Identifizierung und Nachweis von immunreaktiven Proteinen in unterschiedlichen Sorten der äthiopischen Kulturhirse Eragrostis tef

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Nahrungsmittelallergie und Nahrungsmittelintoleranz
1.1.1 Prävalenz von Nahrungsmittelunverträglichkeiten
1.1.2 Einteilung von Nahrungsmittelunverträglichkeiten
1.2 Zöliakie
1.2.1 Definition
1.2.2 Prävalenz
1.2.3 Verlaufsformen und Zöliakie-assoziierte Erkrankungen
1.2.4 Pathogenese
1.2.4.1 Genetische und mikrobielle Faktoren
1.2.4.2 Gluten und toxische Glutenpeptide
1.2.4.3 Transglutaminasen
1.2.4.4 Pathomechanismus
1.2.5 Zöliakie-Diagnostik
1.2.6 Nachweis von Gluten in Lebensmitteln
1.3 Weizenallergie
1.3.1 Epidemiologie und Klinik
1.3.2 Allergene
1.3.3 Weizenallergie-Diagnostik
1.4 Eragrostis tef
Zielsetzung der Diplomarbeit

2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
2.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien
2.1.3 Kits
2.1.4 Enzyme
2.1.5 Antikörper
2.1.6 Peptide und Proteine
2.1.7 Seren
2.2 Proteinbiochemische Methoden
2.2.1 Extraktion von Gluten aus Mehl
2.2.2 Proteinextraktion aus Getreide mittels P-PER® Plant Protein Extraction Kit
2.2.3 Proteinbestimmung
2.2.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
2.2.5 Coomassie-Färbung
2.2.6 Western Blot
2.2.7 Immundetektion
2.2.8 Modifikation immobilisierter Proteine mit Transglutaminase
2.2.9 Dot Blot
2.2.10 Affinitätsreinigung von Antikörpern im Mikrotiterformat
2.2.11 ELISA
2.3 Lateral Flow Assay Entwicklung
2.3.1 Antikörperaufreinigung über UltraLink® Iodoacetyl Gel
2.3.2 Antikörperaufreinigung über Protein A Plus Agarose
2.3.3 Antikörper-Gold-Konjugation
2.3.3.1 Bestimmung des Bindungsverhaltens der Antikörper an Goldpartikel
2.3.4 Aufbau eines Lateral Flow Teststreifens
2.3.5 Herstellung von Dipsticks
2.3.5.1 Dispensieren
2.3.5.2 Laminieren
2.3.5.3 Schneiden
2.3.6 Testlauf

3 Ergebnisse
3.1 Nachweis immunreaktiver Bestandteile zweier Teff-Sorten (Eragrostis tef) und Weizen (Triticum aestivum)
3.1.1 Reaktivität von Weizengliadin, Teff- und Weizenmehl auf alpha-Gliadin spezifische Antikörper
3.1.2 Reaktivität von Weizengliadin, Teff- und Weizenmehl gegenüber Anti-Glia1- und Anti-Glia2-Kaninchenseren
3.1.3 Reaktivität von Weizengliadin, Teff- und Weizenmehl auf Anti-Glia3 IgG positive Zöliakieseren
3.2 Extraktion der einzelnen Glutenfraktionen aus Teff- sowie Weizenmehl und Untersuchung bezüglich ihrer Immunreaktivität mit/ohne tTG-Modifikation
3.2.1 Vergleich verschiedener Weizenmehl- und Teffmehl-Fraktionen im Coomassie-Gel
3.2.2 Reaktivität der Weizen- und Teffmehl Proteinextrakte mit alpha-Gliadin spezifischen Antikörpern
3.2.3 Reaktivität der Weizen- und Teffmehl Proteinextrakte mit affinitätsgereinigten Anti-Glia1-bzw.Anti-Glia2-Antikörpern
3.2.4 Reaktivität der Weizen- und Teffmehl-Proteinextrakte mit Zöliakieseren
3.2.5 Reaktivität von Proteinextrakten aus Weizen- und Teffmehl auf affinitätsgereinigte Glia3 spezifische Antikörper
3.2.6 Reaktivität von Proteinextrakten aus Weizen- und Teffmehl auf Weizenallergikerseren
3.3 Untersuchung unterschiedlicher Teff-Sorten und Getreidearten bezüglich ihrer Immunreaktivität
3.3.1 Vergleich der Proteinbandenmuster verschiedener Teff-Sorten und Getreidearten mittels Coommassie-Gel-Analyse
3.3.2 Reaktivität der unterschiedlichen Teff-Sorten sowie der Kontrollgetreide auf affinitätsgereinigte Anti-Glia2-Antikörper
3.3.3 Reaktivität der verschiedenen Teff-Sorten und der Kontrollgetreide mit Zöliakieseren
3.3.4 Reaktivität der verschiedenen Teff-Sorten und der Kontrollgetreide auf Weizenallergikerseren
3.4 Lateral Flow Assay Entwicklung
3.4.1 Affinitätschromatographie von Anti-Glia1/2-Antikörpern
3.4.2 Bindungsverhalten der Anti-Glia-Antikörper an Goldpartikel
3.4.3 Erster Testlauf mit Dipsticks
3.4.4 Vergleich unterschiedlicher Pufferzusätze im Dipstick-Testsystem zur Reduktion unspezifischer Bindungen
3.4.5 Sensitivitätsbestimmung des Dipstick-Testsystems auf Weizengliadin

4 Diskussion
4.1 Variabilität der Proteinzusammensetzung in Eragrostis tef sowie der Vergleich mit anderen Getreidearten
4.2 Immunreaktive Bestandteile in Eragrostis tef und anderen Getreidearten
4.3 Der Einfluss von Transglutaminase auf die Immunreaktivität von Eragrostis tef sowie anderen Getreidearten und dessen Relevanz auf die Lebensmittelindustrie
4.4 Bedeutung der Ergebnisse für Zöliakie-Patienten sowie Weizenallergiker
4.5 Entwicklung eines Lateral Flow Assay für den Nachweis von Gluten

5 Zusammenfassung

Literaturverzeichnis

Anhang
Anhang A.1 Getreideliste
Anhang B.1 Sequenzhomologien des Glia1-Peptids
Anhang B.2 Sequenzhomologien des Glia2-Peptids

Eidesstattliche Erklärung

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

Die Nahrungsaufnahme von Getreide, insbesondere Weizen, verursacht bei ca. 1 % der Bevölkerung eine Unverträglichkeitsreaktion in Form einer Zöliakie (Glutenintoleranz) sowie bei weniger als 0,5 % eine allergische Sofortreaktion.

Das äthiopische Urgetreide Eragrostis tef, umgangssprachlich Teff , ist im Hinblick auf seine Verträglichkeit bisher wenig untersucht. Derzeitig wird es auf dem Lebensmittelmarkt als „glutenfrei“ deklariert und infolgedessen als diätisches Nahrungsmittel für Zöliakie-Patienten angeboten.

1.1 Nahrungsmittelallergie und Nahrungsmittelintoleranz

1.1.1 Prävalenz von Nahrungsmittelunverträglichkeiten

Die Unverträglichkeit von Nahrungsmitteln ist weltweit ein verbreitetes und ansteigendes Problem – vor allem in der westlichen Welt. In Europa leiden bis zu 1 % der Erwachsenen und bis zu 4 % der Kinder an einer Nahrungsmittelallergie [Mills et al. 2007]. Dabei sind einige Lebensmittel besonders prädisponiert für eine Allergie, wobei auch die Ernährungsgewohnheiten der verschiedenen Länder eine Rolle spielen. In Deutschland treten vor allem Allergien gegen Kuhmilch und Hühnerei auf, ferner reagieren Kinder vermehrt auf Weizen. In den USA sind dagegen Allergien gegen Erdnüsse verbreiteter.

Ein größerer Anteil der Bevölkerung, etwa 20 %, ist von einer Nahrungsmittelintoleranz betroffen [Mills et al. 2007]. Zu den bekanntesten Nahrungsmittelintoleranzen zählen die Laktose-Intoleranz, die Histamin-Intoleranz sowie die Fruktose-Malabsorption.

1.1.2 Einteilung von Nahrungsmittelunverträglichkeiten

Bei einer Nahrungsmittelallergie handelt es sich um eine durch immunologische Mechanismen hervorgerufene Überempfindlichkeitsreaktion auf bestimmte Nahrungsmittelbestandteile – meist Proteine. Sie kann Antikörper- oder Zell-vermittelt sein. Die bei der „klassischen“ Allergie des Typ I gebildeten IgE-Antikörper aktivieren die Mastzellen, welche verschiedene Entzündungsmediatoren freisetzen, wie z. B. Histamin. Bereits geringste Mengen des Allergens können die Immunreaktion auslösen.

Nahrungsmittelintoleranzen können durch bestimmte Nahrungsmittelbestandteile Reaktionen im Körper hervorrufen, die einer allergischen Reaktion ähneln. Aufgrund dessen spricht man auch von einer „Pseudo-Allergie“. Die Histaminfreisetzung aus den Mastzellen wird jedoch direkt über die Nahrungsbestandteile und nicht über Antikörper ausgelöst. Bei einer „klassischen Unverträglichkeit“ liegt die Ursache an einem Enzymdefekt oder -mangel, der bedingt, dass spezifische Nahrungsmittel, wie z. B. Laktose, nicht verdaut werden können. Auch Organerkrankungen können durch eine ausgelöste Malabsorption zu einer Nahrungsmittelunverträglichkeit führen. Im Gegensatz zur „klassischen“ Allergie muss keine vorangehende Immunisierung stattfinden, Reaktionen können bereits beim Erstkontakt auftreten. Ein weiterer Unterschied zur Allergie zeigt sich in der Dosisabhängigkeit der Symptome. Die Tabelle Tab. 1.1 liefert einen Überblick über wesentliche Unterschiede der „klassischen“ Nahrungsmittelallergie und der Nahrungsmittelintoleranz.

Tab. 1.1: Überblick der wesentlichen Unterschiede der „klassischen“ Nahrungsmittelallergie und der Nahrungsmittelintoleranz.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Terminologie für die Charakterisierung einer Nahrungsmittelallergie und einer Nahrungsmittelunverträglichkeit ist teilweise nicht ganz eindeutig. Die European Academy of Allergology and Clinical Immunology (EAACI) empfahl daher 1995 eine Klassifikation auf der Grundlage der Pathomechanismen [Bruijnzeel-Koomen et al. 1995] (Abb. 1.1). Die erste Einteilung besteht zwischen toxischen und nicht toxischen Reaktionen, wobei die Nahrungsmittelallergie und -intoleranz den nicht-toxischen Reaktionen zuzuordnen sind. Diese sind im Gegensatz zu der toxischen Reaktion abhängig von der individuellen Empfindlichkeit auf einen bestimmten Nahrungsmittelbestandteil. Des Weiteren erfolgt eine Klassifikation in Nahrungsmittelallergie, wenn die Reaktion immunologisch vermittelt ist (IgE- oder nicht-IgE vermittelt), und in Nahrungsmittelintoleranz, wenn die Reaktion nicht immunologisch vermittelt ist. Die Nahrungsmittelintoleranz kann differenziert werden in: enzymatisch bedingte Intoleranz (z. B. Laktoseintoleranz) oder Intoleranz durch Störung des Transportsystems (z. B. Fruktoseintoleranz durch genetische Mutation des Darmtransportes), pharmakologische Intoleranz (z. B. Histaminintoleranz) und idiopathische sowie undefinierte Intoleranz (z. B. Reaktionen auf Zusatzstoffe) [Montalto et al. 2008].

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Abb. 1.1: Klassifikation der unerwünschten Reaktionen auf Nahrungsmittel nach EAACI.

Die Zöliakie zählt auf Grund des Auftretens hochspezifischer Autoantikörper gegen Gewebstransglutaminase zu den Autoimmunerkrankungen. Abzugrenzen von der Zöliakie ist die Glutensensitivität, welche dieselben Symptome zeigt, aber keine Autoantikörper gegen Gewebstransglutaminase aufweist.

1.2 Zöliakie

1.2.1 Definition

Bei der Zöliakie handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung, die auf einer lebenslangen Unverträglichkeit gegen das Klebereiweiß Gluten beruht. Tritt die Erkrankung erstmalig im Erwachsenalter auf, spricht man von einheimischer Sprue. Die Zufuhr von Gluten, welches hauptsächlich in Weizen und verwandten Getreiden wie z. B. Dinkel, Roggen und Gerste enthalten ist, bewirkt im Darm eine Entzündung und Zerstörung der Dünndarmzotten. Dies kann die durch eine Malabsorption bedingten typischen Symptome wie Durchfall und Gewichtsverlust hervorrufen. Nach glutenfreier Ernährung kommt es in der Regel zu einer Rückbildung der strukturellen Veränderungen des Dünndarms. Die Einhaltung einer glutenfreien Diät stellt momentan die einzige Möglichkeit einer Behandlung dar.

1.2.2 Prävalenz

Die Zöliakie zählt mittlerweile zu den größten Nahrungsmittelunverträglichkeiten weltweit. In den letzten Jahren wurde durch einige Studien belegt, dass die Prävalenz deutlich höher ist, als bisher angenommen. Ging man früher davon aus, dass weniger als 0,1 % der Bevölkerung von der Erkrankung betroffen sind, belegen die neuesten Untersuchungen Prävalenzdaten von ca. 1 % [Tommasini et al. 2004; Dube et al. 2005] bis sogar 2 % [Lohi et al. 2007]. Eine finnische Studie zeigt, dass sich die Prävalenz in diesem Land in den letzten zwei Jahrzehnten verdoppelt hat [Lohi et al. 2007]. Als Ursache werden u. a. Umweltfaktoren wie wirtschaftlicher Status und hygienische Bedingungen angenommen [Kondrashova rt al. 2008]. Frauen sind mit einer Rate von 3:1 häufiger von Zöliakie betroffen als Männer [Green et al. 2001]

1.2.3 Verlaufsformen und Zöliakie-assoziierte Erkrankungen

Die klinische Ausprägung der Zöliakie reicht von asymptomatischen oder milden bis hin zu schweren Verlaufsformen mit Diarrhöe, Flatulenz und Gewichtsverlust bzw. körperlicher Entwicklungsstörung im Kindesalter. In Abhängigkeit von der klinischen Symptomatik können verschiedene Formen der Zöliakie unterschieden werden. Die aktive Zöliakie zeigt die volle Ausprägung der Erkrankung mit klinischen Zeichen der Malabsorption (Steatorrhoe, Vitaminmangel, Gewichtsverlust) und einer typischen Dünndarmhistologie in Form einer Zotten-Atrophie. Unter glutenfreier Ernährung heilt die Schleimhaut und die Symptome gehen zurück [Walker-Smith et al. 1990]. Die Prävalenz dieser Verlaufsform liegt mit 1:1000 bis 1:2000 im Vergleich zu den anderen Formen am niedrigsten und bildet daher die „Spitze des Eisbergs“ nach dem Modell von Mäki [1997]. Die silente Zöliakie (asymptotische) zeichnet sich dadurch aus, dass klinische Symptome fehlen, aber die zöliakietypische Dünndarhistologie und Serologie auftreten [Volta et a. 1998]. Die latente Zöliakie ist ebenso nahezu asymptotisch. Der Antikörperbefund und die Histologie des Dünndarms sind unauffällig. Bei dieser Form ist nur zu einem früheren oder späteren Zeitpunkt im Krankheitsverlauf eine Zöliakie belegt [Holtmeier et al. 2005]. Die potenzielle Zöliakie hebt sich von der latenten dahingehend ab, dass es keine zöliakietypischen Veränderungen wie z. B. Zottenatrophie in der Vorgeschichte gibt. Diese Personen sind jedoch genetisch prädisponiert und könnten in der Zukunft eine akute Zöliakie ausbilden [Stein 2006]. Meist sind bei dieser Gruppe typische Antikörper zu finden (z. B. Gliadin- oder Endomyosin-Antikörper).

Etliche Erkrankungen sind mit Zöliakie assoziiert, wie z. B. Diabetes mellitus Typ I, Dermatitis herpetiformis, Rheumatoide Arthritis, Anämie, Osteoporose und neurologische Erkrankungen. Bei der Dermatitis herpetiformis Duhring besteht eine fast 100 %ige Übereinstimmung mit dem Vorliegen zöliakietypischer Antikörper sowie Veränderungen in der Dünndarmschleimhaut [Reunale et al. 1997]. Etwa 10-20 % der Zöliakie-Patienten sind von dieser Hauterkrankung (juckende Bläschen an Ellenbogen, Knien und Gesäß) betroffen [Rheunale 2001]. Auch Diabetes mellitus Typ I steht in engem Zusammenhang mit Zöliakie [Galicka-Latala et al. 2009]. Diabetes Typ I Patienten, welche wie Zöliakie-Patienten ebenfalls HLA-DQ 2 positiv sind, weisen ca. 12 % IgA-Autoantikörper gegen die Gewebstransglutaminase auf. Demnach sind sie genetisch prädisponiert, um eine Zöliakie auszubilden [Bao et al. 1999]. Des Weiteren besteht für Zöliakie-Patienten ein erhöhtes Risiko für gastrointestinale Malignome, wie intestinale T-Zell-Lymphome, Ösophagus, Oropharynx- und Dünndarm Tumore [Green et al. 2003].

1.2.4 Pathogenese

Die Pathogenese der Zöliakie ist ein Zusammenspiel genetischer, mikrobieller, umweltbedingter und immunologischer Faktoren.

1.2.4.1 Genetische und mikrobielle Faktoren

Das Risiko, an Zöliakie zu erkranken, ist mit ca. 40 % auf die genetische Veranlagung zurückzuführen [Van Heel et al. 2005]. Bis zu 95 % der Zöliakie-Patienten weisen den Histokompatibilitätskomplex HLA-DQ2 und ca. 5 % den HLA-DQ8 auf [Solid et al. 1993]. Da diese HLA-Strukturen auch bei ca. 30 % der gesunden Bevölkerung auftreten, handelt es sich nicht um eine Ursache, sondern um eine Voraussetzung für die Erkrankung [Solid et al. 1989] Die Wahrscheinlichkeit, dass erstgradige Verwandte an Zöliakie erkranken, liegt bei 5-10 %. Bei eineiigen Zwillingen liegt das Risiko mit 75 % erheblich höher [Schumann et al. 2009].

Dass auch die Mikrobiota des Darms eine Rolle bei Zöliakie zu spielen scheint, belegt u. a. eine Studie von Nadal et al. [2007]. Es zeigt sich eine signifikante Erhöhung spezifischer proinflammatorischer Bakterien im Dünndarm von Zöliakie-Patienten. Genauere Zusammenhänge müssen noch untersucht werden. Bisher konnte nur bewiesen werden, dass natürliche Antibiotika wie Beta-Defensin 1 erniedrigt sind und das Fehlen mit der Atrophie des Dünndarmepithels korreliert [Taha et al. 2005]. Eine weitere Arbeit [Tjellström et al. 2007] gibt Hinweise darauf, dass mikrobielle Produkte im Darm wie z. B. kurzkettige Fettsäuren ebenfalls eine Rolle in der Pathogenese der Zöliakie spielen könnten.

1.2.4.2 Gluten und toxische Glutenpeptide

Gluten ist ein Speicherprotein (Klebereiweiß) des Weizens und verwandter Getreidesorten wie Dinkel, Roggen und Gerste. Da bestimmte Proteine des Glutens in der Lage sind, eine Zöliakie zu aktivieren, sind glutenhaltige Getreidesorten von Zöliakie-Patienten zu meiden. Auch Hafer enthält einen geringen Anteil Gluten und erscheint daher ebenso ungeeignet für Zöliakie Patienten [Arentz-Hansen et al. 2004].

Die Glutene lassen sich in eine alkohollösliche Fraktion, die Prolamine (bei Weizen: Gliadine), und eine nicht alkohollösliche Fraktion, die Gluteline (bei Weizen: Glutenine), trennen. Die Bezeichnungen der Fraktionen für die unterschiedlichen Getreidearten sind Tab. 1.2 zu entnehmen. Der Anteil von Prolaminen und Glutelinen entspricht etwa jeweils 50 %. Die Gliadine sind eine Familie von mindesten 40 Proteinen mit Molekulargewichten zwischen 30 und 70 kDa und einem hohen Anteil der Aminosäuren Glutamin (32-56 %) und Prolin (15-30 %) [Dieterich et al. 2003]. Sie werden eingeteilt in die Hauptfraktionen a-, g-, und w-Gliadine. Die schwer löslichen Glutenine unterteilen sich in 20 % high molekular weight (HMW, 65-90 kDa) und 80 % low molecular weight (LMW, 30-45 kDa) Proteine.

Tab. 1.2: Namen der Glutenfraktionen unterschiedlicher Getreidearten.

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Mehrere prolin- und glutaminreiche Glutenpeptide wurden charakterisiert, die sich sowohl in vitro als auch in vivo als toxisch erwiesen. Als besonders immunreaktiv stellten sich die a-Gliadine heraus. Shan et al. [2002] identifizierte ein 33-mer Peptid aus a2-Gliadin als primären Auslöser der Zöliakie. Dieses Peptid mit der Aminosäuresequenz LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (57-89) ist resistent gegenüber gastrointestinalen Enzymen und bindet effizient an die HLA-DQ2 positive Zellen von Zöliakie-Patienten. Es enthält drei immundominante Epitope, die sich teilweise überlappen. Eine verkürzte Variante, bestehend aus den ersten 17 Aminosäuren (57-73) des 33-mer Peptids, zeigt ebenfalls eine hohe Immunreaktivität bei Zöliakie-Patienten [Anderson et al. 2000]. Weitere immundominante Sequenzen der a-sowie g-Gliadine ermittelten Arentz-Hansen et al. [2000 und 2002], das a-9 Gliadin (57-68), das a-2 Gliadin (62-75), g-Gliadin (83-97), g-Gliadin (117-132) und g-Gliadin (78-97). Neben den Gliadinen erwiesen sich auch Gluteninpeptide als T–Zell stimulierend [Vader et al. 2002; Molberg et al. 2003]. In einer aktuellen Studie [Camarca et al. 2009] wurden 17 bekannte immunreaktive Glutenpeptide sowie vier bisher nicht untersuchte Sequenzen hinsichtlich ihrer T-Zell Aktivität in vierzehn HLA-DQ2 positiven Zöliakie-Patienten untersucht. Als die reaktivsten Glutenpeptide stellten sich das a-Gliadin (57-73), das g-Gliadin (139-153) und das w-Gliadin (102-118) heraus.

1.2.4.3 Transglutaminasen

Bei Transglutaminasen (Protein-Glutamin:Amin-γ-glutamyltransferase; E. C. 2.3.2.13) handelt es sich um ubiquitär vorkommende Transferasen, die einen Acyl-Transfer von proteingebundenen Glutaminresten auf primäre Amine katalysieren. Durch die Verknüpfung der γ-Carboxylgruppe der Aminosäure Glutamin und der ε-Aminogruppe eines Lysinrestes wird eine Isopeptidbindung und damit eine Quervernetzung von Proteinen erzeugt. Im menschlichen Organismus existieren acht verschiedene Transglutaminasen mit unterschiedlichen Funktionen wie z. B. Wundheilung, Angiogenese und Apoptose.

Für die Zöliakie ist die ubiquitär vorkommende Gewebstransglutaminase tTG von entscheidender Bedeutung [Caputo et al. 2004]. Zum einen ist sie als Antigen wirksam und damit Ziel von krankheitsspezifischen Antikörpern, auf der anderen Seite erzeugt tTG deamidierte Gliadinpeptide. Unter bestimmten Bedingungen, wie sie bei einer intestinalen Entzündung vorherrschen (u. a. niedriger pH-Wert), gelangt die tTG durch Gewebeschädigung vermehrt in den Extrazellularraum und deamidiert mit Hilfe von Calcium das neutrale Glutamin zur negativ geladenen Glutaminsäure [Fleckstein et al. 2002]. Neben der Deamidierung kommt es zu einem bestimmten Anteil auch zur Quervernetzung der Gliadinpeptide (Abb. 1.2 ). Der Grad der Deamidierung zwischen verschiedenen Peptiden und auch zwischen den einzelnen Glutaminresten innerhalb der einzelnen Peptide zeigt nach einer Studie von Dørum [Dørum et al. 2009] große Unterschiede. a-Gliadin abgeleitete Epitope, die häufig von T-Zellen Zöliakiekranker erkannt werden, zeigen eine signifikant höhere Deamidierung im Vergleich zur Mehrheit der Epitope von γ-Gliadin, die weniger häufig erkannt werden. Auch der Grad der Deamidierung der einzelnen Glutaminreste innerhalb eines Peptids scheint Einfluss darauf zu haben, ob einige Epitope besser von Zellen erkannt werden, die den DQ2- bzw. DQ8-Rezeptor besitzen. Weiterhin gibt eine Studie [Dieterich et al. 2006] Hinweise darauf, dass tTG deamidierte Gliadinpeptide an intestinale Kollagene bindet und Zöliakie-Patienten einen erhöhten Antikörpertiter gegen diese Kollagene aufweisen. Dies könnte einen entscheidenden Einfluss zur Aufrechterhaltung der intestinalen Entzündung darstellen.

Abb. 1.2: Deamidierung (A) und Vernetzung von Proteinen (B) durch Gewebstransglutaminase (tTG).

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Mikrobielle Transglutaminasen kommen aufgrund ihrer Fähigkeit, Quervernetzungen zwischen Proteinen wie z. B. Myosinen, Milch-Caseinen, Eidotter-Proteinen und Glutenen zu erzeugen, vermehrt in der Lebensmittelindustrie zum Einsatz. Transglutaminasen optimieren die technologischen Eigenschaften der Rohstoffe durch Texturverfestigung, Erhöhung der Temperaturstabilität, Stabilisierung von Emulsionen, verbesserte Schaumbildung sowie Optimierung des Wasserbindungsvermögens. Diese Eigenschaften werden u. a. in der Fleisch-, Fisch-, Getreide- und Milchverarbeitung genutzt [Yakoyama et al.2004]. Die mikrobielle Transglutaminase ermöglicht z. B. die Herstellung von Formfleisch, das aus kleinen Fleischstückchen zusammengefügt wird. Bei der Produktion von Joghurts optimiert Transglutaminase die Textur sowie das Wasserhaltevermögen und täuscht die Empfindung von Fett vor. In der Backindustrie wird Transglutaminase eingesetzt, um die Teigtextur zu verbessern und die Krumenstruktur im Brot zu verfestigen. Ebenso optimiert das Enzym die Eigenschaften von Pasta, z. B die Qualität gekochter Spaghetti [Aalami et al. 2008]. Transglutaminase kann neben der Optimierung der physikalischen Eigenschaften auch den Geschmack von Nahrungsmitteln beeinflussen. Für die Industrie lassen sich rekombinante mikrobielle Transglutaminasen (z. B. von Streptomyces mobaraensis) in großem Maßstab in Escherichia coli erzeugen [Yokoyma et al. 2000]. Im Gegensatz zur Gewebstransglutaminase reagiert die mikrobielle Transglutaminase calciumunabhängig. Diese Eigenschaft ist sehr nützlich zur Modifizierung von einigen Nahrungsmittel-Proteinen wie Myosin und Milch Casein, welche sehr empfindlich für Calcium sind und leicht präzipitieren.

Es existieren Arbeiten, die darauf hindeuten, dass eine Behandlung von Getreide mit Transglutaminase zur Erhöhung der Immunreaktivität bei Zöliakie-Patienten führt [Gerrard et al. 2005; Cabrera-Chavez et al. 2008]. Das Gegenteil wurde 2006 in einer Arbeit von Leszczynska et al. [2006] nachgewiesen. Hierbei führten die TG-behandelten Weizenproteine zu einer 30 %igen Erniedrigung der Immunreaktivität im Vergleich zu den unbehandelten Proteinen. Dabei scheinen das Verhältnis zwischen eingesetzter Enzymkonzentration zum Weizenprotein, die Temperatur und die Inkubationszeit eine entscheidende Rolle zu spielen. Des Weiteren entdeckten Gianfrani et al. [2007] in Weizen eine Erniedrigung der Gliadinreaktivität durch mikrobielle Transglutaminase und den Zusatz von Lysin-methylester (Amindonor).

1.2.4.4 Pathomechanismus

Das aktuelle Modell (Abb. 1.3) zum Pathomechanismus der Zöliakie beruht auf der Interaktion des angeborenen und adaptiven Immunsystems [Koning 2008]. Induziert wird der Prozess durch unverdaute Peptidsequenzen des Glutens, die ungehindert die Darmschleimhaut passieren. Es wird spekuliert, dass die Durchlässigkeit der Lamina propria durch Stressfaktoren wie z. B. Infektionen erhöht wird [Stena at al. 2006]. Eine wichtige Rolle für die intestinale Permeabilitätserhöhung spielt die gesteigerte Expression des Proteins Zonulin [Fasano et al. 2000], welches eine Öffnung der Tight Junctions bewirkt und somit die Durchlässigkeit für Glutenpeptide ermöglicht. Lammers et al. bewies 2008, dass Gliadin an den Chemokinrezeptor CXCR3 der Darmepithelzellen bindet, was zu einer MyD88-abhängigen Zonulin-Freisetzung und einer erhöhten intestinalen Permeabilität führt. Die Gewebstransglutaminase, die das Antigen der diagnostisch bedeutsamen tTG-Antikörper ist, modifiziert die Gliadinpeptidfragmente durch Deamidierung und Quervernetzung. Die Deamidierung bewirkt eine Verstärkung des antigenen Potenzials der Peptide, was zur Optimierung der Bindung an die HLA-DQ2- bzw. HLA-DQ8-Rezeptoren der Makrophagen beiträgt [Dieterich et al 2003]. Die daran andockenden T-Lymphozyten lösen zwei verschiedene Kaskaden von Immunreaktionen aus. Zum einen werden über verschiedene Interleukine (z. B. IL-4 und IL-5) der Th1-Zellen die B-Zellen stimuliert, was zu einer Produktion von endomyosialen Antikörpern, tTG-Antikörpern und Anti-Gliadin-Antikörpern führt. Zum anderen wird von den Th2-Zellen TNF-α, als auch IFN-γ sezerniert, welche die intestinalen Fibroblasten zur Produktion von den Mettaloproteinasen MMP-1 und MMP-3 anregen, die dann wiederum die Schleimhautmatrix abbauen [Daum et al. 1999].

Abb. 1.3: Darstellung der adaptiven Immunantwort der Zöliakie [Riecken et al 1998].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Erst seit einigen Jahren ist bekannt, dass neben den beschriebenen T-Zell-Antworten auch Teile des angeborenen Immunsystems durch Gluten stimuliert werden (Abb. 1.4). Dabei spielt das Zytokin IL-15 eine entscheidende Rolle, was durch die Darmepithelzellen nach Glutenexposition verstärkt sezerniert wird [Maiuri et al. 2000]. IL-15 vermittelt die Steigerung der Expression des nicht klassischen MHC-Moleküls MICA auf der Zelloberfläche von Villusenterozyten. Ebenso bewirken Gliadinsequenzen, die sich von den T-Zell-aktiviereneden Gliadinsequenzen unterscheiden, einen Anstieg der MIC-A-Expression bei Zöliakie-Patienten. Die MICA-positiven Zellen werden von natürlichen im Epithel vorkommenden Killerzellen, die den NKG2D-Rezeptor tragen, erkannt und lysiert [Hüe et al 2004; Meresse et al 2004]. Dieser Prozess trägt dazu bei, dass die Darmschleimhaut der Zöliakie-Patienten reduziert ist.

Abb. 1.4: Darstellung der angeborenen Immunantwort der Zöliakie. IEL = intraepitheliale Lymphozyten (Killerzellen)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Jüngst konnte gezeigt werden, dass IL-17 und IL-23 durch Gliadin induziert werden kann und das damit sogenannte Th17-Zellen, die zur Zerstörung des Gewebes beitragen können, aktiviert werden [Castellanos-Rubio et al. 2009].

1.2.5 Zöliakie-Diagnostik

Als der „Gold-Standard“ in der Zöliakie-Diagnostik gilt bis heute die Dünndarmbiopsie. Die histologische Bewertung erfolgt nach den modifizierten Marsh-Kriterien [Oberhuber et al. 1999]. Die Einteilung wird anhand der Zottenhistologie und der intraepithelialen Lymphozytenzahl vorgenommen. Des Weiteren existieren in der Zöliakie-Diagnostik mehrere serologische Testsysteme, in der Regel ELISA, die auf dem Nachweis von Antikörpern beruhen. Die Bestimmung der zöliakiespezifischen Antikörper (endomysiale Antikörper, tTG-Antikörper, Gliadin-Antikörper) stellt kein eigenständiges Kriterium für die Diagnosestellung dar, ist jedoch hilfreich, um frühzeitig asymptomatische Verlaufsformen zu entdecken. Der Nachweis von Gliadin-Antikörpern gilt heute aufgrund der geringen Sensitivität und Spezifität als unzuverlässig und sollte allein nicht mehr verwendet werden [Schumann et al.2009; Vogelsang 2009]. Die Tests auf Endomyosin-Antikörper zeichnen sich durch eine sehr hohe Spezifität (100 %) und Sensitivität (95 %) aus [Caspary et al. 1999], sind jedoch mit sehr hohen Kosten verbunden. Als kosteneffektivste Strategie einer effizienten Diagnostik wird die primäre Testung von tTG-Antikörpern und bei positivem Ergebnis die Durchführung einer Dünndarmbiopsie vorgeschlagen [Dorn et al. 2008]. Der tTG-ELISA besitzt eine annähernd vergleichbare Sensitivität und Spezifität wie der Nachweis der Endomyosin-Antikörper und dient zusätzlich als Verlaufskontrolle, da die tTG-Antikörper nach Einführung einer glutenfreien Kost nach wenigen Monaten eindeutig rückläufig sind. Da die spezifischen Antikörper zur Gruppe der IgA gehören, ist weiterhin zu berücksichtigen, dass weniger als 10 % der Betroffenen einen IgA-Mangel aufweisen, was zu falsch negativen Ergebnissen führen kann.

1.2.6 Nachweis von Gluten in Lebensmitteln

Bisher ist für Zöliakie-Patienten der Verzicht auf glutenhaltige Lebensmittel die einzige Behandlungsmethode. Akobeng et al. [2008]. zeigen, dass die tolerierbare Glutenmenge für Zöliakie-Patienten individuell sehr unterschiedlich ist und empfehlen eine tägliche Aufnahme von weniger als 10 mg Gluten pro Tag.

Der neuste Entwurf des Codex Alimentarius (2007) fordert einen Glutengehalt von < 20 mg Gluten/kg Lebensmittel (20 ppm). Alle Lebensmittel, die unter diesem Wert liegen, werden als „glutenfrei“ bezeichnet.

Auf dem Markt existieren bereits verschiedene Testkits, z. B. RIDASCREEN® Gliadin competitive und RIA® QUICK Gliadin der Firma r-biopharm sowie der EZ Gluten ® Test der Firma ELISA Technologies, zur quantitativen Bestimmung von Gliadin bzw. Gluten in verarbeiteten Lebensmitteln. Die Nachweisgrenzen reichen von 1,5 ppm im ELISA-Testsystem bis zu 2,5 ppm im Lateral Flow Test. Als Nachweisantikörper im ELISA dient in der Regel der monoklonale R5-Antikörper. Dieser erkennt unter anderem die toxische Sequenz QQPFP, die wiederholt in Prolaminen vorkommt [Valdes et al. 2003]. Ein Nachteil dieser auf dem Markt erhältlichen Testsysteme ist, dass sie nicht in der Lage sind, hydrolisiertes Gluten genau zu quantifizieren und somit bestimmte toxische Bestandteile nicht erfasst werden [Thompson et al. 2008]. Von Ferre et al. [2004] wurde ein kompetitiver ELISA entwickelt, der in naher Zukunft vielleicht ermöglicht, auch hydrolysierte Gliadine zu detektieren. Die Anwendung der auf ELISA basierten Testkits bleibt überwiegend auf die lebensmittelverarbeitende Industrie beschränkt. Für den Einsatz im Privatbereich, zur schnellen Gluten-Analyse der Lebensmittel, gibt es bislang nur zwei Lateral Flow Assays auf dem Markt.

1.3 Weizenallergie

1.3.1 Epidemiologie und Klinik

Weizen gehört zu den Hauptauslösern einer Nahrungsmittelallergie. Eine Weizenallergie kann entweder durch den Verzehr von weizenhaltigen Lebensmitteln oder durch das Einatmen von Mehlstaub bei der Verarbeitung von Weizen (Bäckerasthma) verursacht werden. Die Prävalenzdaten mehrerer Studien liefern keine einheitlichen Werte. Sie reichen von 0,4 % bis 9 % [Inomata 2009]. Von Bäckerasthma sind etwa 4-10 % der Bäcker in Europa betroffen [Baur et al. 1998]. Aber nicht nur Backwaren enthalten Weizen, Weizenmehl wird häufig als Verdicker vielen industriellen Nahrungsmitteln zugesetzt und ist oft als Getreidebindemittel, Getreideeiweiß oder Pflanzeneiweiß deklariert. Weiterhin findet sich Weizen in panierten Fertigprodukten, Suppen, Nudeln und Wurstwaren.

Bei Kindern äußert sich eine IgE-vermittelte Weizen-Allergie häufig im Auftreten einer atopischen Dermatitis mit oder ohne Asthma. Erwachsene sind eher von einer „Bewegungs-induzierten Weizenallergie“ (wheat-dependent, exercise-induced anaphylaxis = WDEIA) betroffen [Jacquenet et al.2009]. WDEIA ist eine heftige IgE vermittelte allergische Reaktion, provoziert durch die Nahrungszufuhr von Weizen mit anschließender intensiver körperlicher Anstrengung [Inomata 2009]. Neben körperlicher Betätigung, können auch andere Faktoren, wie z. B. Aspirin als Auslöser wirken [Morita et al. 2009]. Die auftretenden Symptome einer Weizenallergie können sehr vielfältig sein. Sie betreffen die Haut, den Magen-Darm-Trakt sowie die Atemwege.

1.3.2 Allergene

Als Allergene wurden neben Proteinen aus der Glutenfraktion (omega5-Gliadin sowie LMW- und HMW-Glutenine) mehrere Proteine der Wasser/Salz-löslichen Fraktion, wie z. B. a-Amylase/Trypsin-Inhibitor und ein Lipid Transfer Protein, identifiziert [Inomata 2009]. Omega5-Gliadin und HMW-Glutenine gelten als Hauptallergen der WDEIA [Morita et al. 2009].

Es wird vermutet, dass die Gewebstransglutaminase, wie in der Zöliakie, auch in der Pathogenese der WDEIA eine entscheidende Rolle spielt. Durch körperliche Betätigung schütten die Zellen vermehrt Transglutaminase aus. Das Hauptallergen omega5-Gliadin besteht zu mehr als 50 % aus Gliadin und bietet somit der Gewebstransglutaminase eine optimale Angriffsfläche. Palosuo et al. [2003] belegen, dass die durch Transglutaminase vermittelte Vernetzung von omega5-Gliadinen die IgE-Reaktivität in WDEIA steigert.

1.3.3 Weizenallergie-Diagnostik

In der Diagnostik erweisen sich der Pricktest und der Nachweis von IgE-Antikörpern als unzuverlässig. Der Pricktest auf der Haut mit Weizen- und Glutenextrakt liefert oft negative Resultate, auch sind glutenspezifische IgE-Antikörper teilweise nicht nachweisbar [Jacquenet et al 2009]. Heute spielt in der Diagnostik ein Provokationstest mit Nahrungsmitteln die entscheidende Rolle. Bei einem positiven Befund sollten alle Getreideprodukte aus Weizenmehl strikt gemieden werden.

1.4 Eragrostis tef

Teff (Eragrostis tef) ist ein Getreide (Hirse), das ursprünglich aus Äthiopien stammt. Es zählt zur Familie der Süßgräser, gehört aber zu einer anderen Unterfamilie als die in Europa verbreiteten glutenhaltigen Arten Weizen, Roggen, Gerste und Hafer (Abb. 1.5). Der Anbau von Eragrostis tef kann über 3.000 Jahre zurückverfolgt werden. Studien [Aseffa et al. 2001 und 2003] belegen eine große genetische Variabilität zwischen Teff-Sorten aus unterschiedlichen Regionen Ähtiopiens. Weiterhin konnte eine hohe Heterogenität in der Proteinzusammensetzung von Teff-Samen festgestellt werden [Bekele et al 1995]. In Äthiopien ernähren sich heute ca. zwei Drittel der Menschen von Teffmehl, aus dem das traditionelle Landesgericht, die injera, zubereitet wird. Der Name Teff stammt von dem amharischen Wort „teffa“ ab, was „verloren“ bedeutet. Dies ist vermutlich auf die geringe Korngröße des Teff-Samens zurückzuführen. Das Korn ist so klein, dass es nicht von der Hülse getrennt werden kann und somit der gesamte Samen zu Mehl verarbeitet wird. Dies hat einen höheren Nährwert und einen höheren Balaststoffanteil zur Folge. Weiterhin zeichnet sich das Getreide durch einen hohen Anteil bestimmter Mineralien aus wie Eisen, Kalium und Kalzium sowie einen besonders hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren im Vergleich zu Weizen und Gerste, speziell Lysin ist stark angereichert [Mengesha 1965]. Aufgrund seiner hervorragenden Nährwerte wird Teff inzwischen auch in der westlichen Welt in der Lebensmittelindustrie hoch angepriesen. Da Teff als glutenfrei gilt, wird es bei Glutenunverträglichkeit als diätisches Lebensmittel eingesetzt [Van Teeffelen-Heithoff 2003]. Eine niederländische Arbeitsgruppe untersuchte die Unbedenklichkeit von Teff als Lebensmittel für Patienten mit Zöliakie [Spaenij-Dekking et al. 2005]. Es wurden 14 Varianten von Teff hinsichtlich ihrer Reaktivität auf verschiedene T-Zell stimulierende Gluten-Epitope analysiert. Es konnte keine Immunreaktivität gegenüber den eingesetzten Glutenbestandteilen nachgewiesen werden. Eine 2007 veröffentlichte Studie [Hopman et al. 2008], in der Teff als diätisches Lebensmittel direkt an Zöliakie-Patienten untersucht wurde, zeigt, dass bei ca.17 % der Probanden nach dem Verzehr von Teff klinische Symptome auftreten. Im Gegensatz dazu trat bei der Mehrzahl der Patienten nach dem Verzehr von Teff eine signifikante Reduktion der Symptome auf. Aufgrund der bisherigen Daten ist somit der Einsatz von Teff als diätisches Lebensmittel in der Zöliakie mit Vorsicht zu betrachten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Getreide Teff, entgegen bisheriger Annahmen, Gluten enthält. Derzeit ist nur von fünf Proteinen des Teff die spezifische Aminosäuresequenz bekannt (Datenbank NCBI). Darunter befindet sich kein Protein, des sen Aminosäuresequenz eine Homologie zu bekannten Glutensequenzen aufweist.

Abb. 1.5: Taxonomie einiger relevanter Getreidesorten. Modifiziert nach Kagnoff [2007].

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Zielsetzung der Diplomarbeit

Im Vordergrund dieser Arbeit steht das Ziel, die Lebensqualität für Zöliakie-Patienten deutlich zu verbessern. Dazu werden 48 verschiedene Getreidesorten im Hinblick auf immunreaktive Bestandteile näher untersucht. Das besondere Augenmerk liegt dabei auf der äthiopischen Kulturhirse Eragrostis tef, die bisher als glutenfrei gilt [Spaenij-Dekking et al 2005; Van Teeffelen-Heithoff et al. 2003], obwohl dennoch 17 % der Zöliakie-Patienten nach Verzehr mit einer krankheitsspezifischen Symptomatik reagieren [Hopman et al. 2008]. Die Arbeitsgruppe von Spaenij-Dekking et al. konnte in 14 verschiedenen Teff-Sorten keine bekannten immunreaktiven Glutenbestandteile nachweisen. Um dies zu wiederlegen, sollen die Proteine aus verschiedenen Teff-Sorten sowie Kontrollgetreide-Sorten, wie z. B. Weizen, Gerste und Roggen, aufgereinigt werden und im Immunoblot mit Zöliakie-Patientenseren, affinitätsgereinigten Patientenantikörpern, alpha-Gliadin-Antikörpern und mit bereits gegen relevante immunreaktive Bestandteile des Gliadins hergestellten Antikörpern mögliche Proteine identifiziert werden, die bei Verzehr zum Wiederaufflammen der Zöliakie führen. Da auch Weizenallergiker auf Gluten immunreaktiv reagieren, soll zusätzlich die IgE-vermittelte Reaktion an den verschiedenen Getreidesorten, speziell an Teff, untersucht werden.

Des Weiteren soll geprüft werden, ob es Unterschiede in der Proteinzusammensetzung der zu untersuchenden Teff-Sorten gibt, und wenn ja, ob sich diese in der Immunreaktivität widerspiegeln.

Die intestinale Transglutaminase spielt bei der Zöliakie eine entscheidende Rolle, vermutlich auch bei der Weizenallergie. Derzeitig existieren widersprüchliche Ergebnisse in Studien, die den Einfluss von Transglutaminierung auf Gluten bei Zöliakie-Patienten untersuchten [Gerrard et al 2005, Cabrera-Chavez et al 2008, Leszczynska et al. 2006], d. h., es ist nicht eindeutig geklärt, ob die Transglutaminierung von Gluten eine Steigerung oder Senkung der Immunreaktivität bewirkt. In der wheat-dependent, exercise-induced anaphylaxis zeigt eine Studie die Erhöhung der IgE-Reaktivität durch Transglutaminase [Paluoso et al 2003]. Da der Einsatz von Transglutaminasen in der Lebensmittelindustrie eine bedeutende Rolle spielt, gilt zu klären, ob ein Einfluss auf die Unverträglichkeit von Nahrungsmitteln besteht [Malandain 2005]. Hierzu werden die aufgereinigten Getreideproteine vor der Durchführung des Immunoblots zusätzlich mit Transglutaminase modifiziert.

Im zweiten Teil dieser Arbeit sollen in der Firma in.vent zwei Antikörper, die gegen immunreaktive Bestandteile des Gliadins gerichtet sind, affinitätsgereinigt werden, um sie dann zur Herstellung eines einfach durchzuführenden Streifentests (Lateral Flow Assay) einzusetzen. Dieser Test soll Verbrauchern, insbesondere Zöliakie-Patienten, ermöglichen, geringste Mengen von Gluten in Nahrungsmitteln schnell und zuverlässig nachzuweisen, um ihre Lebensqualität zu verbessern. In der Firma in.vent sollen die ersten Vorversuche an Dipsticks durchgeführt werden, um verschiedenste Parameter zur Herstellung eines spezifischen Glutentests zu optimieren und die Gluten-Nachweisgrenze zu ermitteln.

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

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2.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien

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2.1.3 Kits

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2.1.4 Enzyme

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2.1.5 Antikörper

Tab. 2.1: Antikörper für Immundetektion am Westernblot (WB) und für ELISA

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* immunogene Sequenz: KLQPFPQPELPYPQPQ. Eine Überprüfung mit dem Programm „BLAST“ (www.expasy.org) ergab, dass diese Aminosäureabfolge bis zu 93 % mit der Sequenz von alpha-Gliadin (58-73) aus Weizen übereinstimmt.

Antikörper für den Lateral Flow Assay

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2.1.6 Peptide und Proteine

Die verwendeten Peptide wurden von der AG Henklein der Charité Berlin (Glia1/2) sowie von der Firma peptides&elephants aus Nuthetal (Glia3) synthetisiert und lyophilisiert. Die jeweiligen Sequenzen sind in Tab. 2.2 ersichtlich. Eine Auflistung der Sequenzhomologien zu bekannten Proteinen befindet sich im Anhang B.1 und B.2. Das N-terminale Ende der Peptide wurde mit einem Aminohexan-Spacer versehen. Zusätzlich besitzt das Glia3-Peptid Biotin. Dies ermöglicht z. B. eine Bindung an die NeutrAvidin-Oberfläche von ELISA-Platten. Die Peptide Glia1/2 sind an ein unspezifisches Immunstimulants (KLH = Keyhole Limpet Hemocyanin) gekoppelt. Dies befähigt die Peptide, als Antigen bei der Immunisierung von Tieren zu wirken. In diesem Fall wurde eine Immunisierung von Kaninchen durchgeführt.

Die Grundlage für die Entwicklung des Glia1 und Glia2 Peptids bildet ein bereits bekanntes, aus 33 Aminosäuren bestehendes, T-Zell spezifisches Zöliakieepitop [Shan et al 2002]: LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF. Das Glia1-Peptid besteht aus den vordersten 15 Aminosäuren, das Glia2 Peptid aus den letzten 15 Aminosäuren des immunreaktiven 33er Peptids.

Das erzeugte Glia3-Peptid bzw. CD3-Peptid (celiac disease), welches einen hohen Anteil an Glutamat besitzt, setzt sich aus 30 Aminosäuren zusammen.

Tab. 2.2: Aminosäuresequenzen der eingesetzten Peptide

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Weiterhin wurde in einem Versuch die von der AG Skriner (Charité Berlin, Rheumatologie und klinische Immunologie) entwickelte pep-tTG eingesetzt. Hierbei handelt es sich um die aus 687 Aminosäuren bestehende Gewebetransglutaminase, an deren C-terminalen Ende das Glia3-Peptid gekoppelt ist.

2.1.7 Seren

Die verwendeten Kaninchenseren Anti-Glia1 und Anti-Glia2 wurden von der Firma Seramun Diagnostica GmbH (Wolzig) hergestellt. Zur Immunisierung dienten die in Tab. 2.2 aufgelisteten Peptide Glia1 bzw. Glia2. Für die Anwendung der Immundetektion wurden die Seren 1:250 in 5 % (w/v) Milchpulver verdünnt. Zur Antikörperaufreinigung im Mikrotiterverfahren wurden die beiden Seren 1:50 in PBS verdünnt.

Zöliakie

Des Weiteren wurden 45 Patientenseren mit positivem Zöliakiebefund verwendet. Zur Verfügung gestellt wurden diese von der klinischen Rheumatologie der Charité Berlin, der Firma in.vent Diagnostica GmbH (Hennigsdorf), Herrn Dr. Vogelsang (Wien, Klinische Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie) und von Frau Dr. W. Dieterich (Erlangen, Medizinische Klinik). Selektiert wurden die Seren nach ihren Anti-Glia3 und Anti-Gliadin Werten, die in einer bereits vorangegangenen Diplom-Arbeit ermittelt wurden.

Es wurden folgende Serenpools, in 5 % (w/v) Milchpulver 1:50 verdünnt, bei der Immundetektion eingesetzt:

- Anti-Glia3 IgG positiv, Anti-Gliadin IgG negativ (5 Seren)
- Anti-Glia3 IgG negativ, Anti-Gliadin IgG negativ (7 Seren)
- Anti-Glia3 IgA positiv (7 Seren)
- Anti-Glia3 IgA negativ (6 Seren)

Für die Aufreinigung Glia3 spezifischer Antikörper diente ein Serenpool mit 26 Anti-Glia3 positiven Seren mit einer 1:25 Verdünnung in PBS.

Weizenallergie

Die 10 genutzten Seren von Kindern, bei denen eine Weizenallergie diagnostiziert wurde, stellte uns Fr. Dr. K. Beyer (Charité - Universitätsmedizin Berlin, Klinik für Pädiatrie mit Schwerpunkt Pneumologie und Immunologie) zur Verfügung. Es wurde aus diesen 10 Seren ein Pool hergestellt mit einer 1:20 Verdünnung in 5 % (w/v) Milchpulver. Des Weiteren wurden die Seren auch einzeln in einer 1:25 Verdünnung in einer 2 % igen BSA-Lösung verwendet.

Um eine bakterielle Verunreinigung der Serenpools zu vermeiden, wurde jeweils 0,01 % Natriumazid zugesetzt. Die Lagerung erfolgte bei 4 °C. Des Weiteren wurden die Serenpools für mehrere Immundetektionen eingesetzt.

2.2 Proteinbiochemische Methoden

2.2.1 Extraktion von Gluten aus Mehl

Um die einzelnen Glutenfraktionen aus Tef- und Weizenmehl zu gewinnen, wurde die Methode von Akagawa et. al. [2007] mit einigen Modifikationen angewandt. Es wurden jeweils 2 g Mehl eingewogen und 10 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,8) dazu gegeben. Nach 1 h Inkubation bei 4 °C rührend und anschließender Zentrifugation bei 20000 x g für 20 min bei 4 °C wurde der Überstand (Albumine/Globuline) gesammelt. Das Pellet wurde dreimal mit jeweils 5 ml 50 mM Tris-HCL-Puffer gewaschen und je 5 min bei 20000 x g zentrifugiert. Dem Rückstand wurden 10 ml 75 %iger Ethanol zugefügt, und er wurde über Nacht bei 4 °C auf dem Rührer gemischt. Die Suspension wurde am Folgetag erneut bei 20000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert, und aus dem Überstand wurde die Prolaminfraktion gewonnen. Das Pellet wurde, wie bereits zuvor beschrieben, gewaschen, in diesem Fall mit 75 %igem Ethanol. Die Glutelinfraktion wurde im Anschluss mit 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,8) mit 1 % SDS und 0,5 % DTT durch 2 h Rühren bei 4 °C extrahiert. Nach der Zentrifugation bei 20000 x g für 20 min bei 4 °C wurde der Überstand gesammelt. Jede der gesammelten Fraktionen wurde 1:2 mit Harnstoff-Puffer (8 M Urea, 40 mM Tris und 40 % Tween 20) verdünnt und bei -20 °C gelagert.

Aufkonzentrierung der Tef-Prolaminfraktion

Zur Aufkonzentrierung der Proteinlösung wurde ein Amicon Ultra-4 Filtrationsröhrchen mit einem Ausschlussvolumen von 10 kDa eingesetzt. Es wurden 4 ml der Tef-Prolaminfraktion auf die Säule aufgetragen und bei maximal 2800 x g für ca. 30 min zentrifugiert.

2.2.2 Proteinextraktion aus Getreide mittels P-PER® Plant Protein Extraction Kit

Der P-PER-Kit der Firma Pierce umfasst ein organisches Lyse-Reagenz und zwei wässrige Reagenzien, die in Verbindung mit leichter mechanischer Bewegung effektiv pflanzliche Proteine extrahieren. Zuerst wurde jeweils zwischen 40 und 50 mg der 48 verschiedenen Getreidesorten in ein 2 ml Reaktionsgefäß eingewogen. Handelte es sich um Samen, wurden diese mit Mörser und Stößel klein gemahlen. Um mögliche Kontaminationen zwischen den verschiedenen Sorten zu vermeiden, wurde der Mörser und Stößel nach jedem Einsatz gründlich mit dest. Wasser und 75 % Ethanol gereinigt. Lag das Getreide bereits als Mehl vor, konnte es direkt eingesetzt werden. Zu den Getreide-Proben wurde dann je 1,75 ml Extraktionspuffer pipettiert. Dieser wurde zuvor laut Beschreibung des P-PER® Plant Protein Extraction Kits angesetzt: 990 µl Reagenz A, 10 ml Reagenz B, 750 µl Reagenz C und gründlich vermischt. Nachdem der Getreide-Extraktionsansatz sorgfältig auf dem Vortexter gemixt wurde, erfolgte eine Zentrifugation bei 4500 x g für 5 min. Die gelösten Proteine befanden sich danach in der mittleren Phase und wurden vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei -20 °C gelagert.

2.2.3 Proteinbestimmung

Um die gelösten Proteine in der Extraktionslösung zu bestimmen, wurde das Pierce® 660 nm Protein Assay Reagenz eingesetzt. Der Test ist linearer als Coomassie-basierte Bradford Assays und kompatibel mit höheren Konzentrationen der meisten Detergenzien, Reduktionsmittel und anderen häufig eingesetzten Reagenzien. Die Methode basiert auf der Bindung eines Farbstoff-Metall-Komplexes mit Proteinen unter sauren Bedingungen. Dies verursacht eine Verschiebung des Farbstoffabsorptionsmaximums von rötlich nach grün, welches bei 660 nm gemessen werden kann. Der Farbstoff interagiert vor allem mit den basischen Aminosäuren, wie Histidin, Lysin und Arginin, und in geringerem Maße mit Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin. Für die Durchführung wurden 750 µl Assay Reagenz zu 50 µl Probe pipettiert, 5 min inkubiert und in einer Halbmikroküvette bei 660 nm am Photometer gemessen. Für die Standardreihe wurde BSA (bovine serum albumin) genutzt.

2.2.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Diese Form der Elektrophorese ermöglicht die Auftrennung von Proteinen in einem Polyaccrylamid-Gel nach ihrem Molekulargewicht. Durch SDS (Sodiumdodecylsulfat), welche sich an die Proteine anlagert, wird die Eigenladung der Proteine überdeckt, und es entstehen negativ geladene SDS-Protein-Komplexe mit einem konstanten Ladungs- zu Masse-Verhältnis. Des Weiteren denaturiert SDS die Proteine und zerstört ihre Quartärstruktur. Zur Reduktion von Disulfidbrücken wird Dithiothreitol (DTT) eingesetzt. Die negativ geladenen Proteine unterscheiden sich letztlich nur noch durch ihre Größe und wandern im elektrischen Feld vom Negativ- zum Pluspol.

In der vorliegenden Arbeit wurden die notwendigen Gele gegossen, bestehend aus 4 %igen Sammelgel und 10- oder 12,5 %igen Trenngel ( Tab. 2.3 und Tab. 2.4).

Tab. 2.3: Ansatz für 10 ml Sammelgel Tab. 2.4: Ansatz für 30 ml Trenngel

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Bevor ein Gel mit den Proben beladen werden konnte, wurden die Proteinproben mit dest. Wasser auf eine einheitliche Proteinkonzentration eingestellt und mit 6xLaemmli-Puffer versetzt. Nach der Denaturierung der Proteine bei 95 °C für 5 min wurden die Ansätze auf das Polyacrylamid-Gel aufgetragen (maximal 24 µl Probe/Tasche bei insgesamt 10 Taschen). Als Größenstandard wurden 5 µl des BlueRanger ® Prestained Protein Molecular Weight Marker Mix der Firma Pierce eingesetzt (nur in einem Coomassiegel zur Affinitätschromatographie über Protein A wurde der Benchmark Protein Ladder der Firma Invitrogen verwendet). Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte mit Hilfe des Elektrophoresepuffers bei einer Stromstärke von 25 mA. Gekühlt wurde das System mit dem Wasserkühler.

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2.2.5 Coomassie-Färbung

Um die aufgetrennten Proteine auf dem Gel sichtbar zu machen, wurde eine auf Coomassie-Brilliantblau basierende Protein-Farblösung eingesetzt. Im Vergleich zu der Färbung mit einer selbst hergestellten Coomassie-Farblösung färbt InstantBlue (Novexin) das Gel in einem Arbeitsschritt innerhalb von 15 min. Die Gele wurden direkt nach der Elektrophorese mit ca. 40 ml InstantBlue bedeckt, auf dem Schüttler 5 bis 15 min inkubiert und anschließend mit dest. Wasser gewaschen. Die Dokumentation erfolgte durch Einscannen der Gele. Mit diesem Verfahren können 5-25 ng Protein pro Bande nachgewiesen werden.

In einem einzelnen Versuch wurde Imperial Protein Stain der Firma Pierce verwendet. Auch hierbei handelt es sich um eine auf Coomassie-Brilliantblau basierende Protein-Farblösung. Es können bis zu 3 ng Protein pro Bande detektiert werden. Die Färbung dauert jedoch im Vergleich zu InstantBlue länger und erfolgt in mehreren Arbeitsschritten: dreimal Waschen des Gels mit dest. Wasser für 15 min, 5-10 min Färbung mit Imperial Protein Stain , mehrmaliges Waschen mit dest. Wasser für 15 min.

2.2.6 Western Blot

Als Western Blot bezeichnet man das Verfahren, bei dem die zuvor im Gel aufgetrennten Proteine auf eine Membran übertragen werden. Für die elektrophoretische Übertragung wurde das Tankblotverfahren eingesetzt. Als Erstes wurden die Nitrocellulosemembran, zwei Elektrodenschwämme und zwei Filterpapiere für wenige min in Transferpuffer äquilibriert, um diese dann zusammen mit dem SDS-Gel in einer Blotkassette als „ Sandwich “ zusammenzufügen (Abb. 2.1).

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Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Anordnung in der Blotkammer

Die Kassette wurde in die mit Transferpuffer gefüllte Blotkammer überführt. Die Übertragung erfolgte bei einer Stromstärke von 400 mA für 1 h. Das System wurde an den Wasserkühler angeschlossen.

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Ponceau S-Färbung

Zur Kontrolle des Proteintransfers und der zuvor erfolgten Auftrennung, wurde der Blot reversibel mit Ponceau-S-Lösung gefärbt. Dazu wurde die Membran nur kurz in der Farblösung geschwänkt und anschließend vorsichtig mit dest. Wasser so lange entfärbt, bis die Proteinbanden sichtbar wurden. Zur Dokumentation wurden die Membranen eingescannt. Danach konnten die Membranen bei 4 C gelagert werden oder gleich im Anschluss für eine Immundetektion in Milchpulver geblockt werden (2.2.7).

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2.2.7 Immundetektion

Dieser Schritt dient der Visualisierung der gesuchten Proteine im Blot. Dazu werden zum einen spezifische Primärantikörper eingesetzt, welche an den entsprechenden Proteinen binden, und zum anderen Sekundärantikörper, die eine Detektion über ein geeignetes Substrat ermöglichen. Um die unspezifischen Bindungsstellen auf der Membran zu blockieren, wurden diese zunächst mit 5 oder 10 % Milchpulver in PBS unter leichtem Schwenken inkubiert (2 h oder über Nacht bei 4 °C). Danach erfolgte die Inkubation mit dem jeweiligen Primärantikörper in 5 % Milchpulver (Verdünnung siehe: 2.1.5) bzw. den Serenpools (Verdünnung: siehe 2.1.7). Die Inkubationszeit variierte von 1 h bis über Nacht bei 4 °C. Danach folgten 4 Waschschritte von je 5 min in PBS/0,1 % Tween 20. Im Anschluss wurde die Membran mit einem HRP (horseradish peroxidase) gekoppelten Sekundärantikörper in 5 % Milchpulver (Verdünnung: siehe 2.1.5) für 1 h auf dem Schüttler inkubiert und anschließend gründlich viermal 10 min gewaschen. Um die Immunreaktion sichtbar zu machen, wurden die zwei Chemilumineszens-Substrate (Roti™-Lumin, Roth oder Super Signal West Dura Extended Duration Substrat, Pierce) im Verhältnis 1:2 miteinander gemischt und für 1 min auf der Membran inkubiert. Das enthaltene Luminol bzw. dessen Derivate werden von der HRP oxidiert. Dies bewirkt eine Lichtemission. Nach Abtropfen des überschüssigen Substrates wurde die Membran zwischen eine Klarsichtfolie in eine Röntgenkassette gelegt. In der Dunkelkammer folgte das Auflegen eines Autoradiographiefilms (Amersham Hyperfilm™ ECL, GE Healthcare). Die Belichtungszeit variierte von 5 s bis 60 min, je nach Stärke der emittierten Strahlung. Zur Visualisierung der Banden wurde der belichtete Film für 1 min in Entwicklerlösung (Kodak) geschwenkt, anschließend in dest. Wasser gespült, für 1 bis 2 min im Fixiererbad (Kodak) inkubiert und erneut mit dest.Wasser gewaschen. Zur Dokumentation wurden die belichteten Filme eingescannt.

Für die Untersuchung einzelner Weizenallergikerseren wurde die Membran nach dem Blotten in 2 mm breite Streifen geschnitten und mit Transglutaminase modifiziert (2.2.8). Für die anschließende Immundetektion ergaben sich für die einzusetzenden Lösungen folgende Volumina/Streifen: Nach dem Blockieren mit 10 % Milchpulver in PBS wurden je 500 µl der verschiedenen Weizenallergikerseren (Verdünnung siehe 2.1.7) 90 min inkubiert. Der anschließende Waschschritt wurde mit je 2 ml PBS für viermal 5 min durchgeführt. Es wurde 1 ml Sekundärantikörper (Anti-human IgE) für 1 h inkubiert und erneut mit 2 ml PBS gewaschen. Vor der Zugabe des Chemilumineszenssubstrates wurden die einzelnen Streifen auf einer transparenten Klebefolie wieder zusammengefügt. Die Visualisierung der Banden erfolgte wie bereits im vorherigen Absatz beschrieben.

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2.2.8 Modifikation immobilisierter Proteine mit Transglutaminase

Nach dem Western Blot-Verfahren (2.2.6) konnten die auf die Membran übertragenen Proteine durch das Enzym Transglutaminase modifiziert werden. Die Transglutaminase katalysiert die Deaminierung von Glutamin. Dies führt zur Umwandlung von Glutamin zu Glutamat. Ist an der Reaktion, neben Glutamin, auch Lysin beteiligt, kommt es zur Ausbildung einer e-(g-glutamyl)lysin-Brücke, welche eine Quervernetzung der Proteine bewirkt. Für die Modifizierung wurde die Westernblotmembran zunächst zweimal 5 min auf dem Schüttler mit TBS-Puffer gewaschen. Nach Zugabe von 10 ml Modifikations-Puffer wurden 20 µl tTG2 (250 µg/ml) dazu pipettiert und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Als Negativkontrolle wurde eine gleich behandelte Membran ohne Zugabe von Enzym mitgeführt. Am Folgetag wurde die Membran dreimal 10 min mit 20 ml PBS/20 mM EDTA gewaschen. Auch die anschließende 5 %ige Milchblockierungslösung wurde mit EDTA versetzt (10 mM). Das EDTA dient dem Abstoppen der enzymatischen Reaktion durch die Bindung von Calcium-Ionen. Nach dem Absättigen der freien Bindungsstellen folgte, wie bereits unter 2.2.7 beschrieben, die Immundetektion. Bei der Verwendung der mikrobiellen Transglutaminase (mTG) wurden 10 µl (0,1 U/µl) auf 10 ml TBS-Puffer eingesetzt. Die mTG reagiert ohne Zusatz von CaCl2, und DTT. Wurde die Blotmembran vor Modifikation in ca. 2 mm breite Streifen geschnitten, änderten sich die Volumina/Streifen wie folgt: erster Waschschritt wurde mit 1 ml TBS durchgeführt; zur Modifikation wurde 1 ml von dem bereits zuvor beschriebenen Ansatz eingesetzt; Waschschritt nach der Modifizierung erfolgte mit 2 ml PBS/20 mM EDTA. Es schloss sich die Immundetektion an (2.2.7 Absatz 2).

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2.2.9 Dot Blot

Bei diesem Verfahren werden die Proben punktförmig auf ein Trägermaterial aufgetragen. In dieser Arbeit wurden, im Vergleich zum Western Blot, die Proteine in nativem Zustand auf eine Nitrozellulosemembran gebracht. Auf eine 9x6 cm große Membran wurde zunächst mit Bleistift ein quadratisches Raster für 70 mögliche Proben angelegt. Pro Feld wurden je 2 µg Protein aufgetragen. Diese Proteinmenge entsprach durchschnittlich 2 µl. Im Anschluss wurde diese Membran mit tTG modifiziert (siehe 2.2.8) und eine Immundetektion (siehe 2.2.7) durchgeführt.

2.2.10 Affinitätsreinigung von Antikörpern im Mikrotiterformat

Aufreinigung von Anti-Glia3-Antikörpern aus Patientenseren

Um Anti-Glia3-Antikörper aus Zöliakie-Patientenseren aufzureinigen, wurde das synthetisch hergestellte Glia3-Peptid an eine Festphase gekoppelt. Durch Biotinilierung des Glia3-Peptids war es möglich, dieses an eine NeutrAvidin-Platte zu binden. Die 96-well-Platte wurde zunächst 3x1 min mit 200 µl PBS/well gewaschen. Das Glia3-Peptid wurde in einer Konzentration von 500 pmol/well, was der Masse von 2 µg entspricht, an die Platte gekoppelt. Dafür wurden 120 µl in PBS gelöstes Glia3-Peptid (16,7 ng/µl) pro well eingesetzt. Die Inkubation erfolgte für 1 h bei 600 rpm auf dem Schüttler bei RT. Danach wurde die Platte erneut 3x1 min mit PBS gewaschen. Die nichtbesetzten Bindungsstellen der wells wurden anschließend für 1 h auf dem Schüttler mit je 150 µl 3 % Milchpulver/PBS blockiert. Nach Entfernen des Blockpuffers wurde erneut mit PBS gewaschen, 2x1 min. Nun wurden je 150 µl von dem Glia3 positiven Zöliakie-Patientenserenpool (siehe 2.1.7) in die wells pipettiert, über Nacht bei 4 °C und am nächsten Tag noch einmal für 1 h bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Nach einem Waschschritt von 4x1 min mit PBS folgte die Zugabe von je 100 µl sauren Elutionspuffer. Für die Kontrolle einer erfolgreichen Elution wurde in zwei Vertiefungen PBS gegeben. Die Inkubationszeit betrug 15 min. Im Anschluss wurde zur Neutralisation in jedes well 20 µl 1 M Tris (pH 8,0) gegeben, resuspendiert und die einzelnen Fraktionen zusammengeführt. Der pH der Antikörperlösung wurde zur Sicherheit noch einmal geprüft und gegebenenfalls auf pH 7/8 korrigiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Aufkonzentrierung und Umpufferung der gewonnenen Anti-Glia3-Antikörper

Dieser Schritt erfolgte schnellstmöglich nach der Aufreinigung. Um die Antikörper aufzukonzentrieren und in PBS umzupuffern, wurde ein 10 kDa Amicon Ultra-4 Filtrationsröhrchen genutzt. Das Röhrchen wurde dreimal mit der Antikörperlösung auf 4 ml aufgefüllt, je 8 min bei 28000 x g bis auf ein Restvolumen von 1 ml zentrifugiert. Diese Vorgehensweise wurde noch einmal mit dreimaliger Zugabe von PBS wiederholt. Die Lagerung der Antikörper erfolgte bei 4 °C.

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