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Titel: Kontinuierliches Monitoring von Glukose, Laktat und Ammonium mit 'Bioanalytischen Mikrosystemen'

Kontinuierliches Monitoring von Glukose, Laktat und Ammonium mit 'Bioanalytischen Mikrosystemen'

von Barbara Enderle (Autor:in)
©2002 Doktorarbeit / Dissertation 146 Seiten
Medizin - Biomedizinische Technik

Zusammenfassung

Inhaltsangabe:Einleitung:
Biochemische Parameter für die Diagnose physiologischer Abnormitäten werden normalerweise in diskreten Proben analysiert, wobei die biochemische Analyse gewöhnlich in medizinischen Laboren mit spezifischen, meist sehr teuren Geräten durchgeführt wird.
Hierbei geht vom Zeitpunkt der Probennahme bis zum Vorliegen des Untersuchungsergebnisses für Mediziner und Patienten oft wertvolle Zeit verloren. Außerdem können lange Standzeiten der Proben das Ergebnis verfälschen.
Die Entwicklung von Analysemethoden, die ein kontinuierliches Monitoring von Körperflüssigkeiten in der Klinik oder zu Hause ermöglichen, ist daher von großem Interesse für die klinische Diagnostik. Sie ermöglichen die Erfassung von Messwert-Änderungen innerhalb kurzer Zeitintervalle, die bei der Gewinnung diskreter Proben übersehen werden könnten.
Der Einsatz von Biosensoren, gekoppelt mit einem miniaturisierten, kontinuierlichen Probennahme-System liefert realisierbare und kostengünstige Voraussetzungen für ein reproduzierbares „on-line-bedside“ Analyse-System. Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.Einleitung1
1.1Biosensoren1
1.2Monitoring-Systeme zur Bestimmung metabolischer Stoffwechsel-Parameter5
1.3Stand der Technik5
1.3.1Implantation von Biosensoren5
1.3.2Kontinuierliche Probennahme-Systeme6
1.4Anwendungsbereiche der Mikrodialyse9
1.5In-vivo Recovery unter Anwendung der Mikrodialyse10
1.5.1No-net-flux-Methode10
1.5.2Zero-flow-Methode,11
1.5.3Near-Equilibrium-Dialyse11
1.6Diabetes mellitus12
1.6.1Der Typ I Diabetes12
1.6.2Der Typ II Diabetes12
1.6.3Komplikationen und Spätfolgen des Diabetes mellitus13
1.7Hyperammonämie14
1.7.1Harnstoffzyklus14
1.8Ziel der Arbeit16
2.Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe18
2.1Material19
2.1.1Chemikalien19
2.1.2Pufferlösungen19
2.1.3Geräte20
2.1.4Verbrauchsmaterial20
2.2Methoden21
2.2.1Bioanalytisches Mikrosystem21
2.2.2Mikrodialyse28
2.2.3Kombination der Mikrodialyse mit dem „Bioanalytischen Mikrosystem“29
2.2.4Referenzmessung mit dem CMA-600-Analysator30
2.2.5Bestimmung des technischen Delays der Glukose- und Laktatmessung32
2.2.6Bestimmung der Wiederfindungsrate des Analyten (Recovery) unter Einsatz des CMA-70 Mikrodialyse-Katheters33
2.2.7Monitoring von Glukose- und Laktat im subkutanen Gewebe und Bestimmung der Plasmawerte35
3.Ergebnisse37
3.1Kalibration der Sensoren37
3.2Bestimmung des technischen Delays für Glukose und Laktat39
3.2.1Berechnung des technischen […]

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis


Barbara Enderle
Kontinuierliches Monitoring von Glukose, Laktat und Ammonium mit 'Bioanalytischen
Mikrosystemen'
ISBN: 978-3-8366-2792-4
Herstellung: Diplomica® Verlag GmbH, Hamburg, 2009
Zugl. Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Freiburg im Breisgau, Deutschland,
Dissertation / Doktorarbeit, 2002
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© Diplomica Verlag GmbH
http://www.diplomica.de, Hamburg 2009
Danksagung
III
Diese Arbeit entstand im Rahmen eines gemeinsamen Projektes des Lehrstuhls für Sensoren
des Instituts für Mikrosystemtechnik (IMTEK) und der Universitäts-Kinderklinik der Albert-
Ludwigs-Universität Freiburg.
Ich möchte mich daher bei der Leitung und den Mitarbeitern beider Projektpartner bedanken,
die mich bei der Fertigstellung der Dissertation direkt oder indirekt unterstützt haben.
Herrn Prof. Dr. Gerald A. Urban danke ich für die Überlassung des Themas und die
hilfreichen Anregungen bei der Durchführung dieser Arbeit, die in seinen modernst
ausgestatteten Laborräumen des Lehrstuhls Sensoren durchgeführt werden konnte.
Besonders hilfreich war hierbei auch die technologische Infrastruktur des Instituts für
Mikrosystemtechnik (IMTEK).
Im Besonderen danke ich Frau Dr. Isabella Moser für ihre Unterstützung und die intensive
Betreuung der Arbeit sowie für die kritische Überarbeitung des schriftlichen Dokumentes.
Herrn Gerhard Jobst danke ich für seine tatkräftige Unterstützung in allen technischen
Fragestellungen und für seine hilfreichen Diskussionsbeiträge.
Herrn Priv. Doz. Dr. Otfried Schwab von der Universitäts-Kinderklinik danke ich für die
medizinische Unterstützung bei der Durchführung der in-vivo Untersuchungen und für die
Übernahme des Korreferates.
Herrn Cecil-Varna Cannan und Fr. Dr. Frederike Kienzle danke ich für die medizinische
Betreuung der in-vivo Versuche sowie für die Bereitstellung der Plasmaproben als
Referenzwerte.
Herrn Dr. Hans Seydewitz danke ich für die Messung von Kalium im klinischen Labor der
Universitäts-Kinderklinik.
Des Weiteren möchte ich mich bei den Kollegen Markus Müller sowie Miguel Martinéz für
ihre bereitwillige Assistenz bei der Durchführung verschiedener Versuche bedanken.
Herrn Daniel Armbruster danke ich für das Korrekturlesen der schriftlichen Arbeit sowie für
die Unterstützung bei der Lösung von Computer-Fragen.
Schließlich gilt mein besonderer Dank meinem Lebensgefährten, der mir die Durchführung
der Arbeit durch seine liebevolle Betreuung unserer beiden Kinder ermöglichte.
Zusammenfassung
IV
Ziel der Doktorarbeit war es, möglichst schmerzfreie Monitoring-Verfahren zu entwickeln
und entsprechende Probennahme-Systeme mit bioanalytischen Techniken zu kombinieren, um
ein kontinuierliches Monitoring klinisch relevanter Metaboliten wie Glukose, Laktat und
Ammonium bei stoffwechselkranken Kindern zu etablieren.
Ein kontinuierliches und simultanes Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen
Gewebe konnte durch die Kombination der "Mikrodialyse" als Probennahme-System mit
einem "Bioanalytischen Mikrosystem" mit integrierten Biosensoren als Analysemethode
ermöglicht werden. Durch den Einsatz des CMA-70 Mikrodialyse-Katheters, der ursprünglich
für neurologische Untersuchungen entwickelt wurde, ist eine minimal-invasive Probennahme
ohne lokale Anästhesie möglich. Bei einer Flussrate von 0,3
µ
l pro Minute konnte in-vitro
eine Wiederfindungsrate (in-vitro Recovery) für Glukose von nahezu 100 % erzielt werden.
Sie ist definiert als die relative Konzentration des Analyten im Dialysat bezogen auf dessen
Konzentration in der untersuchten Lösung. Die Wiederfindungsrate des untersuchten
Analyten im Verlaufe einer in-vivo Messungen (relative Recovery) ist definiert als die
relative Konzentration des Analyten im Dialysat bezogen auf dessen Konzentration im
Plasma. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Recovery von Glukose im subkutanen
Fettgewebe, in Abhängigkeit vom Körpermassen-Index (BMI) der untersuchten Probanden,
stark variiert. Die relative Recovery von Glukose im subkutanen Gewebe nimmt mit
zunehmendem BMI der Probanden ab. Wird jedoch der Quotient des Glukosegehalts im
Plasma und im subkutanen Gewebe gebildet, so zeichnet sich sowohl bei den schlanken als
auch bei den adipösen Probanden, für die Messzeit von bis zu sechs Stunden, ein relativ
stabiler Verlauf der Kurve ab. Der Quotient liegt bei schlanken Probanden (n=4) im Mittel bei
1,1
±
0,08, während er bei adipösen Probanden (n=4) im Bereich von 3,65
±
0,44 liegt.
Sowohl die Höhe als auch der Verlauf des Quotienten Plasma/subkutanes Gewebe geben
Aufschluss über die Versorgung des Gewebes und den Metabolismus von Glukose. Ein relativ
stabiler Quotient im Verlaufe einer Untersuchung hat zur Folge, dass die gemessenen
Glukosewerte im subkutanen Gewebe repräsentativ die Situation im Plasma widerspiegeln.
Durch eine in-vivo Kalibration des Sensorsignals unter konstanten Bedingungen kann
demzufolge von den Messwerten in subkutanen Gewebe, unabhängig von der relativen
Recovery, auf die realen Glukosewerte im Plasma geschlossen werden.
Die Erhöhung von Laktat im subkutanen Gewebe nach Glukose-Einnahme zeigt, dass Laktat
nicht nur im Muskel, sondern auch im subkutanen Fettgewebe produziert wird und
demzufolge eine bedeutende Rolle bei der Glukosehomöostase im Körper übernimmt.
Eine gute Korrelation der Ergebnisse mit der Referenzmethode (CMA-Analysator) spricht für
die Stabilität und die Zuverlässigkeit der Sensoren und ermöglicht den Einsatz des
gekoppelten Systems in der medizinischen Forschung sowie in der klinischen Diagnostik.
Die Bestimmung von Ammonium mit einem "Bioanalytischen Mikrosystem", welches in
einem tragbaren Analysator mit Computer gesteuerten Spritzenpumpen integriert ist,
ermöglicht ein "bedside-monitoring" von Ammonium im Parotisspeichel.
Durch die Integration der Probenumwandlung und der Detektion des Analyten im
"Bioanalytischen Mikrosystem" wird eine Reduktion des erforderlichen Reagenzien- und
Probenvolumens ermöglicht und die Zuverlässigkeit der durchgeführten Analyse erhöht.
Der Einsatz einer transparenten Sammelvorrichtung "Curby-Cup" zur non-invasiven
Gewinnung von Parotisspeichel ermöglicht eine schmerzfreie Probensammlung direkt aus
der Glandula-Parotis.
Zusammenfassung
V
Untersuchungen zur Flussratenabhängigkeit des Ammoniumgehalts im Parotisspeichel und
dessen Vergleich mit dem Verhalten von Kalium weisen auf unterschiedliche
Transportmechanismen der beiden einwertigen Ionen hin. Während sowohl Ammonium als
auch Kalium bei Flussraten unter 0,2 ml/min mit steigender Flussrate und steigendem
Probenvolumen abnehmen, erreicht Kalium bei Flussraten
0,2 ml einen konstanten Wert
von 23,50
±
3,03 mM, der Ammoniumgehalt sinkt dagegen mit zunehmender Flussrate
weiterhin ab. Erst bei einer Flussrate
0,6
µ
l/min erhält man einen relativ stabilen Wert von
61,80
±
13,34 der sich allmählich dem Plasmawert nähert.
Kalium, das im Parotisspeichel um einen Faktor von 5,8 über dem in der Literatur
angegebenen Plasmawert (4,03 mM) liegt, wird offensichtlich aktiv in den Speichel
transportiert, während Ammonium einem passiven Transport unterliegt.
Kalium kann somit nicht als interner Standard (zur Bestimmung der Flussrate) bei der
Ammoniummessung eingesetzt werden. Eine gute Korrelation des Ammoniumgehalts im
Parotisspeichel und im Plasma kann offensichtlich nur erzielt werden, wenn eine hohe
Flussrate von bis zu 1 ml/min erreicht und die zuerst gesammelte Speichelprobe verworfen
wird.
Die Durchführung eines "oralen Aminosäure-Toleranz-Testes" (oATT) bei gesunden
Probanden zeigt jedoch auch bei hohen Flussraten keine sehr gute Korrelation. Dies kann
dadurch erklärt werden, dass der Ammoniumgehalt im Plasma, durch die Aktivität der Leber
konstant niedrig gehalten wird, während er im Speichel durch den erhöhten Abbau des in der
Leber produzierten und ins Blut abgegebenen Harnstoffs ansteigt. Eine gute Korrelation von
Ammonium im Parotisspeichel und im Plasma ist jedoch zu erwarten, wenn eine
vergleichbare Untersuchung bei stoffwechselkranken Patienten durchgeführt wird, da in
diesem Falle ein Ammonium-Anstieg im Plasma, der durch die verminderte Aktivität des
Harnstoffzyklus in der Leber verursacht wird, voraussichtlich auch mit einem Anstieg des
Ammoniumgehalt im Speichel korreliert ist.
Abstract
VI
Continuous and simultaneous monitoring of glucose and lactate in subcutaneous adipose
tissue has been realised through the combination of microdialysis with a "bioanalytical
microsystem".
The application of a small microdialysis catheter enables a minimum invasive sampling of the
probe without anesthetization.
At a flow rate of 0.3
µ
l per minute an "in-vitro Recovery" of about 100 % was reached.
However, the "relative Recovery" of glucose in subcutaneous adipose tissue, defined as the
relative concentration of the analyte in the dialysate based to the concentration in plasma,
depends on the body-mass-index (BMI) of the volunteers.
The level and the course of the quotient from plasma glucose to glucose in subcutaneous
tissue gives an insight into the different supply and metabolism of glucose in the tissue.
If this quotient is stable through the whole investigation, the measured glucose concentration
at the subcutaneous tissue reflects the situation in plasma. In this case it will be possible to
make an "in-vivo calibration" of the glucose sensor to conclude the real concentration of
glucose in plasma independent to the "relative Recovery".
The rise of lactate concentration in subcutaneous tissue after glucose ingestion indicates that
lactate will be not only produced in muscle but also in subcutaneous adipose tissue, where it
plays an important role in glucose homoeostasis.
There was a very good correlation of the sensor results and the results of a reference methode,
which reflects the high reliability and stability of the sensors, and enables the application of
the "bioanalytical microsystem" in medical research and clinical diagnosis.
The detection of ammonia with a "bioanalytical microsystem" which is integrated in a
portable analyser with computer controlled syringe pumps enables a bedside monitoring of
ammonia in parotid saliva.
The integration of conversion of the probe and its detection with a biosensor within the
"bioanaytical microsystem" enables the reduction of reagent- and sample volume to 10 % of
the volume necessary for the reference method and improves the reliability of the analysis.
To evaluate a non-invasive painless method for the determination of ammonia in parotid
saliva a transparent collection device "curby-cup" was used to collect the sample directly
from the parotid gland.
Ammonia in parotid saliva is flow-dependent, it decreases at flow rates < 0,6 ml/min with
increasing flow rates and approximate plasma levels at flow rates of about 1 ml/min.
The ammonia content of saliva also decreases with the increase of the collected sample
volume. To find a correlation of ammonia in plasma and parotid saliva it is therefore
necessary to obtain a high flow rate and to discard the first collected probe before analysis.
It has been concluded that saliva should be collected at flow rates greater than 1 ml/min and
that the first probe (about 3 ­ 4 ml) should be discarded, to obtain marginal variation of
ammonia concentration which approximates to plasma ammonia.
The content of potassium in parotid gland is also flow dependent, but it becomes constant at
flow rates
0,2 ml/min and it does not reach plasma values. This results show that the
transport mechanisms of ammonia and potassium are different and that potassium could not
be used as an internal standard for the flowdependent measurement of ammonia.
At the performance of an "oral amino-acid-tolerance-test" (OATT) with healthy volunteers,
the ammonia level in plasma will be low, whereas the content in saliva increases on account
of the increase of urea and its biodegradation.
It is assumed that at patients with liver desease or urea cycle disorder a correlation between
plasma ammonia and ammonia in saliva will be found after increasing the amino acid
metabolim.
Inhaltsverzeichnis
VII
1.
Einleitung ...1
1.1 Biosensoren ... 1
1.2 Monitoring-Systeme zur Bestimmung metabolischer Stoffwechsel-Parameter ... 5
1.3 Stand der Technik ... 5
1.3.1.
Implantation von Biosensoren... 5
1.3.2
Kontinuierliche Probennahme-Systeme... 6
1.4 Anwendungsbereiche der Mikrodialyse... 9
1.5 In-vivo Recovery unter Anwendung der Mikrodialyse ... 10
1.5.1
No-net-flux-Methode ... 10
1.5.2.
Zero-flow-Methode
,
... 11
1.5.3
Near-Equilibrium-Dialyse... 11
1.6 Diabetes
mellitus ... 12
1.6.1
Der Typ I Diabetes... 12
1.6.2
Der Typ II Diabetes... 12
1.6.3
Komplikationen
und
Spätfolgen des
Diabetes mellitus ... 13
1.7 Hyperammonämie ... 14
1.7.1
Harnstoffzyklus... 14
1.8 Ziel der Arbeit ... 16
2.
Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe ..18
2.1 Material ... 19
2.1.1
Chemikalien ... 19
2.1.2
Pufferlösungen ... 19
2.1.3
Geräte... 20
2.1.4
Verbrauchsmaterial ... 20
2.2 Methoden... 21
2.2.1
Bioanalytisches Mikrosystem ... 21
2.2.2
Mikrodialyse ... 28
2.2.3
Kombination der Mikrodialyse mit dem "Bioanalytischen Mikrosystem"... 29
2.2.4
Referenzmessung mit dem CMA-600-Analysator... 30
2.2.5
Bestimmung des technischen Delays der Glukose- und Laktatmessung ... 32
2.2.6
Bestimmung der Wiederfindungsrate des Analyten (Recovery) unter Einsatz des
CMA-70 Mikrodialyse-Katheters ... 33
2.2.7
Monitoring von Glukose- und Laktat im subkutanen Gewebe und Bestimmung der
Plasmawerte ... 35
Inhaltsverzeichnis
VIII
3.
Ergebnisse...37
3.1 Kalibration
der
Sensoren... 37
3.2 Bestimmung des technischen Delays für Glukose und Laktat... 39
3.2.1
Berechnung des technischen Delays der Sensorergebnisse ... 39
3.2.2
Berechnung des technischen Delays der CMA-Ergebnisse ... 40
3.2.3
Experimentelle Bestimmung des technischen Delays der Sensordaten ... 41
3.3 Bestimmung der relativen Recovery... 42
3.3.1. Relative Recovery in-vitro in Abhängigkeit von der Flussrate... 42
3.3.2
Relative Recovery in-vitro bei konstanter Flussrate ... 43
3.3.3
Bestimmung der in-vivo Recovery mit der "zero-flow-Methode" ... 45
3.4 Bestimmung von Glukose im subkutanen Gewebe und im Plasma ... 47
3.4.1
Physiologisches Delay der Glukosemessung im subkutanen Gewebe... 47
3.4.2
Relative Recovery der mit dem Sensor ermittelten Glukosewerte im subkutanen
Gewebe bezogen auf die Plasma-Glukose-Werte ... 48
3.4.3
Kinetik der Plasmawerte im Vergleich zu den Sensor Ergebnissen ... 49
3.4.4
Quotient Plasmaglukose zu Glukose im subkutanen Gewebe ... 50
3.4.5
Korrelation der relativen Recovery mit dem BMI der Probanden ... 50
3.5 Simultane Bestimmung von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe... 51
3.5.1
Korrelation der Sensorergebnissen mit den Plasmawerten... 52
3.5.2
Korrelation der Sensorergebnisse mit der Referenzmethode... 53
3.6 Vergleich der Glukosemessung abdominal und antebrachial ... 55
3.6.1
In-vitro Assay zur Untersuchung der Fluidikprobleme bei Messungen von Glukose
im subkutanen antebrachialen Gewebe... 56
4.
Diskussion...58
5.
Etablierung einer non-invasiven Ammoniakmessung im
Speichel und dessen Bestimmung mit einem Glutamatsensor .63
5.1 Material ... 66
5.1.1
Chemikalien ... 66
5.1.2
Pufferlösungen ... 67
5.1.3
Geräte... 68
5.1.4
Verbrauchsmaterial ... 68
Inhaltsverzeichnis
IX
5.2 Methoden... 69
5.2.1
Amperometrische Bestimmung von Ammonium mit dem Glutamatsensor ... 69
5.2.2
Ammonium-Assay ... 70
5.2.3
Absorptionsspektrum des Co-Enzyms NADPH ... 71
5.2.4
Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor... 72
5.2.5
Spritzenpumpen ... 75
5.2.6
Gewinnung von Parotisspeichel... 82
6.
Ergebnisse...83
6.1 Absorptionsspektren des Co-Enzyms NADPH... 83
6.2. Bestimmung der GLDH-Aktivität mit dem Photometer... 84
6.2.1
Kalibration der GLDH mit dem Photometer... 86
6.3 Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor ... 87
6.3.1
Flussratenabhängigkeit des Glutamatsensors... 87
6.3.2
Einfluss von 2-Oxoglutarat auf den Glutamatsensor ... 88
6.3.3
Effekt von 2-Oxoglutarat auf die GLOD-Aktivität... 89
6.3.4
Variation von 2-Oxoglutarat im Photometer-Assay... 90
6.3.5
Variation von NADPH im Photometer-Assay ... 92
6.3.6
Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der GLDH-Aktivität ... 93
6.4 Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor unter Einsatz der
Spritzenpumpen ... 95
6.4.1
Berechnung des Totvolumens der Messapparatur ... 95
6.4.2
Verschleppungen von Glutamat im Sensor... 98
6.4.3
Verschleppung der Glutamat-Dehydrogenase im Messsystem... 98
6.4.4
Präzisionstest der Spritzenpumpen ... 99
6.5 Vergleich des Ammonium-Assays innerhalb und außerhalb des
Mikrosystems... 102
6.5.1
Ammoniumkalibration innerhalb des Mikrosystems ... 102
6.5.2
Ammoniumkalibration im Reagenzglas... 102
6.6 Einfluss von endogenem Glutamat auf den Ammonium-Assay... 103
6.6.1
Einfluss von endogenem Glutamat auf den Photometer-Assay ... 104
6.6.2
Einflusses von endogenem Glutamat auf den Sensor-Assay ... 105
6.7 Reproduzierbarkeit
des
Ammonium-Assays ... 107
6.8 Bestimmung der Wiederfindungsrate von Ammonium im Sensor-Assay... 108
6.9 Korrelation der Sensorergebnisse mit der Referenzmethode... 109
Inhaltsverzeichnis
X
6.10 Evaluierung einer möglichen Korrelation von Ammonium im Speichel
und im Plasma... 110
6.10.1
Ammoniumgehalt der Speichel- und Plasmaproben... 111
6.10.2
Ammonium-und Kaliumgehalt des Parotisspeichels in Abhängigkeit
von der Flussrate ... 112
6.10.3
Vergleich von Ammonium und Kalium im Parotisspeichel ... 114
6.10.4
Korrelation des Ammoniumgehalts im Speichel und im Plasma... 115
6.10.5
Ammonium- und Kaliumgehalt im Parotisspeichel in Abhängigkeit von der
Flussrate und der gesammelten Probenmenge ... 116
7.
Diskussion...118
8.
Kapitel-übergreifende Diskussion und Ausblick...121
9.
Anhang...123
9. 1 Abkürzungen und Symbole... 123
9.2 Zusammensetzung der beim oralen-Aminosäure-Toleranz-Test eingesetzten
Aminosäuremischung der SHS-Gesellschaft ... 124
9.3 Massenwirkungsgesetz... 125
10.
Literatur ...126
1
1. Einleitung
Biochemische Parameter für die Diagnose physiologischer Abnormitäten werden
normalerweise in diskreten Proben analysiert, wobei die biochemische Analyse gewöhnlich in
medizinischen Laboren mit spezifischen, meist sehr teuren Geräten durchgeführt wird.
Hierbei geht vom Zeitpunkt der Probennahme bis zum Vorliegen des Untersuchungs-
ergebnisses für Mediziner und Patienten oft wertvolle Zeit verloren. Außerdem können lange
Standzeiten der Proben das Ergebnis verfälschen.
Die Entwicklung von Analysemethoden, die ein kontinuierliches Monitoring von
Körperflüssigkeiten in der Klinik oder zu Hause ermöglichen, ist daher von großem Interesse
für die klinische Diagnostik. Sie ermöglichen die Erfassung von Messwert-Änderungen
innerhalb kurzer Zeitintervalle, die bei der Gewinnung diskreter Proben übersehen werden
könnten.
Der Einsatz von Biosensoren, gekoppelt mit einem miniaturisierten, kontinuierlichen
Probennahme-System liefert realisierbare und kostengünstige Voraussetzungen für ein
reproduzierbares "on-line-bedside" Analyse-System.
1.1 Biosensoren
Ein Biosensor besteht im Wesentlichen aus zwei Komponenten, einem biologischen Rezeptor,
der die spezifische Erkennung des Analyten ermöglicht, sowie einem Signalwandler, dem
Transducer. Beide Elemente zusammen ergeben den Biosensor
1,2
.
Die Biokomponente bestimmt die Selektivität des Sensors, die entweder auf einer Affinität
zum Analyten (Antikörper), oder aber auf einer katalytischen Umsetzung des Analyten durch
Enzyme beruht
3
.
Das dadurch entstehende Signal wird auf einen "Transducer" übertragen, der die Wandlung
des Signals in eine physikalisch messbare Größe ermöglicht.
Als "Transducer" kommen optische, elektrochemische, mechanische oder kaloriemetrische
Technologien zur Anwendung
4
.
Abb. 1 Schematische Darstellung eines Biosensors
Rezeptor!
!
!
!
Transducer
Messwert-
ausgabe
Elektronik
Rezeptor Transducer
Analyt
Chemisches oder
physikalisches Signal
Signal-
Verarbeitung
Messwert-
ausgabe
Elektronik
Rezeptor Transducer
Analyt
Chemisches oder
physikalisches Signal
Signal-
Verarbeitung
Messwert-
ausgabe
Elektronik
Rezeptor Transducer
Analyt
Chemisches oder
physikalisches Signal
Signal-
Verarbeitung
Einleitung
2
Eingesetzte Komponenten zur Herstellung von Biosensoren
5
Biokomponente
Eigenschaften
Reaktion
Lieferant
Gewinnung
Enzyme
hohe Spezifität
Katalyse
Pilze, Bakterien
und Tiere
Relativ günstig
herzustellen
Antikörper
sehr hohe Spezifität
Bindung eines
Antigens
immunisiertes
Serum
Isolierung oft sehr
aufwendig
Nukleinsäuren
sehr hohe Spezifität
komplementäre
Bindung
Oligonukleotide
synthetische
Herstellung
Gewebe
oft unspezifisch
Katalyse
Früchte,
tierische Organe
nicht aufwendig,
billig
Mikroorganismen
oft unspezifisch
Katalyse,
Wachstum
Bakterien-Kulturen
leicht und billig zu
gewinnen
Tab. 1 Biokomponenten zur Herstellung von Biosensoren
Die meisten in der Literatur beschriebenen Biosensoren beruhen auf einer enzymatischen
Katalyse des Analyten. Die Enzyme können aus Mikroorganismen wie Pilzen und Bakterien
gewonnen und aufgereinigt werden
6
.
Meist setzt das entsprechende Enzym nur den Analyten um, einige Enzyme benötigen jedoch
eine weitere Komponente, ein sogenanntes Co-Substrat. Bei diesen Reaktionen kann entweder
die Zu- bzw. Abnahme eines Produktes oder aber die Zu- bzw. Abnahme des Co-Substrates
detektiert werden.
Die Wahl des Detektors ist abhängig von deren Sensitivität sowie der Anwesenheit störender
Substanzen in der zu analysierenden Matrix.
Am häufigsten werden optische- und elektrochemische "Transducer" eingesetzt. Optische
Methoden haben, durch das spezifische Absorptionsverhalten verschiedener Analyten oder
Co-Substrate, den Vorteil hoher Selektivität, während die Sensitivität limitiert ist.
Elektrochemische Sensoren zeigen dagegen eine sehr hohe Sensitivität, hier stellen jedoch
Störungen durch Interferenzmoleküle ein Problem dar, das durch Modifikation der Elektroden
reduziert werden kann
7
.
Die Detektion eines Analyten durch elektrochemische Sensoren kann entweder
potentiometrisch, konduktometrisch oder amperometrisch erfolgen:
Bei der potentiometrischen Messung wird die Änderung des Potentials einer Probenlösung
ohne Stromfluss bestimmt
8
, während bei der konduktometrischen Messung die Änderung der
Leitfähigkeit bestimmt wird
9
.
Beim Einsatz von amperometrischen Biosensoren wird die zu detektierende Substanz direkt
10
oder über Mediatoren
11,12
an inerten Elektroden umgesetzt und so ein elektrischer Strom
generiert, welcher in bekannter Relation zur Analytkonzentration steht. Die Amperometrie
beruht auf der Messung eines bei konstantem Potential generierten Stromes an der
Arbeitselektrode
13
. Der Strom resultiert aus einer elektrochemischen Oxidation oder
Reduktion einer elektroaktiven Spezies.
Biosensoren
3
Abb. 2 Vereinfachte Darstellung eines Potentiostaten für eine Drei-Elektroden-Konfiguration nach A.Cass
14
Zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode, die den Stromkreis schließt, wird das für die
gewünschte Reaktion erforderliche Potential angelegt.
Eine dritte, potentiometrisch (d.h. ohne Stromfluss) betriebene Referenzelektrode mit
konstantem Potential kontrolliert den Betrag der Potentialdifferenz zwischen Arbeitselektrode
und Messlösung. Die elektronische Schaltung, die als Potentiostat bezeichnet wird, regelt nun
die zwischen Arbeits- und Gegenelektrode angelegte Spannung auf einen Wert, bei dem die
gemessene Potentialdifferenz zwischen Arbeits- und Referenzelektrode dem vorgegebenen
Wert entspricht.
Biosensoren sind im Vergleich zu klassischen analytischen Messgeräten kompakte und
mobile Analysesysteme, die eine preisgünstige, schnelle und kontinuierliche Erfassung
verschiedener Parameter vor Ort ermöglichen.
Der Bedarf an biochemischen Sensoren wächst ständig. Dabei stehen Anwendungen in der
Medizin
15,16
, der Biotechnologie
17,18
sowie im Umweltbereich
19
und in der Lebensmittel-
Analytik
20
im Vordergrund.
Der derzeit am meisten untersuchte physiologische Parameter ist Glukose, das im Mittelpunkt
der Diabetesforschung steht.
Laktat ist ein biochemischer Indikator des anaeroben Metabolismus von Patienten. Es besteht
eine negative Korrelation zwischen der Laktatkonzentration im Blut und der
Sauerstoffversorgung
21
. Durch Zunahme der Glykolyse verbunden mit Sauerstoffmangel
kommt es zur Erhöhung des Laktats im Gewebe und im Blut, Laktat ist daher ein interessanter
Parameter für die Sportmedizin, außerdem ist Laktat bei der Diagnose von Infarkten und
Schock von großem Interesse
22,23,24
. Durch das Monitoring von Laktat ist die frühzeitige
Erkennung eines Sauerstoffdefizits im Gewebe und damit eine präventive Intervention
möglich
25
. Laktat steigt bei erhöhter Ketoazidose diabetischer Patienten, durch verstärkte
NADH-Freisetzung, bei verstärkter Verstoffwechslung von Fettsäuren, ebenfalls an
26
.
I=0
I
Arbeitselektrode
Referenzelektrode
Gegenelektrode
A = Ampere
V = Volt
I = Strom
V
A
Einleitung
4
Der erste Glukosesensor wurde 1962 von Clark et al.
27
entwickelt. Das hier realisierte
Messprinzip beruht auf der Messung der Sauerstoffabnahme, welcher als Co-Substrat der
Glukose-Oxidase fungiert. Die Reduktion von O
2
erfolgt hierbei bei einem konstanten
Potential von ­ 0,7 Volt. Später wurde die Glukosekonzentration eines Analyten durch das
Monitoring des bei dessen Oxidation gebildeten Wasserstoffperoxids bestimmt
28
.
Ein kontinuierliches und zuverlässiges Monitoring von Glukose, Laktat und anderen
wichtigen metabolischen Parametern wie Glutamin, Glutamat und Ammonium sind von
großer Bedeutung für die medizinische Diagnostik und stellen eine große Herausforderung für
Forschungsgruppen und Mediziner dar.
Für Patienten mit Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes mellitus oder Harnstoffzyklus-
Störungen würde der Einsatz von miniaturisierten und kontinuierlich messenden
Analysegeräten zu Hause eine enorme Verbesserung der Lebensqualität bedeuten.
Voraussetzung dafür ist jedoch ein kontinuierlicher Kontakt des Sensors mit der Matrix, was
mit zwei verschiedenen Methoden erreicht werden kann:
-
eine direkte Messung der entsprechenden Parameter innerhalb des Körpers durch die
Implantation eines Sensors
-
die Kombination eines biokompatiblen, kontinuierlichen Probenahme-Systems mit
dem Analysesystem
Ein direkter Einsatz von Sensoren im Blut kann zur Agglutination des Blutes führen, während
es in anderen Kompartimenten zu Wundreaktionen und Entzündungen kommen kann
29
.
Außerdem ist eine Messung der absoluten Konzentration des interessierenden Analyten über
einen längeren Zeitraum nicht zuverlässig, da eine "in-vivo Kalibration" des Sensors nicht
möglich und eine Änderung der Sensitivität des Sensors sowie eine Drift des Nullpunkts nicht
auszuschließen ist
30
.
Um derartige Komplikationen zu vermeiden, wird in der folgenden Arbeit die Mikrodialyse
als bindendes Glied zwischen dem Körper und dem Sensor eingesetzt. Das Material dieses
Systems ist biokompatibel und schließt durch eine semipermeable Membran große Moleküle
aus, so dass die Messung der Probe im Biosensor ohne Aufarbeitung durchgeführt werden
kann.
Die Verwendung eines "Multi-Biosensors" in Kombination mit der Mikrodialyse ermöglicht
ein lückenloses Monitoring metabolisch wichtiger Parameter wie Glukose, Laktat, Glutamin
und Glutamat während Operationen oder bei der Intensiv-Überwachung stoffwechselkranker
Patienten. Hier ist eine zuverlässige und einfache Analyse kritischer Stoffwechselparameter
mit minimalem Zeitverlust (Lag-Phase) zwischen der Probennahme und dem Ergebnis der
Messung unerlässlich. Auch für die Einstellung der Insulingabe bei Insulin abhängigen
Diabetespatienten ist ein Langzeit-Monitoring von Glukose von großer Bedeutung. Für die
Selbstüberwachung dieser Patienten ist ein einfaches portables System erforderlich, das die
gewonnene Probe ohne Aufarbeitung analysiert und die Ergebnisse unmittelbar verarbeitet
und anzeigt.
Eine kontinuierliche Glukosemessung zur Stoffwechselkontrolle bei Diabetes mellitus ist ein
herausragendes Ziel der aktuellen Diabetesforschung. Durch eine Kopplung des
Glukosesensors mit einer Insulinpumpe wäre es möglich, die Kontrolle und Einstellung der
Diabetespatienten zu automatisieren, wodurch eine enorme Verbesserung der Lebensqualität
der einzelnen Personen erreicht werden könnte.
Monitoring-Systeme
5
1.2 Monitoring-Systeme zur Bestimmung metabolischer
Stoffwechsel-Parameter
Ein kontinuierliches Monitoring metabolischer Parametern ist von großem Interesse für die
biomedizinische Forschung sowie für die klinische Diagnostik in der Humanmedizin.
Die derzeit routinemäßig angewandten Untersuchungsmethoden zur Bestimmung der
Metaboliten im Plasma sind oft schmerzhaft für den Patienten, laborintensiv und teuer, es sind
wiederholt diskrete Probennahmen und ein geschultes Labor-Personal erforderlich.
Die so erhaltenen Messdaten liefern außerdem nur eine Momentaufnahme der
physiologischen Bedingungen.
Die Realisierung eines kontinuierlichen Monitoring-Systems für die Analyse wichtiger
Stoffwechselparameter wie Glukose, Laktat und Ammonium könnte das Risiko einer
Stoffwechselentgleisung bei betroffenen Patienten drastisch senken.
Der Einsatz von elektrochemischen multifunktionellen Biosensoren bietet die Möglichkeit
eines simultanen Monitorings und liefert kontinuierliche oder zirkadiane Profile der
interessierenden Metaboliten.
Das Prinzip der Messung beruht im Wesentlichen auf der Oxidation des Analyten durch die
entsprechenden Oxidasen, die auf der Oberfläche einer Elektrode immobilisiert vorliegen, und
der amperometrischen Bestimmung des dabei gebildeten Wasserstoffperoxids bei konstantem
Elektroden-Potential.
Ein kontinuierliches in-vivo bzw. ex-vivo Monitoring der betreffenden Analyten erfordert
jedoch den ungehinderten Zugang zu einer für den Metaboliten repräsentativen
Körperflüssigkeit.
Dieser kann durch verschiedene non-invasive bzw. minimal-invasive Methoden erzielt
werden, deren Anwendung in mehreren Arbeitsgruppen intensiv untersucht wird und bis dato
noch mit großen Schwierigkeiten verbunden ist.
1.3 Stand der Technik
1.3.1. Implantation von Biosensoren
31, 32, 33, 34
Die Implantation von Biosensoren als eine potentielle Möglichkeit zur Durchführung eines in-
vivo Monitorings ist limitiert durch die Stabilität der Sensorsignale innerhalb des Gewebes,
sowie durch Wundreaktionen im Körper nach der Implantation der Sensoren
30
. Eine
Verunreinigung der Elektroden während einer Messung kann zur Reduktion der Sensor-
Sensitivität führen
35
. Um dies zu vermeiden entwickelten Prof. Vadgama und seine
Arbeitsgruppe
36,37,38
einen mit Puffer durchspülten Glukose-Sensor (open-mikroflow), bei
welchem mit einer konstant niedrigen Flussrate Puffer vom Sensor in Richtung der
Analytlösung gepumpt wird. Hierdurch werden Moleküle mit großem Volumen (Proteine)
daran gehindert auf der Elektrode zu adsorbieren. Die Menge des Analyten die den Sensor
erreicht wird dabei allerdings ebenfalls reduziert, wodurch die Sensitivität des Sensors
indirekt herabgesetzt wird.
Um eine Schätzung der absoluten Konzentration des interessierenden Analyten durch einen
implantierten Sensor über einen längeren Zeitraum durchführen zu können, ist eine "in-vivo
Kalibration" des Sensors erforderlich. Diese ist bei Diabetes-Patienten jedoch problematisch;
da keine stabile Gleichgewichtslage (steady state) zu erwarten ist
39
.
Einleitung
6
Um die mit der Implantation eines Biosensors beschriebenen Schwierigkeiten zu umgehen ist
die Kombination eines ex-vivo gelegenen Biosensors mit einem minimal-invasiven
Probennahme-System sinnvoll.
1.3.2 Kontinuierliche Probennahme-Systeme
Die kontinuierliche Gewinnung von Proben aus dem vaskulären System, aus dem Interstitium
oder aus der Parotis-Speicheldrüse kann durch die Anwendung verschiedener minimal-
invasiver bzw. non-invasiver Methoden erzielt werden.
Zu unterscheiden sind hierbei die Methoden der inversen Iontophorese die eine transkutane
Probennahme ermöglicht, sowie der Mikroperfusion, der Ultrafiltration und der Mikrodialyse,
die unter Anderem als subkutane Probennahme-Systeme eingesetzt werden können.
Diese Systeme bieten einen minimal-invasiven Zugang zu den Körperflüssigkeiten und
dienen als Anwendungs-Schnittstelle zwischen Sensor und Gewebeflüssigkeit.
Die Gewinnung von Parotisspeichel kann entweder durch das Einführen eines Katheters in
den "Stenonschen Gang" der Speicheldrüsen erfolgen, was jedoch ohne lokale Anästhesie
nicht durchgeführt werden kann, oder durch eine non-invasive, schmerzfreie Sammlung des
Parotisspeichels über eine auf der Speicheldrüse fixierte Saugvorrichtung
40
. In der
vorliegenden Arbeit erfolgte die Gewinnung von Parotisspeichel durch eine transparente
Sammelvorrichtung (Curby-Cup), die in Kapitel 5.2.6 ausführlich beschrieben wird.
1.3.2.1
transkutane Gewinnung der Probe
a.)
mit Hilfe einer Vakuumpumpe (Saugmethode)
41
durch das Anlegen eines leichten Vakuums (400 mm Hg ) auf der Haut kann interstitielle
Flüssigkeit gewonnen werden
- es können jedoch nur sehr geringe Probenvolumina gewonnen werden
- durch das angelegte Vakuum werden Rötungen der Haut verursacht
b.)
unter Anwendung einer inversen Iontophorese (Gluko-Watch)
42
durch Anlegen eines geringen Stromes von 0,3 mA (für 3 Minuten) wird Glukose im Co-
Transport mit Na
+
-Ionen zu einer kathodischen Elektrode transportiert, die akkumulierte
Glukose wird enzymatisch oxidiert, wobei H
2
O
2
freigesetzt wird.
Nach 3 Minuten wird am elektrochemischen Biosensor eine Spannung von 0,42 mV angelegt
und das H
2
O
2
wird oxidiert und amperometrisch gemessen. Danach beginnt der nächste
Zyklus der Probensammlung.
-Kalibration des Sensors nur durch eine Blutmessung möglich (Finger-Stick-Test)
-Messung des Glukosegehalts der Probe erfolgt alle 20 Minuten bis zu maximal 12 Stunden
-Temperatur- und / oder Transpirationsänderungen können das Sensorsignal beeinträchtigen
Monitoring-Systeme
7
1.3.2.2
subkutane Gewinnung der Probe
a) unter Anwendung der offenen Mikroperfusion
43, 44, 45
ein Doppellumen-Katheter, der mit einer entsprechenden Einführnadel im untersuchten
Gewebe platziert werden kann, wird über das Innenvolumen (0,1 mm I.D.) mit Hilfe einer
Spritzenpumpe (1-4
µ
l/min) mit Lösung gespült, das äußere Volumen (0,2 mm I.D.) ist mit 24
Löchern versehen, hier findet die Äquilibrierung der Perfusionslösung und der Analyten statt,
der Katheter wird mit einer Peristaltikpumpe gekoppelt, die den Fluss aufrecht erhält; der
Analyt gelangt über einen Doppellumen-Katheter in den Stromfluss des Probennahme-
Systems und wird von dort weitergeleitet bis zum Sensor, der außerhalb des Gewebes
platziert ist.
- die Sensorkalibration und die Messung des Analyten erfolgen ex-vivo
- eine Änderung der Recovery; sowie der Flussrate kann nicht ausgeschlossen werden
- eine permanente Kontrolle der Recovery ist unabdingbar, und muss mittels parallel
durchgeführter Messung der elektrischen Leitfähigkeit ermittelt werden
- beim Einsatz des Katheters in der Vene kann es zu Verstopfungen kommen
- Störungen der Messungen durch Luftblasen sind nicht auszuschließen
b) unter Anwendung der Ultrafiltration
46, 47
Diese ermöglicht die Gewinnung von Probe durch eine semipermeable Membran, wobei die
treibende Kraft durch einen Unterdruck im Sammelgefäß realisiert wird.
Eine kleine hohle Faser (4 cm lang, ID 0,24 mm; AD 0,29 mm) wird im Gewebe platziert und
mit einem Auslassschlauch verbunden, an dem ein Unterdruck (z.B. mit einer Monovette)
erzeugt wird.
Die Bestimmung des Analyten erfolgt mit einem elektrochemischen Biosensor der in einem
Fließ-Injektions-Analysator integriert ist.
- die Wiederfindungsrate ist 100 % und nicht Flussraten abhängig
- geringes Probenvolumen im Interstitium führt zur Reduktion der Flussrate
- Anlagerung von Proteinen auf der Oberfläche des Katheters führen zur Reduktion des
Signals bzw. der Recovery
Ist das Probenvolumen der zu untersuchenden Gewebeflüssigkeit minimal, wie zum Beispiel
im Gehirn oder im subkutanen Gewebe, so ist die Mikrodialyse die Methode der Wahl.
Einleitung
8
c) Mikrodialyse
48
,
49,50
Die Mikrodialyse ist ein Probennahme-System, das auf der Diffusion löslicher Moleküle im
Gewebe durch eine semipermeable Membran entlang eines Konzentrationsgradienten basiert.
Die semipermeable Membran stellt die Kontaktfläche zur untersuchten Körperflüssigkeit dar
und setzt daher eine hohe Biokompatibilität voraus. Da sie in Abhängigkeit ihres spezifischen
Ausschlussvolumens (cut off) die Diffusion großer Moleküle verhindert, ermöglicht sie eine
gewisse Selektion der Moleküle im Dialysat.
Abb. 3
Schematische
Darstellung des
Mikrodialyse-
katheters im
Gewebe
Das Perfusat, eine mit dem Blut isotone Lösung, wird über den Einlass-Schlauch des
Mikrodialyse-Katheters mit Hilfe einer kontinuierlich transportierenden oder pulsierenden
Pumpe (Pulsvolumen 0,5 µl) durch die semipermeable Dialysemembran gepumpt.
Über den Auslass-Schlauch des Katheters wird das Dialysat gewonnen, das mit Molekülen
der untersuchten Probe (z.B. dem Interstitium) angereichert ist.
Die "relative Recovery" der interessierenden Analyten ist definiert als der prozentuale Anteil
im Dialysat, bezogen auf die Konzentration des Analyten in der originalen Körperflüssigkeit
(Plasma). Die "absolute Recovery" ist definiert als die absolute Menge des Analyten bezogen
auf ein Zeitintervall
51
. Die Recovery ist abhängig vom Material und der Größe der
semipermeablen Membran, sowie von der Flussrate der Perfusionslösung. Je höher die
Flussrate, desto niedriger ist die "relative Recovery", während die "absolute Recovery" steigt.
Die "relative Recovery" ist direkt proportional zur Oberfläche der Dialysemembran.
Semipermeable
Membran
Analyt
Perfusat
Interstitium
Zelle
Kapillare
Semipermeable
Membran
Analyt
Perfusat
Interstitium
Zelle
Kapillare
Mikrodialyse
9
1.4 Anwendungsbereiche der Mikrodialyse
Mikrodialyse kann außer im Gehirn sowohl intravenös als auch subkutan eingesetzt werden.
Bei der intravenösen Anwendung ist eine Heparinzugabe erforderlich, um die Agglutination
der Probe zu vermeiden, außerdem ist eine Blockade der Membran durch Makromoleküle
nicht auszuschließen.
Alternativ dazu kann die Mikrodialysesonde subkutan eingesetzt werden. Dies ist einerseits
für Moleküle sinnvoll, die durch Diffusion aus der Blutbahn ins subkutane Gewebe gelangen
und die physiologischen Gegebenheiten des Blutes widerspiegeln, andererseits können mit
dieser Methode lokale Veränderungen im untersuchten Gewebe analysiert werden.
Die Mikrodialyse ermöglicht ein kontinuierliches Monitoring physiologischer Parameter und
eignet sich daher hervorragend für kinetische Experimente.
Die Sensitivität kinetischer Untersuchungen ist jedoch abhängig von der Flussrate der
Perfusionslösung; wird diese zu langsam gewählt ( 1 µl/min), so ist es nach der
herkömmlichen Methode schwierig, schnelle Änderungen zu erfassen, da die Analyse der
Probe mit dem CMA-Analysator, einem speziell für Mikrodialyse-Anwendung entwickeltes
Gerät zur Untersuchung kleiner Probenvolumina, eine bestimmte Mindestmenge an Dialysat
erfordert. Bei zu hohen Flussraten ( 10 µl/min) nimmt das Signal stark ab und geht eventuell
im Rauschen unter.
Wird die Mikrodialyse mit einem Biosensor gekoppelt, so kann auch bei niedrigen Flussraten
ein kontinuierliches Monitoring ohne jeglichen Informationsverlust erfolgen.
Ein kontinuierliches Monitoring von Glukose im subkutanen Gewebe unter Anwendung der
Mikrodialyse, gekoppelt mit einem Biosensor, wurde bislang in der Arbeitsgruppe von Prof.
Cammann der Universität Münster durchgeführt
52
Hierbei wurde ein CMA-60 Mikrodialyse-Katheter (Membranlänge 30 mm) verwendet, die
Probe wurde mittels eines elektrochemischen Biosensors unter Einsatz der zwei Elektroden-
Methode gemessen. Das Perfusat wurde mit einer Minimed-Pumpe in programmierbaren
Zeitintervallen in den Katheter gepumpt. Die Äquilibrierung des Analyten erfolgte über 10
Minuten im "stop-flow-Modus" der Pumpe, wodurch eine 100 %ige Recovery erreicht wurde.
Beim nächsten Bolus wurde das Dialysat in den Sensor gepumpt.
Das Sensorsignal konnte somit nur alle 10 Minuten abgelesen und die entsprechende
Glukosekonzentration berechnet werden.
Die Insertion des CMA-60 Mikrodialyse-Katheters mit der entsprechenden Injektionsnadel
(A.D. 1,4 mm, Länge 54 mm) ist jedoch sehr schmerzhaft und kann zur Ausbildung von
Entzündungen führen, ihre Anwendung in der Pädiatrie ist daher nicht zumutbar.
Perdomo et al. führten in-vitro Messungen in Serumproben, unter Anwendung eines CMA-20
Mikrodialyse-Kathetes (Membranlänge 10 mm), kombiniert mit einem amperometrischen
Glukose- und Laktatsensor durch. Die Mikrodialysesonde befand sich hierbei vor dem
Sensor-Chip, der Fluss wurde mit einer Peristaltik-Pumpe, die hinter der Sensoreinheit
lokalisiert war, aufrecht erhalten. Ein Thermostat hielt die Temperatur im Sensor konstant bei
20 °C. Die in-vitro Messungen der Serum-Proben ergaben jedoch, im Vergleich zu den
durchgeführten wässrigen Kalibrationsmessungen, eine höhere Reaktionszeit, was
möglicherweise auf einen langsameren Austausch der Metaboliten entlang der
Mikrodialysemembran zurückzuführen ist
53
.
Einleitung
10
Die Verwendung eines CMA-70 Mikrodialyse-Katheters zur Probengewinnung in der
Pädiatrie hat sich bereits in früher durchgeführten Untersuchungen bewährt.
Baumeister et al. setzten den Katheter bei neugeborenen Kindern im subkutanen Gewebe ein
und durchspülten ihn mit einer physiologischen Lösung bei einer Flussrate von 0,3
µ
l/min.
Das Perfusat wurde in Mikrogefäßen gesammelt und anschließend, unter Verwendung eines
CMA-600-Analysators, der in Kapitel 2.2.4 ausführlich beschrieben wird, analysiert.
Der Mikrodialysekatheter wurde im subkutanen Gewebe bis maximal sechzehn Tage bei
uneingeschränkter Funktion verwendet. Eine Infektion der Einstichstelle konnte nicht
beobachtet werden
54
.
In der vorliegenden Arbeit wurde der CMA-70 Mikrodialyse-Katheter, der eine minimal-
invasive Probennahme ermöglicht, mit einem "Bioanalytischen Mikrosystem" kombiniert
55
,
um ein zuverlässiges, simultanes Langzeit-Monitoring von Glukose und Laktat zu realisieren.
1.5 In-vivo Recovery unter Anwendung der Mikrodialyse
Da die Proben nicht direkt aus dem subkutanen Gewebe gewonnen werden, kann nicht
angenommen werden, dass die gemessene Konzentration eines Analyten dem tatsächlichen
Gehalt der Probe entspricht. Es ist daher erforderlich, die "in-vivo Recovery" zu
bestimmen
56,57
. Sie ist definiert als der prozentuale Anteil des Analyten im Dialysat, bezogen
auf das umgebende Medium und kann mit verschiedenen Methoden ermittelt werden.
1.5.1 No-net-flux-Methode
58,59
Hierbei erfolgt die Messung der Zu- oder Abnahme eines endogenen Moleküls "A", während
das gleiche Molekül in verschiedenen Konzentrationen der Perfusionslösung zugesetzt wird.
Durch eine lineare Regression kann der Punkt ermittelt werden, bei welchem keine Diffusion
stattfindet.
Ist die Nettodiffusion
des zu untersuchenden
Moleküls gleich Null (y
= 0), so entspricht die
Konzentration des zum
Perfusat addierten
Moleküls (x) der des
Analyten "A" in der
Probe.
Die Methode ist Zeit-
und Labor intensiv und
führt außerdem zu einer
Störung der physiolog.
Konzentration.
Abb. 4 Diagramm der
"No-net-flux-Methode"
y = -ax + A
Konzentration [Perfusat]
K
onz
en
tr
at
ion
[P
erfu
sat - Di
al
syat]
extrazelluläre
Konzentration
des Analyten
Mikrodialyse
11
1.5.2 Zero-flow-Methode
60,61
Die Dialysatkonzentration des interessierenden Analyten wird nach der Perfusion des
Mikrodialyse-Katheters bei verschiedenen Flussraten bestimmt.
Unter Verwendung einer nichtlinearen Regression kann die extrazelluläre Konzentration des
Moleküls bei einer Flussrate von Null errechnet werden.
Bei einer Flussrate von
Null (x = 0) entspricht
der ermittelte Wert "A"
der Konzentration des
Analyten in der Probe.
Diese entspricht somit
einer in-vivo Recovery
von 100%.
Die Methode ist zwar
zeitaufwendig, benötigt
jedoch keine weiteren
Laboruntersuchungen.
Abb. 5 Diagramm der
"Zero-flow-Methode"
1.5.3 Near-Equilibrium-Dialyse
62
Eine möglichst lange Dialysemembran und eine möglichst niedrige Flussrate erhöhen die
Diffusionszeit der entsprechenden Moleküle und führen zu einer Recovery von bis zu 100 %
Wird die Variable x
sehr groß (x
!
), so
erreicht die Variable y
ein Maximum, das der
Konzentration "A" des
Analyten entspricht
(y = A).
Eine lange Dialyse-
Membran erfordert den
Einsatz einer großen
Einführnadel, wodurch
die Insertion der Sonde
sehr schmerzhaft wird.
Abb. 6 Diagramm der
"Near-Equilibrium-Dialyse"
y = A e
- b x
0
Flussrate
Konzent
rat
ion [
D
ia
lysat
]
Konzentration [extraze llulär]
Near Equilibrium Dialyse
0
Mem branlänge und Verw eildauer
K
onzentr
ation (D
ialysat)
Konzentration (extrazellulär)
y=(Ax)/(a+x)
Einleitung
12
1.6 Diabetes
mellitus
Die Blutglukose-Homöostase wird sehr komplex und beim Stoffwechselgesunden in sehr
engen Grenzen reguliert. Letztlich ist die Höhe des Blutzuckers das Ergebnis von anabolen
und katabolen Prozessen, einschließlich der resorbierten Glukose aus der Nahrung.
Steigt der Blutglukose-Spiegel z.B. nach einer Nahrungsaufnahme an, so erfolgt die Sekretion
von Insulin durch die Pankreas, welches die Aufnahme von Glukose in die Zellen stimuliert
63
.
Außerdem stimuliert Insulin die Glykogensynthese und die Speicherung von überschüssigem
Brennstoff in Form von Fett.
Insgesamt begünstigt Insulin die Umsetzung der Glukose zu zwei Speichersubstanzen:
In der Leber und in den Muskeln wird Glykogen gebildet, während im Fettgewebe
Triacylglyceride synthetisiert werden.
Diabetes mellitus entsteht durch einen Defekt der Produktion oder der Wirkung des Insulins.
Diabetes mellitus ist von der Weltgesundheitsorganisation als ein Zustand der chronischen
Hyperglykämie, als Folge eines relativen, oder absoluten Insulinmangels, definiert. Eine
Hyperglykämie liegt vor, wenn der Glukosegehalt im Blut im nüchternen Zustand 6,7 mM
(120 mg/dl) oder postprandial 10mM (180 mg/dl) überschreitet
64
.
Die Verbreitung von Diabetes mellitus liegt in den USA und den westeuropäischen Ländern
etwa bei 5%. Allein in Deutschland leiden sechs Millionen an dieser Stoffwechselkrankheit
65
Es werden grundsätzlich zwei Typen des Diabetes mellitus unterschieden:
1.
Typ I Diabetes
2.
Typ II Diabetes
1.6.1 Der Typ I Diabetes
Tritt überwiegend im Kindes- und Jugendalter auf, und beruht auf einer genetisch
prädeterminierten Zerstörung der Insulin produzierenden B-Zellen der Pankreas
66
. Beim Typ I
Diabetes handelt es sich um eine Autoimmunkrankheit, die zum vollständigen Verlust der
Insulinproduktion führt. Patienten mit Typ I Diabetes sind daher von einer kontrollierten
Insulinzufuhr abhängig.
1.6.2 Der Typ II Diabetes
Tritt, familiär gehäuft, gewöhnlich erst jenseits des 40. Lebensjahres auf, und ist primär nicht
Insulin abhängig. Bei den meist übergewichtigen Patienten liegt eine Störung der Sekretion
und zellulären Wirkung von Insulin vor (Insulinresistenz der Zellen), was kompensatorisch
zur Hyperinsulinämie führt. Ist die Kompensation der B-Zellen erschöpft, kommt es zur
Hyperglykämie
67
.
Diabetes Mellitus
13
Eine Hypoglykämie liegt vor, wenn der Blutzuckerspiegel unter 2,8 mmol/l (50 mg/dl)
absinkt. Erste Symptome eines abfallenden Blutglukose-Spiegels sind Unwohlsein, Müdigkeit
und Konzentrationsschwäche bis hin zu geistiger Verwirrung. Noch weiteres Absinken führt
zu Koma, Krampfanfällen und - bei extremer Hypoglykämie- zum Tod.
Im Falle einer Hypoglykämie kommt es zur Aktivierung der Insulin-Antagonisten wie
Adrenalin, Noradrenalin, Glukagon und Wachstumshormonen. Durch diese kontrainsulinären
Hormone wird vermehrt Glykogen abgebaut und die Glukoneogenese aus entsprechenden
Vorstufen gefördert. Diese Mechanismen laufen auch bei einem Diabetes Patienten ab, sind
genügend Glykogenreserven vorhanden, so kann die Absenkung des Blutglukosespiegels
kompensiert werden, überwiegt jedoch der medikamentös induzierte blutzuckersenkende
Effekt von exogen gespritztem Insulin, so sind die Kompensationsmechanismen nur begrenzt
wirksam und bald erschöpft
68
.
1.6.3 Komplikationen und Spätfolgen des
Diabetes mellitus
69
Mikroangiopathie:
Kapillarenverengung, die zur Erblindung (Retinopathie), zu nekrotischen
Veränderungen der Füße (Gangrän) und zur Schädigung des Nervensystems
(Neuropathie) führen können.
Makroangiopathie:
Arteriosklerose die in Verbindung mit Hypertonie zu erhöhtem kardiovaskulärem
Risiko führt.
Glukosurie:
Erhöhte Glukosewerte im Blut führen zu erhöhter Ausscheidung von Glukose im Urin,
durch verstärkte Ausscheidung von Wasser und Elektrolyten kann dies zum Koma
führen
70
.
Ketoazidose:
Durch einen kompletten Insulinmangel beim Typ I Diabetes kann Glukose nicht mehr
in die Zellen aufgenommen werden, wodurch es zu erhöhter Lipolyse und dadurch zu
erhöhtem Anteil an freien Fettsäuren im Blut kommt
71,72
. Durch eine erhöhte
Fettsäureoxidation kommt es zu einer Akkumulation von Acetyl-CoA in der Leber,
das entweder in den Zitronensäurezyklus eintreten, oder in Ketokörper umgewandelt
und in andere Gewebe transportiert werden kann. Dort werden die Ketonkörper
schließlich oxidiert und liefern einen Großteil der benötigten Energie. Das Gehirn, das
normalerweise bevorzugt Glukose als Brennstoff verwertet, kann sich anpassen und
die Ketonkörper "Acetoacetat" sowie "D-
-Hydroxybutyrat" verwenden.
Einleitung
14
1.7 Hyperammonämie
Ammoniak ist ein primäres Abbauprodukt der Aminosäuren (AS) und wird in allen
Organismen gebildet. Der Abbau der AS erfolgt primär in der Leber, im Cytosol wird die
Aminogruppe unter Einwirkung von Transaminasen auf 2-Oxoglutarat übertragen, wodurch
Glutamat gebildet wird. Ein Teil des Glutamats wird in die Mitochondrien transportiert, wo
durch die Aktivität des Enzyms Glutamatdehydrogenase (GLDH) Ammoniumionen
freigesetzt werden, die direkt in den Harnstoffzyklus eingeschleust werden.
Im Cytosol der Muskelzellen erfolgt der Transfer der Aminogruppe auf Pyruvat, wodurch
Alanin gebildet wird, dies wird zur Leber transportiert, wo die Aminogruppe auf das Molekül
2-Oxoglutarat transferiert wird und Pyruvat freigesetzt wird. Die Reaktion wird von dem
Enzym Alanin-Aminotransferase (ALT) katalysiert.
Bei dieser Reaktion wird Glutamat gebildet, das in die Mitochondrien transportiert wird. Das
in den Muskeln gebildete Pyruvat aus der Glykolyse gelangt auf diesem Weg zur Leber, wo
es für die Glukoneogenese verwendet werden kann.
In anderen Geweben wie z.B. dem Gehirn wird überschüssiges Ammonium auf Glutamat
übertragen und zu Glutamin umgebaut, die Reaktion wird durch das Enzym
Glutaminsynthethase katalysiert. Glutamin dient als ungiftige und neutrale interzelluläre
Transportform, da es Zellmembranen leicht passieren kann. Es wird über die Blutbahn in die
Leber transportiert, hier setzt das Enzym Glutaminase Ammonium frei, das dabei entstehende
Glutamat kann wiederum von der GLDH desaminiert werden, die freigesetzten
Ammoniumionen werden über den Harnstoffzyklus entsorgt.
1.7.1 Harnstoffzyklus
Abb. 7 Schematische Darstellung des Harnstoffzyklus nach L.Stryer
73
. (E = Enzym)
Mitochondrium
Citrullin
Ornithin
Arginin
Argininsuccinat
Oxalacetat
Aspartat
Fumarat
Cytosol
Malat
-Ketosäure
-Aminosäure
Harnstoff
NH
4
+
+ HCO
3
-
E1
Carbamoyl-
phosphat
E2
E3
E4
E5
Mitochondrium
Citrullin
Ornithin
Arginin
Argininsuccinat
Mitochondrium
Citrullin
Ornithin
Arginin
Argininsuccinat
Citrullin
Ornithin
Arginin
Argininsuccinat
Oxalacetat
Aspartat
Fumarat
Cytosol
Malat
-Ketosäure
-Aminosäure
Harnstoff
NH
4
+
+ HCO
3
-
E1
Carbamoyl-
phosphat
E2
E3
E4
E5
Hyperammonämie
15
Der erste Schritt des Harnstoffzyklus findet in der mitochondrialen Matrix statt. Das durch die
oxidative Desaminierung von Glutamat durch die
"
GLDH
"
freigesetzte NH
4
+
reagiert mit
einem Molekül Hydrogencarbonat zu Carbamoylphosphat.
Die Reaktion wird von dem Enzym Carbamoylphosphat-Synthetase (E1) katalysiert, welches
durch N-Acetyl-Glutamat stimuliert wird.
Das Carbamoylphosphat gibt nun seine Carbamoyl-Gruppe an Ornithin ab, wobei Citrullin
gebildet wird.
Diese Reaktion wird von der Ornithin-Carbamyl-Transferase (E2) katalysiert.
Das Citrullin wird nun aus der mitochondrialen Matrix ins Cytosol geschleust, wo die übrigen
Reaktionen des Harnstoffzyklus stattfinden.
Die zur Harnstoffsynthese benötigte zweite Aminogruppe tritt in Form von Aspartat in den
Zyklus ein. Die Überführung der Aminogruppe vom Glutamatpool in Aspartat erfolgt durch
die Wirkung des Enzyms Aspartat-Transaminase, die sowohl im Cytosol als auch in den
Mitochondrien lokalisiert ist.
Im nächsten Schritt des Zyklus kondensiert die Aminogruppe des Aspartats unter ATP-
Verbrauch mit dem Carbamoylrest des Citrullins, diese Reaktion wird von der
Argininsuccinat-Synthetase (E3) katalysiert, es entsteht Argininsuccinat. Es folgt die Spaltung
des Argininsuccinats zu Arginin und Fumarat durch das Enzym Argininsuccinase (E4). Das
bei dieser Reaktion entstehende Arginin ist die unmittelbare Vorstufe des Harnstoffs, über das
Molekül Fumarat steht der Harnstoffzyklus mit dem Citrat-Zyklus (auch Tricarbonsäure-
Zyklus genannt) in Verbindung.
Unter der Katalyse des Enzyms Arginase (E5) wird Harnstoff aus Arginin abgespalten und
dadurch das am Anfang des Harnstoffzyklus stehende Ornithin regeneriert.
Der gebildete
Harnstoff diffundiert von der Leber in das Blut und wird von der Niere in den
Harn ausgeschieden.
Man unterscheidet erworbene
Hyperammonämien, die vorwiegend bei Erwachsenen
auftreten und auf schweren Leberschädigungen zurückzuführen sind, von den angeborenen
Stoffwechselstörungen, die meist auf Störungen des Harnstoffzyklus beruhen
74,75,76
.
Als Ursache einer
Hyperammonämie bei angeborenen Harnstoffzyklusstörungen treten
Störungen der am Harnstoffzyklus beteiligten Enzyme auf, wie zum Beispiel:
- Mangel an Carbamylphosphat-Synthetase (E1) ,,CPS-Mangel"
- Mangel an Ornithin-Transcarbamylase
(E2) ,,OTC-Mangel"
- Mangel an Argininsuccinat-Synthetase
(E3) ,,Citrullinämie"
- Mangel an Argininsuccinase
(E4) ,,Argininsuccinaturie"
- Mangel an Arginase
(E5) ,,Hyperargininämie"
Die Störungen führen zu einer abnorm hohen Ansammlung von Ammoniak im Blut sowie im
Gewebe (primäre Hyperammonämie). Bei Neugeborenen treten bereits innerhalb der ersten
24 oder 48 Lebensstunden typische Symptome auf, wie Trinkschwäche, Erbrechen, abnorme
Atmung, Lethargie, Krämpfe und Koma. Eine sekundäre Hyperammonämie tritt auf, wenn
der Harnstoffzyklus durch das Auftreten anderer Stoffwechselerkrankungen beeinträchtigt ist.
Um eine Hyperammonämie zu verhindern ist bei diesen Patienten eine AS- arme Diät
unerlässlich. Da jedoch zehn der AS essentiell sind, das heißt von Menschen nicht
synthetisiert werden können, kann man diese durch die Gabe der Keto-Verbindungen der
entsprechenden AS ersetzen. Durch Transaminierung können die essentiellen AS dann nach
Bedarf aus den nicht essentiellen hergestellt werden, gleichzeitig wird vermieden, dass die
nicht essentiellen AS ihre Aminogruppe ans Blut abgeben
77
.
Einleitung
16
1.8 Ziel der Arbeit
Die Bestimmung verschiedener metabolischer Parameter in Körperflüssigkeiten wird
routinemäßig in der medizinischen Diagnostik eingesetzt, wonach die dabei gewonnenen
Resultate häufig als Basis für therapeutische Maßnahmen dienen.
Die meisten der bisher verwendeten Methoden sind jedoch diskret und invasiv. So beruhen
die derzeit angebotenen Methoden zur Messung des Blutzuckerverlaufs bei Diabetikern sowie
die Bestimmung von Ammonium bei metabolischen Störungen des Harnstoffwechsels auf
schmerzhaften Kapillarblutmessungen mit Analysegerätezeitkonstanten von einigen Minuten.
Wegen ihrer geringen Anzahl von Messungen im Tagesverlauf gibt diese Methode nur ein
grobes Abbild der tatsächlichen Situation wider, da schnelle Änderungen des Blutbildes nicht
erfasst werden können.
Die Etablierung eines kontinuierlichen Messverfahrens zur Überwachung des Blutzuckers
durch Kopplung von Biosensoren mit Mikrodialysesonden bietet die Möglichkeit zur
Aufnahme eines kontinuierlichen Zeitprofils unter minimal-invasiven Bedingungen.
Die Verwendung von Biosensoren für das "online Monitoring" im klinischen Bereich stellt
hohe Anforderungen an das komplette Messsystem, es sollte nicht nur robust, klein und
handlich, sondern auch leicht zu bedienen sein. Biokompatibilität und Zuverlässigkeit sind
weitere Voraussetzung für die klinische Anwendung
78
.
Eine alternative Bestimmung des Ammoniums im Parotisspeichel würde zu einer enormen
Erleichterung in der klinischen Diagnostik führen, da die für Kinder oft schmerzhafte invasive
Gewinnung der Blutproben durch eine non-invasive, schmerzfreie Methode ersetzt werden
könnte. Die Bestimmung des Ammoniumgehalts im Parotisspeichel für die klinische
Diagnose setzt jedoch eine Korrelation der Plasmawerte mit den Ammoniumwerten im
Parotisspeichel voraus.
Ziel der Doktorarbeit ist es, minimal-invasive bzw. non-invasive Probennahme-Systeme
mit bioselektiven Techniken zu kombinieren, um ein kontinuierliches Monitoring
klinisch relevanter Metaboliten wie Glukose, Laktat und Ammonium bei
stoffwechselkranken Kindern zu etablieren.
Im ersten Teil der Arbeit sollte das "Online-Monitoring" von Glukose und Laktat im
subkutanen Gewebe von gesunden Probanden mit unterschiedlichem Körpermassen-Index
(BMI), durch die Kombination von Biosensoren mit einem Mikrodialyse-Katheter als
Probennahme-System realisiert und optimiert werden.
Durch die Kopplung der beiden Systeme soll ein minimal-invasives Messverfahren entwickelt
werden, das ein kontinuierliches Monitoring verschiedener Parameter im subkutanen Gewebe
ermöglicht. Die Zeitkonstanten für das technische Delay des kombinierten Systems sollten
ermittelt und optimiert werden.
Es sollte das Profil des Glukosegehalts im Verlauf eines "doppelten oralen Glukose-
Toleranztestes" (2oGTT) im abdominalen und antebrachialen subkutanen Gewebe mit dem
Profil der Plasmawerte verglichen werden. Die Untersuchung der Kinetik von Glukose und
Laktat im Verlaufe des 2oGTT sowie die Bestimmung der in-vivo Recovery und der relativen
Recovery von Glukose sollte Aufschluss geben über die Perfusion und den Stoffwechsel des
subkutanen Gewebes in Abhängigkeit vom BMI der Probanden.
Die Korrelation der Sensorergebnisse mit etablierten Referenzmethoden sollte ermittelt
werden um die Zuverlässigkeit der gewonnenen Ergebnisse zu überprüfen.
Ziel der Arbeit
17
Im zweiten Teil sollte die non-invasive Gewinnung von Parotisspeichel mit einer speziellen
Sammel-Vorrichtung, dem Curby-Cup, bei gesunden Probanden durchgeführt und deren
Ammoniumgehalt unter Einsatz eines Glutamat-Biosensors bestimmt und mit entsprechenden
Plasmawerten verglichen werden.
Hierzu sollte die Bestimmung von Ammonium mit einem amperometrischen Glutamat-
Biosensor etabliert und optimiert werden. Unter Anwendung eines tragbaren Analysators mit
integrierten Spritzenpumpen, sollte eine präzise Dosierung von Probe und Reagenzien sowie
eine effektive Reinigung des Systems zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen erzielt
werden.
Da der Ammoniumgehalt im Parotisspeichel mit steigender Flussrate abnimmt, sollte dessen
Verhalten in Abhängigkeit von der Flussrate der gewonnenen Probe genauer untersucht und
mit dem Verhalten von Kalium bei entsprechenden Flussraten verglichen werden.
Kalium zeigt bei niedrigen Flussraten ebenfalls eine Abnahme der Konzentration mit
zunehmender Flussrate, bei höheren Flussraten ( 0,2 ml) bleibt der Gehalt jedoch
unabhängig von der Flussrate konstant. Es sollte daher festgestellt werden, ob sich das
Ammoniumion, das die gleiche Ladung besitzt wie das Kaliumion, in gleicher Weise verhält.
Dies hätte zur Folge, dass Kalium als interner Standard bei der Ammonium-Messung
verwendet werden könnte, und eine zusätzliche Bestimmung der Flussrate im Parotisspeichel
nicht erforderlich wäre.
Die erforderlichen Analysen für das Glukose- und Laktatmonitoring, sowie für die
Bestimmung von Ammonium im Parotisspeichel wurden in enger Zusammenarbeit mit der
Universitäts-Kinderklinik durchgeführt, in deren klinischem Labor verschiedene
Referenzmessungen durchgeführt wurden.
18
2.
Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe
Biochemische Parameter im Blut bzw. im Plasma können Aufschluss geben über die
Regulationsmechanismen von Homöostase und das Ausmaß einer bestehenden Krankheit.
Die Blutentnahme mit anschließender Analytik im Labor ist jedoch Patienten unfreundlich,
laborintensiv und meist teuer. Außerdem können schnelle Änderungen eines interessierenden
Metaboliten mit dieser Methode nicht erfasst werden.
Ein "in-vivo Monitoring" der betreffenden Parameter mit einem "Bioanalytischen
Mikrosystem" liefert dagegen schnelle und zuverlässige Ergebnisse ohne Informationsverlust.
Ein kontinuierliches Monitoring der Blutbestandteile ist jedoch aufgrund der komplexen
Zusammensetzung des Blutes mit einigen Schwierigkeiten verbunden.
Um eine Agglutination des Blutes zu vermeiden, muss sowohl intra- als auch extravaskulär
Heparin zugesetzt werden. Endogene Moleküle (Enzyme) können die Zusammensetzung der
Probe mit der Zeit verändern. Werden diese Moleküle auf Grund ihrer Größe durch eine
semipermeable Membran zurückgehalten, kann dies zur Blockade der Membran führen.
Ein alternatives Kompartiment zur Untersuchung physiologischer Parameter stellt das
subkutane Gewebe dar, welches unter Einsatz eines Mikrodialyse-Katheters eine indirekte
Probennahme über Diffusionsvorgänge ermöglicht
79
. Die so gewonnene Probe kann ohne prä-
analytische Behandlung direkt im Sensor gemessen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein kontinuierliches Monitoring von Glukose und Laktat im
intakten subkutanen Gewebe durch die Kombination von amperometrischen Biosensoren mit
dem Mikrodialyse-Katheter als Probennahme-System realisiert.
Der Katheter wird mit Hilfe einer Einführnadel (18 G)
ohne lokale Anästhesie minimal-invasiv eingesetzt, ohne
dass es zu lokalen oder systemischen Infektionen oder
Narbenbildungen kommt.
Bei dem im Gewebe liegenden Teil des Katheters
handelt es sich um eine semipermeable Membran mit
einem "cutoff" von 20 Kilodalton. Der Mikrodialyse-
Katheter wird mit Hilfe einer spezifischen Pumpe
(CMA-107) mit einer physiologischen Lösung (CMA-
T1) durchspült.
Abb. 8 Mikrodialyse-Katheter im subkutanen Gewebe (abdominal)
Durch Diffusion entlang der semipermeablen Membran wird die Dialyseflüssigkeit mit den
interessierenden Metaboliten aus dem subkutanen Gewebe angereichert.
Das Dialysat wird zum Sensor weitergeleitet, der eine quantitative Bestimmung der
Metaboliten ermöglicht. Die Zusammensetzung des gewonnenen Dialysats liefert
Informationen über den lokalen Metabolismus des untersuchten Gewebes und ermöglicht
einen Vergleich mit den entsprechenden Plasmawerten.
Um eine Drainage der Probe zu verhindern und eine Recovery von bis zu 100 % zu erreichen,
wurden die folgenden Untersuchungen bei einer Flussrate von 0,3
µ
l/min durchgeführt
47
.
Da der Verbrauch der Analyten im Sensor vernachlässigbar gering ist, kann die Probe nach
der Messung im Sensor für eine Referenzmessung verwendet werden. Hierzu wurden die
Proben nach der Messung im Sensor in "Microvials"
gesammelt.
Als Referenzmethode wurde der CMA-600-Analysator der Fa. CMA (Schweden) verwendet.
Material
19
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
2.1.1.1
Dextro OGT 300 ml Saft N1
La Roche
2.1.1.2
Di-Natriumhydrogenphosphat 99
%
p.a.
Fluka
2.1.1.3
Glukose; D(+)-Monohydrat
99,5 % p.a. Fluka
2.1.1.4
Glukose Reagenz für den CMA-600-Analysator
Axel Semrau
2.1.1.5
Kalibrationslösung für den CMA-600-Analysator
Axel Semrau
2.1.1.6
Laktat Reagenz für den CMA-600-Analysator
Axel Semrau
2.1.1.7
L-Lactat
Natrium-Salz 99
%
p.a.
Fluka
2.1.1.8
Natriumchlorid 99,5
%
p.a.
Fluka
2.1.1.9
Natrium-di-hydrogenphosphat 99
%
p.a.
Fluka
2.1.2 Pufferlösungen
2.1.2.1
Elo Mel isoton Infusionslösung 500 ml (302 mosmol/l)
Fresenius Kabi
2.1.2.2
Jonosteril Infusionslösung 500 ml (291 mosmol/l)
Fresenius Kabi
2.1.2.3
Phosphatpuffer (PBS) mit 0,1M NaCl PH=7,4
Reagenzien
Menge [g/l]
Molarität
O
H
HPO
Na
2
4
2
12
30,51
0,085
O
H
PO
NaH
2
4
2
2,045
0,015
NaCl
5,844
0,100
Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe
20
2.1.3 Geräte
2.1.3.1
Batterie
6
Volt
Fiamm-GS
Fiamm
2.1.3.2
Biosen 5020 L Laktatmonitor
EKF Industrial Electronics
2.1.3.3
CMA-600-Analysator
CMA/Schweden
2.1.3.4
Glukose-Analyzer
II
Beckman
Instruments
2.1.3.5
Mikroinjektions-Pumpe;
CMA
107
Axel
Semrau
2.1.3.6
Mikroinjektions-Pumpe
CMA
100
Axel
Semrau
2.1.3.7
Notebook
Satellite
2520
CDT Toshiba
2.1.3.8
Opto-Isolator; RS 232; 230V/50 Hz; 50 mA;
ELV
2.1.3.9
Potentiostat
(Vier-Kanal-SMD)
Tu-Wien
(surface mounted device)
2.1.3.10
Sonorex Ultraschall Gerät RK 510 H
Bandelin
2.1.3.11 Thermo-Hygrometer
Oregon
Scientific
2.1.4 Verbrauchsmaterial
2.1.4.1
CMA-70 Mikrodialyse-Katheter (60/20)
P000080
Axel Semrau
2.1.4.2
Dreiwegehahn
(Discofix-3)
Braun
2.1.4.3
Mikro-Filter 0.2
µ
m
Corning
2.1.4.4
Mikrodialyse Spritzen CMA 106,
P000013
Axel Semrau
2.1.4.5
Microvials 200
µ
l
P000001
Axel Semrau
2.1.4.6
Micro
Racks
P000028
Axel Semrau
2.1.4.7
Neonatal-Elektroden
Arbo
GmbH
2.1.4.8
Perfusionslösung T1, 5ml Glasampullen;
P000034
Axel Semrau
2.1.4.9
Probenröhrchen zur Serumgewinnung; Glukose FH 1.3
Sarstedt
2.1.4.10
Venenverweilkatheter (Abbocath T 20G)
Abbott
Methoden
21
2.2 Methoden
2.2.1 Bioanalytisches Mikrosystem
Für die simultane Bestimmung von Glukose und Laktat im Dialysat wurde ein
"Bioanalytisches Mikrosystem" eingesetzt, das im Wesentlichen aus zwei Funktionseinheiten
besteht, dem Biosensorarray, der als sensorisches Element fungiert und dem Printplättchen
auf dem die Mikrofluidik realisiert ist. Auf dem Printplättchen befinden sich außerdem die
elektrischen Kontakte zum Potentiostaten sowie die (Gold-) Gegenelektrode.
Der Biosensorarray (4x7mm²) wurde mit Hilfe der Dünnschichttechnologie hergestellt. Er ist
mit vier platinierten Arbeitselektroden (je 0.5x0.5mm²) und einer Ag/AgCl-Referenzelektrode
(4*7mm²) versehen, die auf einem 0.3 mm Glasträger aufgebracht sind.
Die Referenzelektrode liefert ein konstantes Potential gegen die Lösung, an welchem sich der
Potentiostat orientiert. Auf dem Biosensor-Array können die vier Platinelektroden mit
verschiedenen Sensoren belegt werden.
Die entsprechenden Enzyme (Oxidasen) werden nanodispensiert. Je nach Anwendung kann
der Sensorarray mit verschiedenen Printplättchen assembliert werden, die mit der
erforderlichen Fluidik ausgestattet sind.
Abb. 9 schematische Darstellung des Sensorarrays, assembliert auf einer Leiterplatte (Printplättchen), die mit
einem Einlass und einem Auslass für die Fluidik ausgestattet ist. Durch die Assemblierung des
Printplättchens mit dem Sensorarray entsteht eine Mikro-Durchflußzelle mit einem Volumen von 0,5 µl.
Die Arbeitselektroden sind mit einer semipermeablen Membran beschichtet, die eine
elektrochemische Interferenz von Harnsäure und Ascorbinsäure verhindert
34
.
Die sensorspezifischen Enzyme "Glukose-Oxidase" EC 1.1.3.4 (Aspergillus niger) sowie
"Laktat-Oxidase" EC 1.1.3.2 (Aerococcus viridans) sind in einer photovernetzten poly-
HEMA-Membran immobilisiert und mit einer diffusionslimitierenden Membran bedeckt,
wodurch der lineare Bereich der Sensoren erweitert wird.
Glaswafer
Individuelle
Enzymsensoren
Referenz-
elektrode
SiNx
Gold-Gegen-
elektrode
Kleber
Leiterplatte
Spacer
Auslass
Einlass
1
2
3
4

Details

Seiten
Erscheinungsform
Originalausgabe
Jahr
2002
ISBN (eBook)
9783836627924
Dateigröße
2.2 MB
Sprache
Deutsch
Institution / Hochschule
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg – angewandte Wissenschaften, Mikrosystemtechnik
Erscheinungsdatum
2014 (April)
Note
1,0
Schlagworte
glukose laktat monitoring diabetes adipositas

Autor

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Titel: Kontinuierliches Monitoring von Glukose, Laktat und Ammonium mit 'Bioanalytischen Mikrosystemen'
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