Die Bedeutung der Deubiquitinierung für den intrazellulären Transport von Membranproteinen und bei Signaltransduktionswegen

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Das Ubiquitin-System
1.1.1 Abbau im 26S-Proteasom
1.1.2 Formen der Ubiquitinierung
1.2 Deubiquitinierung
1.2.1 Mechanismus der Deubiquitinierung
1.3 Funktionen der Deubiquitinierung
1.3.1 Histon-Deubiquitinierung
1.3.2 Endozytose
1.3.3 Zellzyklusregulation und DNA-Reparatur
1.4 Regulation der Deubiquitinaseaktivität
1.5 Zielsetzung der Arbeit

2 Regulation von Signaltransduktionswegen
2.1 Regulationsmechanismen
2.2 Der "Nuclear Factor kappa-B"-Signalweg
2.2.1 Kanonischer Signalweg
2.2.2 Nicht-kanonischer Signalweg
2.3 Einfluss der Deubiquitinasen auf den NF-κB-Signalweg
2.4 Nachweis der Regulation durch die Deubiquitinase CYLD
2.4.1 CYLD als negativer Regulator des NF-κB-Signalweges
2.4.2 Regulation der CYLD-Expression durch den NF-κB-Signalweg
2.4.3 CYLD wird durch NEMO-abhängige Phosphorylierung reguliert
2.4.4 Regulation des JNK-Signalweges und der TRAF2-Ubiquitinierung
2.4.5 Auswirkungen der CYLD-Expression auf die Genexpression
2.4.6 Deubiquitinierung des NF-κB-Aktivators CC2D1A
2.5 Nachweis der Regulation durch die Deubiquitinase A20
2.5.1 Regulation der A20-Expression durch den NF-κB-Signalweg
2.5.2 Ubiquitin- Editing von RIP durch A20
2.5.3 A20 fördert den Abbau der Ubiquitin-Konjugasen Ubc5 und Ubc13
2.5.4 A20 benötigt Rnf11 zur Herunterregulation des NF-κB-Signalweges
2.5.5 A20 benötigt ABIN-1 für die Deubiquitinierung von NEMO
2.5.6 Kontrolle der zweiten Phase des NF-κB-Signalweges
2.5.7 A20 und IκK-abhängige Phosphorylierung
2.6 Nachweis der Regulation durch die Deubiquitinase CEZANNE .
2.6.1 Regulation der CEZANNE-Expression durch den NF-κB-Signalweg
2.6.2 Regulation des NF-κB-Signalweges durch CEZANNE
2.6.3 Auswirkungen der Deubiquitinierung von IκK und RIP

3 Diskussion
3.1 Deubiquitinierung von TRAF2 und TRAF6 durch CYLD
3.2 Physiologische Funktionen von CYLD
3.3 Phosphorylierung von CYLD durch IκK
3.4 Wechselseitige Regulation von CYLD und dem NF-κB-Signalweg
3.5 A20-Spezifität
3.6 A20 inhibiert die Rekrutierung von RIP und TRADD
3.7 Funktionen des A20-Komplexes
3.8 Funktionen des C-Terminus von CEZANNE
3.9 Interaktionen der Deubiquitinasen

4 Zusammenfassung

5 Regulation des intrazellulären Transportes von Membranproteinen
5.1 Plasmamembranproteine
5.2 Der epidermale Wachstumsfaktor(-rezeptor)
5.3 Der EGFR-Signalweg
5.4 Herunterregulation des EGF-Rezeptors
5.5 Kontrolle der Herunterregulation durch Deubiquitinasen
5.6 Regulation durch die Deubiquitinase AMSH
5.6.1 Nachweis der Assoziation von AMSH und ESCRT-III
5.6.2 Funktionen von AMSH bei der Herunterregulation des EGFR
5.7 Ubiquitin-spezifische Protease Y
5.7.1 Funktionen der Mit-Domäne
5.7.2 Funktionen der HRS-STAM-Bindung
5.7.3 Rolle von UBPY bei der Herunterregulation des EGFR

6 Diskussion
6.1 Funktionen der Mit-Domäne von UBPY und AMSH
6.2 Interaktionen zwischen AMSH und CHMP
6.3 Funktionen von AMSH bei der Herunterregulation des EGFR
6.4 Modifikationen von UBPY
6.5 Komplexbildung zwischen UBPY und dem EGFR
6.6 Deubiquitinierung des EGFR durch UBPY
6.7 Interaktionen von AMSH und UBPY

7 Zusammenfassung

Literaturverzeichnis

Anhang

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Mechanismus der Ubiquitinierung

Abbildung 2: Formen der Ubiquitinierung

Abbildung 3: Allgemeines Modell des NF-κB Signalweges

Abbildung 4: Ubiquitin-Editing von RIP durch A20

Abbildung 5: Darstellung des negativen Feedbacks im TNF-Signalweg durch A20 und IκBα

Abbildung 6: Allgemeines Modell des EGFR-Signalweges

Abbildung 7: Herunterregulation des EGF-Rezeptors

Abbildung 8: Interaktionen von AMSH mit verschiedenen Komponenten der ESCRT- Maschinerie und Clathrin

Abbildung 9: Mögliches Modell der AMSH-Funktionen bei der endosomalen Sortierung der Wachstumsfaktoren

Abbildung 10: 26S-Proteasom und mit ihm assoziierte Deubiquitinasen

Abbildung 11: Übersicht über den NF-κB-Signalweg

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Das Ubiquitin-System

Posttranslationale Modifikationen von Proteinen geben Zellen die Möglichkeit auf intra- und extrazelluläre Stimuli zu reagieren, damit sie die Kontrolle über ihre zellulären Prozesse behalten. Eine wichtige Rolle innerhalb dieser Modifikations-systeme nimmt dabei das Ubiquitin (Ub)-System ein. Neben seiner klassischen Funktion als Abbausystem von Proteinen, verfügt es über diverse weiterführende Funktionen, die bisweilen noch nicht alle erforscht sind. Bekannt ist, dass das Ub-System von essentieller Bedeutung bei der Regulation von diversen Signal-transduktionswegen zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase und der Translokation von zellulären Proteinen ist. Die kovalente und reversible Übertragung von Ub-Molekülen auf die zu regulierenden Proteine wird als Ubiquitinierung be-zeichnet. Ub ist ein Polypeptid, welches aus 76 Aminosäuren (AS) besteht und ein Molekulargewicht von 8,5 kDa aufweist. Es besitzt eine globuläre Tertiärstruktur, wobei die vier C-terminalen AS herausragen. Das Ub der Hefe unterscheidet sich von dem des Menschen nur in drei der 76 AS, was es zu einem der höchst-konserviertesten Proteine überhaupt macht. Ubiquitiniert werden Membranproteine, cytosolische Proteine und Proteine aus dem Nukleus. Dabei bindet der carboxy-terminale Teil des Ubiquitins an die ε-Aminogruppen eines oder mehrerer Lysine des zum Abbau vorgesehenen Proteins. Die Energie für die Reaktion wird durch Hydro-lyse von Adenosintriphosphat (ATP) bereitgestellt. Die Reaktion läuft kaskadenartig ab und wird von drei Enzymen (E1-E3) katalysiert: Im ersten Schritt wird Ub durch die Reaktion mit ATP aktiviert. Dieser Reaktionsschritt wird vom Ubiquitin-aktivierendem Enzym (E1) durchgeführt. Das terminale Gly des Ub wird dabei unter Abspaltung von Pyrophosphat adenyliert und aktiviert. Anschließend wird der C-Terminus des Ub durch Ausbildung einer Thioesterbindung auf die Sulfhydrylgruppe eines Cys im E1-Enzym übertragen. Das gebundene Adenosinmonophosphat (AMP) wird abgespalten. Es folgt die Übertragung auf das Ubiquitin-konjugierende Enzym (E2), auch hier unter Ausbildung einer Thioesterbindung. Das E2-Enzym und das zu markierende Zielprotein werden nun von einer Ubiquitin-Protein-Ligase (E3) ge-bunden und das Ub auf eine Aminogruppe eines Lys des Zielproteins übertragen.

Bei Proteinen, die über kein Lysin verfügen, kann die Bindung auch über ein freies Cys erfolgen (CADWELL et al., 2005).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Mechanismus der Ubiquitinierung (nach HOCHSTRASSER, 2009)

Im ersten Schritt adenyliert das Ubiquitin-aktivierende Enzym E1 Ubiquitin und überträgt dieses auf eines seiner Cysteine. Daraufhin wird Ubiquitin auf ein Cystein des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms E2 transferiert. Die Ubiquitin-Protein-Ligase E3 überträgt Ubiquitin anschließend auf ein Lysin des abzubauenden Zielproteins. Letztlich findet in vielen Fällen noch eine Ubiquitin-Kettenverlängerung statt und eine Deubiquitinase spaltet Ubiquitin von seinem Substrat wieder ab.

Da insgesamt mindestens 60 verschiedene Ub-konjugierende Enzyme und über 600 verschiedene Ub-Protein-Ligasen existieren, ergibt sich eine große Substrat-spezifität. Die E3-Familie bildet damit eine der größten Genfamilien des Menschen. Bei ihr muss man zwischen zwei Enzymklassen unterscheiden: die HECTs (Homolog zum E6-AP Carboxyl-Terminus) sind katalytisch aktiv und können Ub direkt binden.

HECTs transferieren Ub selbst von der Ub-Konjugase auf das Substrat. Demgegen-über besitzen die RING-Enzyme (Really Interesting New Gene) keine katalytische Aktivität und können Ub auch nicht binden. Ihre Bindung an die Ub-Konjugasen löst einen Mechanismus aus, der bewirkt, dass die Konjugasen Ub selbst auf das Substrat übertragen (GLICKMAN et al., 2002). Bisher konnten acht funktionelle AS (die Lysine an den Stellen 6, 11, 27, 29, 33, 48 und 63 sowie das Glycin an der Stelle 76) identifiziert werden. Während die Substratbindung über Gly76 verläuft, entscheidet die AS, über die die Ubiquitine untereinander verbunden sind über das Schicksal des gebundenen Proteins. So werden Bindungen über Lys48 und Lys29 klassischerweise mit dem Abbau im 26-Proteasom in Verbindung gebracht. Dafür muss eine Kette aus mindestens vier Ub-Molekülen entstehen (THROWER et al., 2000). Die Kette entsteht durch Ausbildung von Isopeptidbindungen (die stabil gegen menschliche Peptidasen sind) zwischen den jeweiligen Lysinen.

1.1.1 Abbau im 26S-Proteasom

Das 26S-Proteasom (siehe Anhang) stellt einen großen Proteasekomplex dar, in dem die ubiquitinierten Proteine unter ATP-Verbrauch verdaut werden. Jede Zelle verfügt dabei im Schnitt über knapp 30.000 Proteasomen. Das 26S-Proteasom ist eine multikatalytische Protease, die aus einer 20S-Untereinheit (besitzt katalytische Funktion) und einer 19S-Untereinheit (besitzt regulatorische Funktion) besteht. Die katalytische Untereinheit besteht dabei aus zwei Kopien (α und ß) von je 14 homologen Subeinheiten und weist ein Molekulargewicht von 700 kDa auf. Angeordnet sind diese in Form von vier Ringen zu je sieben Untereinheiten, die zu einer fassähnlichen Struktur übereinander gestapelt sind. Der Zugang zum 20S-Kern wird dabei von einer regulatorischen Einheit kontrolliert, die ein 700-kDa-Komplex aus 20 Untereinheiten darstellt. Die 19S-Untereinheit kann weiter in zwei Sub-komplexe unterteilt werden, den Deckel und das Fass. Während der Deckel verschiedene Ub-Rezeptoren beinhaltet und somit für die Erkennung der Substrate verantwortlich ist, stellt das Fass einen Proteinpartikel dar, welcher unter ATP-Verbrauch selektiv ubiquitinierte Proteine entfaltet und diese ins Innere des Proteasoms einfädelt. Jeweils ein 19S-Komplex bindet an die Enden des 20S-Proteasoms und bildet somit das komplette 26S-Proteasom.

Die 20S-Untereinheit bildet im Inneren einen Hohlzylinder, wobei die proteolytischen Domänen an den Innenseiten liegen und vom Cytosol wirkungsvoll abgeschirmt sind. Somit können sich andere Proteine nicht ins Innere des Proteasoms verirren und die zum Abbau bestimmten Substrate werden geschützt, bis sie ins Innere gelenkt werden. Durch die spezifische Bindung der 19S-Untereinheiten (mittels Ub-bindenden Proteinen) an die Ub-Ketten wird gewährleistet, dass nur die Proteine abgebaut werden, die auch zum Abbau markiert worden sind. Essentiell für die Reaktion ist die ATPaseaktivität der 19S-Untereinheiten. Sie verfügen über sechs verschiedene ATPasen der AAA (assoziiert mit verschiedenen zellulären Aktivitäten)-Klasse, die bei der Entfaltung des Substrats und der Konformationsänderung des Kerns hilft, sodass das Substrat ins Innere gelangen kann. Die ß-Subeinheiten des 20S-Komplexes verfügen über insgesamt drei Typen von aktiven Zentren mit unter-schiedlicher Spezifität, gemein haben sie jedoch das N-terminale Thr. Dessen OH-Gruppe wird in ein Nukleophil umgewandelt, welches die Carbonylgruppen der Peptidbindungen angreift, wodurch Acyl-Enzym-Zwischenstufen entstehen. Die Peptidbindungen werden aufgespalten bis das Protein nur noch aus einem 7-9 AS langem Peptidrest besteht, ohne dass dabei Zwischenstufen freigesetzt werden. Das Ub wird anschließend in der 19S-Untereinheit durch eine Ub-spezifische-Protease, eine Isopeptidase, vom Peptid abgespalten und recyclisiert. Es geht unverbraucht aus der Reaktion hervor. Die Peptidreste werden durch Proteasen in AS zerlegt (JOHNSON et al., 1995).

1.1.2 Formen der Ubiquitinierung

Ub-Bindungen via Lys63 haben nicht-proteolytische Funktionen. Sie stellen z.B. ein Signal zur Endozytose, zur Aktivierung von Proteinkinasen oder zur Einleitung von DNA-Reparaturwegen dar. Die Bedeutung der anderen Lysine ist bisher noch nicht hinreichend erforscht. Während Ub-Ketten über Lys48 verzweigt sind, sind die Ketten bei einer Lys63-Verknüpfung meistens linear (DATTA et al., 2009). Des Weiteren unterscheidet man nach Menge und Art der angehangenen Ub-Moleküle zwischen Mono-, Multi- und Polyubiquitinierungen, die verschiedene Funktionen haben (Abbildung 2).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Formen der Ubiquitinierung (nach VENTII et al., 2008)

Bei der Ubiquitinierung wird zwischen einer (A) Mono-, Multi- und einer (B-E) Polyubiquitinierung unterschieden, die jeweils verschiedene Funktionen besitzen. Bei der Polyubiquitinierung wird auch zwischen verschiedenen Formen, wie z.B. der linearen bei Lys63 und der verzweigten, wie bei Lys48 differenziert .

Monoubiquitinierung ist beispielsweise an der Endozytose von Plasmamembran-proteinen, der Transkriptionsregulation und der DNA-Reparatur beteiligt, während Multiubiquitinierungen eine wichtige Rolle bei der Endozytose von Rezeptortyrosin-kinasen und dem nukleären Export des Transkriptionsfaktors und Tumorsuppressor-proteins p53 spielen. Es existieren eine Vielzahl von Signalen, die bestimmen, ob und wann sich Ub an ein Protein anlagert.

Am bekanntesten und einfachsten zu deuten ist die Tatsache, dass die Halbwertszeit (HWZ) eines Proteins u.a. durch seine aminoterminale AS bedingt ist (N-End-Rule). So verlängert ein N-terminales Ala die Lebensdauer eines Proteins, während ein Arg diese verkürzt. Dementsprechend oft sind Proteine mit kurzer HWZ die Ziele von Ub. Das Lesen der AS wird dabei von den E3-Enzymen übernommen. Nach TOBIAS et al. (1991) verhält sich die Abhängigkeit der HWZ in Bezug auf ihre aminoterminale AS wie folgt:

1. stark stabilisierende AS (Halbwertszeit > 20 Stunden)

Ala, Cys, Gly, Met, Pro, Ser, Thr, Val

2. destabilisierende AS (Halbwertszeit 2-30 Minuten)

Arg, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Tyr, Trp

3. nach chemischer Veränderung destabilisierende AS (Halbwertszeit 3-30 Minuten)

Asn, Asp, Glu, Gln

Eine destabilisierende AS begünstigt die Anlagerung des Proteins an Ub, während eine stabilisierende AS dies nicht tut. Eine posttranslationale Addition von u.a. Arg kann somit die Lebensdauer eines Proteins verkürzen.

1.2 Deubiquitinierung

Nachdem man entdeckt hatte, dass die Ubiquitinierung ein reversibler Prozess ist, wurde klar, dass neben den Ub-übertragenden Enzymen auch Enzyme existieren müssen, die Ub wieder vom Protein abspalten. Dies geht allein schon aus der Tat-sache hervor, dass das Ub beim Proteinabbau im 26S-Proteasom recycelt wird. Bisweilen sind knapp 100 solcher Enzyme, die Deubiquitinasen (auch: de-ubiquitinierende Enzyme und DUBs) genannt werden, identifiziert worden. Die DUBs in Säugetieren hat man in fünf große Gruppen unterteilt:

1. Ubiquitin-Carboxy-terminale Hydrolasen (UCHs)
2. Ubiquitin-spezifische prozessierende Peptidasen/Proteasen (USPs/UBPs)
3. Ovariale Tumorproteine (OTUs)
4. Josephin bzw. Machado-Joseph-Disease-Proteasen (MJDs)
5. Jab1/MPN-Domänen-assoziierte Metalloisopeptidasen (JAMMs)

Während es sich bei den ersten vier Gruppen um Cysteinproteasen handelt, stellen die JAMM Zink-Metalloisopeptidasen dar.

Des Weiteren ist noch eine weitere Familie von DUBs bekannt, die Adenain-Familie, deren Spezifität für Ub jedoch sehr gering bzw. gar nicht vorhanden ist. Sie umfasst die ULPs (ubiquitin-like proteases) die spezifisch für z.B. SUMO (small ubiquitin-like modifier) sind (LI et al., 2000). DUBs hydrolysieren die Isopeptidbindungen zwischen Ubiquitin und dem Substrat. Die Cysteinproteasen verfügen über ein aktives Zentrum, welches aus einer katalytischen Triade aus Cys, His und einer dritten AS, zumeist Asp oder Asn besteht. Nachdem es gelungen war, die Gene für Ub und Ub-ähnliche Moleküle zu identifizieren wurde es offensichtlich, dass alle Mitglieder der Ub-Familie als Proproteine synthetisiert und dann prozessiert werden, um ihr C-terminales Dipeptid Glycylglycin, aber nicht Ub selbst, freizusetzen (JENTSCH et al., 2000). Daher werden DUBs als Proteasen definiert, die am C-Terminus von Ub oder Ub-ähnlichen Molekülen angreifen, um die Konjugation rückgängig zu machen oder um Proproteine zu prozessieren. NIJMAN et al. (2005) kamen in einer Studie zu dem Ergebnis, dass das menschliche Genom für ca. 95 DUBs codiert, darunter 58 USP's, je 14 OTU's und JAMM's, 4 UCH's und 5 MJD's. Die einzelnen DUB-Familien unterscheiden sich dabei in ihrer Substratspezifität und ihrer Lokalisation. So können UCHs, die erste DUB-Familie, die entdeckt wurde, beispielsweise die Isopeptid-bindungen zwischen den einzelnen Ubs innerhalb einer Polyubiquitinkette nicht spalten. UCHs sind aber sehr effektiv im Prozessieren von primären Genprodukten, wie den Vorläufer Proubiquitin, zwecks Freilegung des terminalen Gly-Gly-Motivs (DANG et al., 1998) und im Abspalten von kleinen Addukten vom C-Terminus des Ub. Alle UCHs verfügen über eine hochkonservierte katalytische Triade im aktiven Zentrum, die aus Cys, His sowie Asp besteht und die essentiell für ihre Funktionen ist. USPs wurden als zweite DUB-Familie entdeckt und stellen die größte Gruppe der Deubiquitinasen. Aufgrund dessen ist auch die Anzahl ihrer potentiellen Substrate wesentlich höher als die der UCHs. Des Weiteren sind sie im allgemeinen größer und variabler, was die Größe betrifft. Ihr Molekulargewicht schwankt zwischen 50 und 300 kDa, während UCHs für gewöhnlich nur aus einem katalytischen Kern bestehen, der ein Molekulargewicht von ca. 25 kDa aufweist und aus ca. 230 AS zusammen-gesetzt ist. USPs sind zudem in der Lage Polyubiquitinketten zu spalten (WING et al., 2003). Katalytisch gesehen ähneln sie den UCHs, denn auch sie nutzen eine katalytische Triade, die aus Cys im aktiven Zentrum sowie His und Asp besteht.

Die Faltung der USPs ähnelt einer Hand und besteht aus drei Untereinheiten: dem Finger, der Handfläche sowie dem Daumen. Einzige bekannte Ausnahme ist hierbei Cylindromatosis (CYLD), dem die Finger-Subeinheit fehlt (KOMANDER et al., 2008). Die OTUs wurden erst 2002 entdeckt und die OTU-Domäne ursprünglich in einem ovarialem Tumorprotein von Drosophila melanogaster identifiziert. Die katalytische Triade besteht hier aus hochkonservierten katalytischen Cys und His sowie wahr-scheinlich Asp (NIJMAN et al., 2005). Nicht alle OTU-Domänen besitzen Deubiquitinaseaktiviät, so das ovariale Tumorprotein selbst, das anstatt eines Cys ein katalytisch inaktives Ser im aktiven Zentrum hat.

Die JAMM-Isopeptidasen sind die erste DUB-Familie, die keine Cysteinproteasen darstellen. Ihre Aktivität bezieht sich auf ihr JAMM-Motiv innerhalb der JAMM-Domäne. Dabei binden zwei His und ein Asp an ein Zinkion, um anschließend durch Polarisierung eines gebundenen Wassermoleküls katalytische Aktivität zu erlangen. Ein Glu dient zusätzlich als genereller Säuren/Basen-Katalysator.

Darüber hinaus haben auch Viren (SULEA et al., 2005) und Bakterien (CATIC et al., 2007) verschiedene DUBs entwickelt bzw. sich angeeignet, höchstwahrscheinlich um im Rahmen ihrer Virulenz in die zellulären Prozesse ihrer Wirtsorganismen einzu-greifen. Strukturell haben diese wenig mit den menschlichen DUBs gemeinsam.

1.2.1 Mechanismus der Deubiquitinierung

Alle DUBs haben gemein, dass sie den C-Terminus von Ub erkennen und an diesem angreifen. Die Erkennung verläuft über einen negativ geladenen Spalt in ihrer katalytischen Domäne. Ub und Ub-ähnliche Moleküle besitzen ein C-terminales Gly-Gly-Motiv und dessen Spaltung durch DUBs hinterlässt eine sogenannte Leaving Group, die an die Carboxylgruppe des C-terminalen Gly gebunden ist. Die Deubiquitinierungsreaktion beginnt mit einem nukleophilen Angriff auf das katalytische Cys der Carboxylgruppe der zu spaltenden Bindung. Dies wird in eine Acyl-Enzym-Zwischenstufe umgewandelt und der Angriff eines Wassermoleküls führt zur Regeneration des freien Thiols am Cys und zur Freisetzung des Ub. Ub-Substrat-Komplexe, die kein C-terminales Gly-Gly-Motiv besitzen, werden nicht gespalten (JOHNSON et al., 1995). Wie in Kapitel 1.4 beschrieben, verfügen DUBs auch über Ub-bindende Domänen, die mit der hydrophoben Tasche des Ub interagieren.

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