbei findet ein strahlungsloser Übergang von einem Singulettzustand (S) zu einem Triplettzustand (T) statt (ISC = I nter S ystem C rossing) [Lakowicz, Seite 5]. Durch den Übergang in einen „verbotenen Zustand“ ist dieser Prozess relativ langlebig (Millisekunden bis Stunden). Verbotener Zustand bedeutet hierbei ein Zustand, der im Vergleich zu anderen Zuständen im gleichen System gar nicht oder nur sehr selten auftritt. Von hier aus kann wiederum unter Emission eines Photons ein Übergang auf den untersten Zustand von S0 erfolgen. Es kann, ebenso wie bei der Fluoreszenz, zu strahlungslosen Übergängen kommen (IC) [Lakowicz, Seite 5].

2.2 Quantenausbeute und Fluoreszenzlebensdauer

Die Quantenausbeute Q gibt das Verhältnis zwischen der Anzahl der emittierten Photonen und der Anzahl der absorbierten Photonen an und ist somit immer kleiner als 1. Die Anzahl der absorbierten Photonen erhält man aus der Summe der Fluorophore, die Strahlung emittieren (Γ), und aus denen, die strahlungslos in den Grundzustand übergehen (knr). Das „nr“ im Index steht für nonradiative, also strahlungslos [Lakowicz, Seite 9]. Die Anzahl der Photonen bezieht sich immer auf eine bestimmte Zeiteinheit. Somit lässt sich die Quantenausbeute Q wie folgt beschreiben:

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Abb. 2 . 2 Vereinfachtes Jablonski-Diagramm zur besseren Darstellung der Bedeutung von Quantenausbeute und Fluoreszenzlebensdauer.

Die Fluoreszenzlebensdauer τ gibt die mittlere Zeit an, in der das Molekül in den untersten Vibrations-Rotationszustand des Singulettzustandes S1 zurückkehrt. Sie lässt sich rechnerisch leicht aus dem zeitlichen Intensitätsverlauf (2.3) bestimmen. Ebenfalls lässt sie sich auch über Γ und knr bestimmen:

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Bei einem einfachen exponentiellen Abfall, wie in Gleichung 2.3 dargestellt, heißt das, dass 63% der Moleküle bis zum Zeitpunkt t = τ Photonen emittiert haben. Rund 37% tun dies in der Zeit t>τ.

Zusätzlich zur Fluoreszenzlebensdauer τ spricht man ebenfalls von der intrinsischen oder auch natürlichen Lebensdauer τn. Diese berücksichtigt nur die strahlenden Prozesse, so dass der nicht strahlende Anteil knr in Gleichung 2.5 verschwindet [Lakowicz, Seite 9].

Somit lässt sich die natürliche Fluoreszenzlebensdauer auch durch die Quantenausbeute ausdrücken.

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Gleiches gilt auch für die allgemeine Fluoreszenzslebensdauer. Durch Umstellen und Kombinieren der Gleichungen 2.4 und 2.5 erhält man:

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Die Fluoreszenzlebensdauer von Farbstoffen ist zudem abhängig von ihrer chemischen Umgebung [Lakowicz, Seite 741]. Dieser Effekt wird bei der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM- f luorescence l ifetime im aging) ausgenutzt.

2.3 Stokes´sche Verschiebung

Die Verschiebung des Emissionsspektrums zum Absorptionsspektrum in einen langwelligeren Bereich resultiert aus der Energiedifferenz bei der Relaxation im angeregten Zustand S1, die strahlungslos erfolgt. Dadurch ist die Energie des emittierten Lichtquants kleiner als die des absorbierten und besitzt somit eine größere Wellenlänge. Anschaulich ist dies in Abb. 2.2 dargestellt. Die y-Achse stellt dabei die Energiedifferenz dar. Der Betrag des schwarzen Pfeiles (absorbiertes Licht) ist größer als der des emittierten (roter Pfeil). Als Stokes-Shift (Stokes-Verschiebung) bezeichnet man den Abstand der Maxima vom Absorption- und Emissionsspektrum [Lakowicz, Seite 5-6]. Auffällig ist, dass Absorption- und Emissionsspektrum eine ähnliche Form bezüglich einer Spiegelung auf der Wellenlängenachse aufweisen (siehe Abb. 2.3).

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Abb. 2 . 3 [Lakowicz, Seite 8] Absorptions- und Emissionsspektrum sind symbolisch dargestellt. Im unteren Teil sind die einzelnen elektronischen Zustände mit den jeweiligen Vibrationsniveaus zu erkennen. Die Pfeile stellen die möglichen Anregungsvorgänge dar und können im Spektrum einem Peak zugeordnet werden. Gleiches gilt für die Emissionsvorgänge, die durch die nach unten zeigenden Pfeile dargestellt sind.

Ein geringer Unterschied ist bei kleinen Wellenlängen im Absorptionsspektrum zu erkennen. Das liegt daran, dass diese Photonen eine höhere Energie besitzen und somit die Wahrscheinlichkeit besteht, dass diese in einen höheren angeregten Zustand (>S1) übergehen. Da die Emission des Fluoreszenzphotons beim Übergang von S1 zu S0 erfolgt, haben diese hohe Anregungsenergien jedoch den selben Fluoreszenzübergang wie Photonen niedrigerer Anregungsenergien [Lakowicz, Seite 7]. Ebenfalls lassen sich in beiden Spektren markante Peaks erkennen. Diese entstehen durch die einzelnen Vibrations-Niveaus, die klar definierte Energie besitzen.

2.4 Fluoreszenz-Anisotropie

Die Orientierungen der einzelnen Fluorophore in einer isotropen Lösung sind zufällig ausgerichtet. Fluorophore absorbieren bevorzugt Photonen, deren elektrischer Vektor annähernd parallel zu der Orientierung der Fluorophore ist [Becker&Hickl, Seite 178]. Da es sich bei der Anregungsquelle um polarisiertes Licht handelt, werden also die Fluorophore besonders stark angeregt, deren Orientierung der des Lasers entspricht. Kurz nach der Anregung ist deshalb die Fluoreszenz teilweise polarisiert und somit anisotrop [Becker&Hickl, Seite 178]. Durch die Rotation der Fluoreszenzmoleküle nimmt die Anisotropie der Fluoreszenz ab. Dies geschieht in einem Zeitraum von ca. 100 ps [Becker&Hickl, Seite 178]. Somit ist das emittierte Fluoreszenzlicht nicht mehr polarisiert und hat dadurch auch Einfluss auf die gemessene Fluoreszenzlebensdauer. Die Anisotropie der Fluoreszenz ist unabhängig von der Konzentration der Probe [Lakowicz, Seite 354].

Um den Einfluss der Rotation der Fluoreszenzmoleküle zu unterdrücken muss ein Signal, welches proportional zur Intensität I=Ip+2Is ist, gemessen werden. Ip und Is sind die Intensitäten des elektrischen Feldvektors (Hierbei sei Ip die Intensität parallel zum Laserstrahl und Is die Intensität senkrecht zum Laserstrahl). Dies erreicht man mit Hilfe eines Polarisators, der unter einem „magischen Winkel“ von 54,7° gegenüber der Polarisation des Lasers im Strahlengang angeordnet ist [Becker&Hickl, Seite 179, Lakowicz, Seite 364]. Dies soll nun an einer theoretischen Überlegung erläutert werden:

Wird eine Probe, die ein Fluoreszenzmittel gelöst in einer isotropen Lösung enthält, durch einen Laser angeregt, so kann die Fluoreszenz unter verschiedenen Polarisationsrichtungen gemessen werden. Diese zwei Intensitäten können an jeder Achse im Raum, mit Hilfe eines Polarisators der einmal parallel und einmal senkrecht zur Polarisation des Lasers angeordnet ist, gemessen werden. Da in dem in Abb. 2.4. gezeigtem Beispiel das Molekül entlang der y-Achse symmetrisch angeordnet ist, liefert die Messung in y-Richtung zweimal Isy. Um den Einfluss der Rotation ignorieren zu können, müssen alle Komponenten mit der gleichen Intensität gemessen werden [Becker&Hickl, Seite 179].

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Abb. 2 . 4 [Becker&Hickl, Seite 179] Polarisationsmessungen des Fluoreszenzsignals. Gemessen wird entlang der x, y, und z-Achse.

Ipx = Ipz (für die parallelen Messungen) und

Isx = Isy = Isz (für die senkrechten Messungen)

Die Summe aller Intensitäten ergibt dann:

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Daraus resultiert, dass bei Signalen, die proportional zu Isum sind, die Rotationen der Moleküle keinen Einfluss auf das Messergebnis haben [Becker&Hickl, Seite 179].

2.5 Farbstoffe

Die in dieser Arbeit verwendeten Farbstoffe sind aus der Gruppe der Cyanine. Diese sind organische Farbstoffe aus der Gruppe der Polymethin-Farbstoffe. Ihnen gleich ist, dass sie aus einer Aneinanderreihung von Methingruppen (=CR_) bestehen, wobei R als Substituent von Farbstoff zu Farbstoff variieren kann [Johannes2000]. Als Farbstoff für die Laserimpuls-Mammografie wird ICG benutzt, da von den Cyaninfarbstoffen bisher nur dieser für die Anwendung am Menschen zugelassen ist.

2.5.1 Indocyaningrün (ICG)

Indocyaningrün ist ein fluoreszierender Farbstoff, der als Diagnostikum in der Medizin verwendet wird. Die Summenformel dieses pulverförmigen Stoffes lautet: C43H47N2NaO6S2. Besonders gut löslich ist ICG, dessen molare Masse 774,99 g/mol beträgt, in Wasser, Methanol und Ethanol. Die Stabilität hängt sowohl von der ICG Konzentration selbst und vom Lösungsmittel ab [Landsman et al.1976]. Das in dieser Arbeit verwendete ICG stammt von der Firma Pulsion, die zugleich Hersteller und Zulassungsinhaber für dieses Kontrastmittel in Deutschland ist.

Das Absorptionsspektrum wie auch das Emissionsspektrum liegen im Nahinfrarotbereich. Das Maximum der Absorption liegt je nach Lösungmittel zwischen 780 nm und 830 nm. Durch die geringe Stokes´sche Verschiebung muss bei Messungen stark darauf geachtet werden, dass das Anregungslicht gut unterdrückt wird, da das Emissionsspektrum sein Maximum bereits bei ca. 810 nm – 830 nm erreicht. Dieses Maximum ist abhängig von dem Medium, in dem das ICG gelöst ist. So ist das Emissionsmaximum im Blut bei ca. 830 nm zu finden, während es sich im Wasser bei ca. 810 nm befindet [Wipper].

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Abb. 2 . 5 [Gnoerrlich2011] Absorptions- und Emissionsspektrum einer 2µmol/l ICG-Konzentration in Wasser.

Durch die Überlappung der beiden Spektren kann es zusätzlich auch zur Reabsorption der Fluoreszenz kommen. Dabei wird ein Fluoreszenzphoton vom ICG selbst wieder absorbiert. Die Quantenausbeute von ICG in Wasser ist mit 0.01 relativ gering [Wipper]. Da das menschliche Gewebe bei einer Wellenlänge von 780 nm eine geringe Absorption und somit eine hohe Eindringtiefe aufweist und ICG in diesem Bereich sein Absorptionsmaximum hat, lässt sich dieses gut im menschlichen Körper detektieren [Vogel, Venugopalan 2003]. Das ICG wird dafür intravenös verabreicht und bindet sich in Folge sofort an die im Blut befindlichen Plasmaproteine [Prahl]. Es werden ca. 0,1 mg bis 0,3 mg pro kg Körpergewicht verabreicht [Pulsion].

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Abb. 2.6 [Vogel, Venugopalan 2003] Absorptionsspektrum von menschlichem Gewebe. Eine geringe Absorption ist im Bereich zwischen 600nm und 1300nm. Diesen Bereich bezeichnet man auch als therapeutisches Fenster.

Anschließend wird das Gewebe mit einem Laser geeigneter Wellenlänge bestrahlt und schließlich das emittierte Fluoreszenzlicht gemessen. Durch die Bindung an Plasmaproteine verbleibt das ICG kurzzeitig im Körper und wird anschließend über die Leber und Gallenwege aus dem Körper ausgeschieden [Wipper, Seite 18]. Die Anwendung von ICG für diagnostische Untersuchungen wird in vielen Bereichen verwendet. Hauptanwendungen sind dabei ophthalmologische Untersuchungen, Überwachung der Leber- bzw. Splanchnikusperfusion (nicht-invasiv) und Messungen zur Gewebeperfusion. Hinzu kommen die an der PTB durchgeführten Anwendungen zur Erkennung rheumatischer Erkrankungen und zur Detektion von Mammakarzinomen.

Da diese Arbeit in der Arbeitsgruppe der Laserimpuls-Mammografie entstand, wird auf das Verfahren der Detektion von malignen Mammakarzinomen näher eingegangen. Dabei verhält es sich so, dass Proteine, an denen nach Injektion das ICG gebunden ist, aus der Blutbahn austreten können, wenn die Durchlässigkeit der Gefäße hinreichend groß ist [Hagen et al.2009]. Bei gesundem Gewebe ist dies nicht der Fall. Scannt man die Brust mit einem Anregungslaser ab und misst dabei die entstehende Fluoreszenz, so können Bereiche mit erhöhtem Fluoreszenzsignal auf ein Karzinom hinweisen. Diese Methode kann ebenfalls zur Wächterlymphknotendetektion verwendet werden [Gnoerrlich 2011]. Dabei wird der sogenannte Wächterlymphknoten, welcher der am nächsten zum Karzinom liegende Lymphknoten ist, detektiert und zur Biopsie entfernt. Dieser wird auf eventuelle Streuung des Tumors untersucht. Ist dies der Fall müssen weitere Lymphknoten entfernt werden.

2.5.2 Omocyanin (SF-64)

Omocyanin (SF-64), von der Firma Bayer Schering, ist neben ICG ein fluoreszierender Farbstoff, der auch für die Laserimpuls-Mammografie benutzt wurde. Das Emissionsmaximum von SF-64 liegt mit 780 nm etwas niedriger als bei ICG (siehe Abb. 2.6). Die maximale Absorption findet bei ca. 750 nm statt. Die Quantenausbeute von SF-64 ist höher als beim ICG und liegt bei 0.1 [Ziegler, Seite 102]. Die molare Masse von SF-64 ist 836,9 g/mol und somit etwas höher als von ICG [Perlitz et al.2005].

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Abb. 2.7 [Perlitz et al.2005] Absorptions- und Emissionsspektrum von Omocyanin (SF64).

2.5.3 SIDAG

Der Farbstoff SIDAG, ebenfalls von der Firma Bayer Schering entwickelt, zeigt bezüglich des Absorptions- und Emissionsspektrums ähnliche Eigenschaften wie SF-64 [Perlitz et al.2005]. Seine molare Masse ist mit 1089,2 g/mol allerdings deutlich höher. Die Quantenausbeute von SIDAG ist mit 0,065 niedriger als SF-64, jedoch immer noch höher als bei ICG [Perlitz et al.2005].

2.6 Messmethoden zur Fluoreszenzlebensdauerbestimmung

Es gibt allgemein zwei verschiedene Methoden, um die Fluoreszenzlebensdauer von Farbstoffen zu bestimmen. Diese lassen sich unterteilen in Messungen im Zeitbereich und Messungen im Frequenzbereich.

2.6.1 Messung im Zeitbereich

Untersuchungen im Zeitbereich werden mit Hilfe von kurzen Laserimpulsen durchgeführt. Die beiden gängigsten Methoden zur Messung im Zeitbereich sind die Filter-basierende Methode und die Monochromator-basierende Methode [Becker&Hickl].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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Abb. 2 . 8 [Becker&Hickl] Oben: Monochromator-basierende Methode, Unten: Filter-basierende Methode

In beiden Methoden wird zunächst der gepulste Laserstrahl aufgeteilt, wobei ein Teil an eine Triggerdiode weitergeleitet wird. Diese erstellt ein elektrisches Triggersignal, welches für die Einzelphotonenzählung erforderlich ist (siehe dazu Kapitel 3.2). Der andere Teil wird im Folgenden durch einen Intensitätsfilter abgeschwächt und senkrecht auf die Küvette, in der sich die zu untersuchende Lösung befindet, eingestrahlt. Falls erforderlich, wird der Laserstrahl vorher noch durch einen Polarisator geleitet, um lineare Polarisation der Anregungsstrahlung zu gewährleisten. Im Winkel von 90° wird dann die Fluoreszenz beobachtet. Dazu wird das Fluoreszenzsignal mit Hilfe einer Sammellinse kollimiert, um einen parallelen Strahlengang zu erreichen.

Der Brennpunkt der Sammellinse befindet sich dabei in der Küvettenmitte um den Strahl parallel aufzuweiten. Im weiteren Strahlenverlauf wird mit Hilfe eines Interferenzfilters die ungewünschte Laserstrahlung, die durch Streuung in der Küvette in Richtung des Detektors gelangt, unterdrückt. Zur Kompensation der Anisotropie (vgl. Kapitel 2.4) folgt ein um 54,7° gedrehter Polarisator.

In der Filter-basierenden Methode wird der parallele Strahlengang auf eine Blende fokussiert, die sich kurz vor der Öffnung des Mikrokanalplattendetektors (MCP-PMT, vgl. Kapitel 3.3) befindet. Bei der Monochromator-basierenden Methode hingegen wird das Fluoreszenzsignal mit Hilfe des Monochromators spektral selektiert und an den MCP-PMT weitergeleitet. Hierzu wird die Sammellinse so positioniert, dass der hintere Brennpunkt genau auf den Eingangsspalt des Monochromators abgebildet wird. Ein Vorteil der Monochromator-basierenden Methode ist es, dass hierbei jede einzelne Wellenlänge herausgefiltert und untersucht werden kann. Im Gegensatz dazu wird bei der Filter-basierenden Methode ein spektraler Bereich, der mit dem Interferenzfilter festgelegt wird, beobachtet. In dieser Arbeit wird ausschließlich die Filter-basierende Methode angewendet. Dabei ist anzumerken, dass sich der Aufbau leicht von dem eben beschriebenen unterscheidet. Nähere Erläuterung sind dem Kapitel 3 zu entnehmen.

2.6.2 Messung im Frequenzbereich

Bei dieser Messmethode wird die Probe nicht mit einer gepulsten Lichtquelle, sondern mit hochfrequentem intensitätsmoduliertem Licht angeregt. Somit ist das entstehende Fluoreszenzlicht ebenfalls mit gleicher Frequenz intensitätsmoduliert. Jedoch tritt eine Zeitverschiebung des Fluoreszenzsignales gegenüber der Anregung auf. Diese entsteht durch die Verweildauer der Fluorophore im angeregten Zustand und ist somit abhängig von der Fluoreszenzlebensdauer τ. Diese äußert sich durch eine Phasenverschiebung Φ. Aus dieser Phasenverschiebung lässt sich die Fluoreszenzlebensdauer mithilfe von Gleichung 2.9 bestimmen [Lakowicz].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

ω Modulationsfrequenz

Φω Phasenverschiebung mit ω als Modulationsfrequenz

Die Fluoreszenzlebensdauer kann auch aus dem Modulationskontrast zwischen Anregungslicht und Fluoreszenz bestimmt werden [Lakowicz]. Aufgrund der Intensitätsabnahme des Fluoreszenzlichtes (siehe Kapitel 2.1) wird die Amplitude geschwächt.

Vergleicht man beide Intensitäten wie in Abb. 2.9 erhält man die Fluoreszenzlebensdauer τ durch die Formel 2.10.

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Abb. 2.9 [Lakowicz, Seite 159] Prinzip der Messmethode im Frequenzbereich. Die Phasenverschiebung Φ und der Modulationkontrast m sind an einem Beispiel dargestellt.

Der optische Strahlengang bei dieser Messmethode unterscheidet sich kaum von der Vorhergehenden. Es wird ebenfalls ein Referenzsignal von der Lichtquelle abgezweigt welches als Triggersignal dient.

3 Messaufbau

Der Messaufbau zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauern von verschiedenen NIR-Farbstoffen, mittels Filter-basierender Methode, besteht aus folgenden Hauptkomponenten:

i. Femtosekundenlaser als Lichtquelle

ii. Photodiode als Triggersignal für die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC)

iii. Küvette mit dem zu untersuchenden Farbstoff

iv. Optisches System zum Fokussieren und Bearbeiten des Fluoreszenzsignales

v. Mikrokanalplatten-Photomultiplier (MCP-PMT) zur Detektion und Verstärkung des Fluoreszenzsignales

vi. PC mit TCSPC-Moduleinheit

Um den Versuchsaufbau möglichst lichtdicht abzuschirmen wurden die Elemente iii. und iv. in einer Fluoreszenzbox untergebracht.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3 . 1 Teil des Messaufbaus zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauern von NIR-Farbstoffen.

Links: Fluoreszenzbox und der Mikrokanalplatten-Photomultiplier (MCP-PMT), Rechts: Aufbau innerhalb der Fluoreszenzbox.

Zwischen der Fluoreszenzbox und dem MCP-PMT befindet sich ein Vorbau des Detektors, in dem noch zusätzliche optische Elemente eingefügt werden können.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3.2 Schematischer Messaufbau der Filter basierten Messmethode.

Der Aufbau ist ähnlich der in Kapitel 2.6.1 beschriebenen Filter-basierende Methode. Ein Unterschied besteht im optischen System. Es wurde hier zusätzlich eine Blende eingefügt. Die dort enstandene Zwischenabbildung wird durch die letzte Sammellinse kollimiert, wo sich dann im Anschluss Interferenz- und Intensitätsfilter befinden. Somit gelangt das Messsignal parallel in den MCP-PMT.

3.1 Femtosekundenlaser

Das in dieser Arbeit verwendete Lasersystem Mai-Tai von der Firma Newport, besteht aus zwei Lasern; dem diodengepumpten Festkörperlaser und dem gepulsten modengekoppelten Titan-Saphir- Laser. Es können Wellenlängen zwischen 710 nm und 990 nm eingestellt werden. Seine maximale Leistung erreicht der Laser bei ca. 800 nm mit einer Ausgangsleistung von rund 1,9 W [Spectra Physics]. Damit ist der Laser der Laserklasse 4 zugehörig.

Zur Anregung des gepulsten Lasers dient der diodengepumpte Festkörperlaser. Dieser besitzt als aktives Medium einen Yttrium-Vanadat-Kristall, der mit Neodym-Ionen (Nd3+) dotiert ist. Der Laser emittiert Photonen am wahrscheinlichsten bei 1064 nm und ist bei Raumtemperatur am stabilsten [Spectra Physics]. Um den zweiten Laser anregen zu können, müssen diese Photonen jedoch eine Wellenlänge besitzen, die im Absorptionsspektrum des Titan-Saphir Lasers liegen. Das Absorptionsspektrum liegt im sichtbaren Bereich.

Durch Frequenzverdopplung in einem Lithiumboratkristall wird die emittierte Strahlung des ersten Lasers in Strahlung von 532 nm umgewandelt [Spectra Physics].

Das aktive Medium des gepulsten modengekoppelten Titan-Saphir- Laser ist ein mit Titanionen (Ti3+) dotierter Saphirkristall. Sein Absorptionsspektrum befindet sich im sichtbaren Bereich zwischen 400 nm - 600 nm und sein Emissionsspektrum bei 670 nm – 1070 nm. Dieser Laser beruht, wie auch der Erste, auf dem 4-Niveau Prinzip, welches in Abb. 3.3 dargestellt ist.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3 . 3 Links: 4-Niveau Laserprinzip. Rechts: Absorptions- und Emissionsspektrum des Titan-Saphir-Kristalls [Spectra Physics].

Zunächst wird durch optisches Pumpen das oberste Energieniveau (E3) der Titanionen bevölkert. Es kommt zum strahlungslosen Übergang (Relaxation), bei dem die gesamte Energie auf das langlebigere oberste Laserniveau (E2) gebracht wird. Anschließend findet der Laserübergang vom oberen zum unteren Laserniveau (E1) statt, der die Emission von Laserphotonen zur Folge hat. Von diesem Niveau aus erfolgt wieder eine strahlungslose Relaxation in den Grundzustand (E0). Um Pulse im Femtosekunden-Bereich zu erzeugen, kommt eine Kombination aus aktiver und passiver Modenkopplung zum Einsatz. Für die aktive Modenkopplung wird ein akustooptischer Modulator verwendet [Spectra Physics].

Dieser akustooptischer Modulator besteht aus einem Piezokristall, wie etwa Quarz. Durch Anlegen einer Wechselspannung entstehen Ultraschallwellen, die sich im Kristall als stehende Welle ausbreiten. Durch diese entstehen Änderungen im Brechungsindexes des Resonator [Paschotta]. Die Frequenz der stehenden Wellen entspricht der doppelten Frequenz der angelegten Wechselspannung (ω). Die stehende Welle erzeugt im Kristall ein Beugungsgitter, an dem die Laserstrahlung im Resonator gebeugt und abgelenkt wird [Paschotta]. Beträgt der Spannungswert zu einem bestimmten Zeitpunkt U = 0 V, so verschwindet das Beugungsgitter im Kristall für einen Moment und der Strahl kann den Kristall ungehindert passieren.

[...]