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Charakterisierung der mikrobiellen Biozönose im Sediment und Freiwasser der Talsperre Saidenbach

Diplomarbeit 2006 155 Seiten

Biologie - Sonstige Themen

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Ökologie von Talsperren
1.2 Die Talsperre Saidenbach
1.3 Aspekte der Trinkwasseraufarbeitung
1.4 Mikrobielle Biozönose
1.4.1 Phagen
1.4.2 Mycobakterien
1.5 Zielstellung

2 Material und Methoden
2.1 Bakterienstämme, Phage, Plasmid
2.2 Nährmedien
2.2.1 Nährmedium zur Anzucht von E. coli bei der Klonierung
2.2.2 Nährmedien zur Untersuchung biochemischer Stoffwechselleistungen
2.2.3 Mycobakterien-Kultivierung
2.2.4 Medien zur Phagen-Untersuchung
2.3 Probenahme und Abtrennung
2.4 Molekularbiologische Methoden
2.4.1 DNA-Extraktion
2.4.1.1 Fast DNA® Spin for Soil (Q Biogene)
2.4.1.2 Bead Beater- Aufschluß
2.4.1.3 QIAamp® DNA-Stool Mini Kit (Qiagen 2001)
2.4.1.4 QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen 2003)
2.4.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
2.4.2.1 Primer
2.4.2.2 PCR-Programme
2.4.3 Gelelektrophorese und DNA-Detektion
2.4.4 DNA-Extraktion aus Agarosegel
2.4.5 Klonierung (Invitrogen 2004)
2.4.6 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)
2.4.7 Sequenzierung
2.4.7.1 Aufreinigung der Proben für die Sequenzier-PCR
2.4.7.2 Sequenzier-PCR
2.4.7.3 Aufreinigung der Proben für die Sequenzierung
2.4.7.4 Sequenzierung
2.4.8 Datenbank NCBI Blast
2.4.9 Catalyzed reporter deposition fluoreszenz in-situ Hybridisierung
2.4.9.1 Puffer und Lösungen für CARD FISH
2.4.9.2 Fixierung und Lysozym-Behandlung
2.4.9.3 Hybridisierung und Sonden
2.4.9.4 Fluoreszenzmikroskopie
2.5 Bakteriophagen-Plaquetest
2.5.1 Phagenextraktion
2.5.2 Somatische Coliphagen
2.5.3 F-spezifische Bakteriophagen
2.6 Kultivierung und Bestimmung von Mikroorganismen
2.6.1 Bakterienkultur auf Wassermedium
2.6.2 BIOLOG
2.6.2.1 Biolog Sedimentproben
2.6.2.2 Biolog Reinkulturen
2.6.3 Mycobakterien
2.6.3.1 Mycobakterien-Kultur
2.6.3.2 Färbemethoden für Mycobakterien
2.6.3.3 Identifizierung von Mycobakterien
2.6.4 Rasterelektronenmikroskopie

3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Phagenuntersuchung
3.2 CARD-FISH
3.2.1 Vergleich kumulative Berechnung vs. Einzelwertbetrachtung
3.2.2 Vergleich ALF1b mit ALF
3.2.3 Allgemeine Verteilung der Bakteriengruppen
3.2.4 Jahreszeitliche Betrachtung der Bakteriengruppen im Sediment
3.2.5 Auftreten der Bakteriengruppen 2005 und
3.2.6 Tiefenprofilabhängige Verteilung der Bakterien im Sediment
3.3 Allgemeine 16S-Klonierung und Sequenzierung
3.3.1 Artenspektrum
3.3.2 Jahreszeitlicher Vergleich
3.3.3 Vergleich Pelagial und Sediment
3.3.4 Besonderheiten der Proben der Vorsperre Forchheim
3.4 Vergleich der Ergebnisse von CARD FISH und Klonierung
3.5 Untersuchung bakterieller Stoffwechselleistungen mittels BIOLOG
3.5.1 Average Well Color Development (AWCD)
3.5.2 Vergleich der Proben
3.6 Wassermedium Kulturen
3.6.1 Charakterisierung der Kulturen auf Wassermedium
3.6.1.1 Koloniemorphologie
3.6.1.2 Gruppierung anhand von Restriktionsmustern
3.6.1.3 Sequenzierung
3.6.2 Charakterisierung einer neuen Spezies
3.6.2.1 Molekularbiologische Untersuchung
3.6.2.2 Physiologische Parameter
3.6.2.3 BIOLOG
3.6.2.4 Durchlichtmikroskopie
3.6.2.5 Rasterelektronenmikroskopie
3.6.3 Abgrenzung der neuen Spezies von bekannten Arten
3.7 Mycobakterien
3.7.1 Mycobakterien PCR
3.7.1.1 Vergleich verschiedener DNA-Extraktionsmethoden
3.7.1.2 Primervergleich
3.7.1.3 Mycobakterien im Sediment – Nachweis mittels PCR
3.7.2 Mycobakterien RFLP und Sequenzierung
3.7.5 Mycobakterien-Kultur

Zusammenfassung

Tabellenanhang

Literatur

Internetquellen und Datenbanken

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Ökologie von Talsperren

Talsperren dienen hauptsächlich der Trinkwasserversorgung, der Energiegewinnung und dem Hochwasserschutz. Allerdings bedingen sie auch, daß weltweit 20 % der jährlichen Sedimentfracht der Flüsse zurückgehalten wird. Das entspricht 2-5 * 10[9] metrischen Tonnen Sediment, welche die Weltmeere nicht erreichen (Takeuchi 1996). Außerdem führen Talsperren zu einer Unterbrechung von Fluß-Ökosystemen, was auf Fische einen enormen Einfluß hat. So erreichen wandernde Fische ohne extra angelegte Fischtreppen ihre Laichplätze nicht mehr. Außerdem entspricht die Wasserbeschaffenheit nach einer Talsperre nie der, die der Fluß ohne das Bauwerk aufweisen würde (Schönborn 2003). Allerdings stellen Talsperren auch einen neuen Lebensraum für Spezies dar, welche sich nicht in Flüssen ansiedeln würden und führten so zur Entstehung völlig neuer Ökosysteme. Diese werden maßgeblich durch die Verfügbarkeit der Nährstoffe, welche entweder allochthonen oder autochthonen Ursprungs sein können, beeinflußt.

Unter Nährstoffen versteht man neben organisch gebundenem Kohlenstoff insbesondere Phosphor- und Stickstoffverbindungen. Letztere werden neben dem Eintrag durch die Landwirtschaft aus dem Boden ausgespült, wo im Frühjahr die Mineralisierungsrate durch Ammonifikation und folgende Nitrifikation steigt. In saurer Nadelstreu, welche im Einzugsgebiet der untersuchten Talsperre Saidenbach als Auflage dominiert, erreicht die Mineralisierung bei 20 °C ein Optimum. Die Nitrifikation wird nicht durch NH3-Mangel begrenzt, da die Ammonifikationsrate in Nadelstreuauflagen stets höher ist als die Nitrifikationsrate (Frank 1996). Mittels des Gehaltes an Phosphor können Gewässer einer Trophiestufe zugeordnet werden. So wurden nach einer Empfehlung von Carlson (1977) die in Tabelle 1.1 aufgeführten Trophiegrade festgelegt.

Tabelle 1.1: Trophiestufen von Gewässern (nach CARLSON 1977, WETZEL 1983)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Bestimmung des Trophiegrades eines Gewässers erfolgt zur Frühjahrsvollzirkulation, da sich der Nährstoffgehalt im Jahresverlauf ändert. So führt zum Beispiel der Nährstoffreichtum des Gewässers im Frühjahr zu einer Massenentwicklung von Diatomeen. Diese entwickeln sich bis zur Sommerstagnation und sedimentieren nach dem Absterben aufgrund ihrer relativ hohen Dichte, welche durch ihre Kieselsäurehüllen bedingt ist (Uhlmann 2001). Dabei wird der in den Bakterien gebundene Phosphor temporär im Sediment abgelagert.

Häufig liegt Phosphat im Sediment an dreiwertige Eisenionen gebunden vor. Herrschen dort anoxische Verhältnisse, bedingt das niedrige Redoxpotential eine Eisensulfidbildung unter Freisetzung der Phosphationen, was zur Eutrophierung führt. Daher sollte der Nitratgehalt des Sedimentes nicht zu stark absinken (persönliche Mitteilung Benndorf 2005).

Für die Verteilung von Nährstoffen bzw. von Mikroorganismen, die einen großen Teil davon umsetzen, ist unter anderem die Vollzirkulation eines Gewässers von Bedeutung. Beeinflußt wird dieses Ereignis maßgeblich durch die sich ändernde Dichte des Wassers bei Temperaturänderung, das Verhältnis zwischen Tiefe und Oberfläche des Gewässers sowie die Schergeschwindigkeit von Luftströmungen. Viele Talsperren sind aufgrund ihrer relativ großen Oberfläche und geringen Tiefe dimiktisch. Das bedeutet, daß eine Frühjahrs- und Herbstvollzirkulation stattfindet. Diese Prozesse führen dazu, daß nicht nur die Nährstoffe verteilt werden, sondern auch Habitate zerstört und viele neue ökologische Nischen geschaffen werden. Die Intermediate Disturbance Hypothesis besagt, daß sich direkt nach massiven Störungen eines Ökosystems mehr Arten ansiedeln als vor dem Ereignis. Diese Störungen müssen in zeitlichen Intervallen erfolgen, in denen die Organismen sich nicht nur ansiedeln, sondern auch anpassen können. Nach der Vollzirkulation ist demnach auch eine größere Artenzahl an Organismen im Wasser zu erwarten.

Neben den abiotischen Faktoren haben auch die biotischen einen großen Einfuß auf ein Ökosystem. Die Vielfalt an Interaktionen zwischen den unzähligen Lebewesen ist außerordentlich groß. So existieren unter anderem neben symbiontischen oder kommensalischen auch parasitäre oder Räuber-Beute-Beziehungen. Letztere werden durch den Fraßdruck (top-down) bzw. Beutemangel (bottom-up) reguliert (Mc Queen 1986). So kann ein Ökosystem nur funktionieren, wenn wenigstens die untersten trophischen Ebenen verfügbar sind. Das sind bezogen auf die Talsperren die Produzenten, welche aufgrund ihrer autotrophen Lebensweise anorganische in organische Biomasse umwandeln, sowie die heterotrophen Primär- bzw. Sekundärkonsumenten. Überaus wichtig für ein Ökosystem sind auch die Destruenten, welche durch Mineralisation organischen Materials Nährelemente in den Kreislauf zurückführen. Diese Leistung wird vor allem von Bakterien, welche in allen Bereichen der Talsperre vorkommen, vollbracht. Diese können entweder frei suspendiert, an anorganischem Material oder als Aggregation z.B. in Biofilmen vorkommen. Die Mikroorganismen können neben ihrer Aufgabe als terminale Zersetzer jedoch auch als Produzenten ganz am Anfang der Nahrungskette stehen. Ein Beispiel dafür sind die photoautotroph lebenden Cyanobakterien. Da der größte Teil der Bakterienspezies noch nicht bekannt ist, lassen sich keine endgültigen Aussagen über die Gesamtheit der mikrobiellen Interaktionen treffen. Um diese Wechselbeziehungen zu erforschen, bedarf es einer Kultivierung der Bakterien. Das ist jedoch, in Abhängigkeit vom Habitat der Mikroorganismen bisher nur bei 0,001 % bis 15 % der Spezies gelungen. Aus dem Wasser mesotropher Seen konnten nur 0,1 bis 1 % der Bakterien kultiviert werden (Amann 1995).

1.2 Die Talsperre Saidenbach

Die Talsperre Saidenbach wurde in den Jahren 1929 bis 1933 erbaut. Sie ist mit einem Stauraum von 22,38 Mio. m[3] die größte Trinkwassertalsperre im Mittleren Erzgebirgskreis und zählt neben der Talsperre Eibenstock, welche einen Stauraum von 75 Mio. m[3] aufweist, zu den größten Trinkwasserreservoirs Sachsens. Die Talsperre Saidenbach versorgt die Wasserwerke Einsiedel und Zschopau mit Rohwasser. Die mittlere Abgabemenge beträgt dabei 780 l/s. Gestaut wird der Wasserlauf des Saidenbaches, des Haselbaches, des Lippersdorfer Baches und des Hölzelbergbaches, welche über 10 Vorbecken und eine Vorsperre die Talsperre erreichen. Bei Vollstau hat die Talsperre eine Wasseroberfläche von 146,41 ha. Aufgrund des Verhältnisses zwischen Tiefe und Oberfläche findet im Wasserkörper unter normalen Bedingungen eine Frühjahrs- und Herbstvollzirkulation statt. Die Talsperre ist dimiktisch. Das Wassereinzugsgebiet umfaßt eine Fläche von 60,783 km[2] und wird zu 72% landwirtschaftlich genutzt (LTV 2006). Der mesotrophe Status der Talsperre Saidenbach (Wobus 2003) entwickelte sich in den letzten Jahren immer mehr in Richtung der Oligotrophie. Dies ist größtenteils auf die Nutzung phosphatfreier Waschmittel seit den 90er Jahren zurückzuführen. Auch eine effektivere Durchsetzung der Einhaltung von Schutzzonen bezüglich landwirtschaftlicher Nutzung seit den 90er Jahren hat zu einem Rückgang der Nährstoffeinträge geführt.

Neben der Trinkwasserbereitstellung dient die Talsperre Saidenbach auch dem Hochwasserschutz. Ein Überlaufen während des Hochwassers von 2002, bei welchem auch viele Erzgebirgsbäche extrem hohe Pegel aufwiesen, konnte jedoch nicht verhindert werden. Dieses Extremereignis hatte einen entscheidenden Einfluß auf das Ökosystem der Talsperre. So wurden zum Beispiel unzählige Karpfen, welche sich im Normalfall in größeren Tiefen aufhalten, über den Überlauf aus dem Gewässer gespült (Uhlig 2006, persönliche Information). Nach diesem Ereignis wurden neu geschaffene ökologische Nischen besiedelt sowie Interaktionen zwischen den Spezies bzw. den Arten und ihrer Umgebung ausgebildet.

Diese Arbeit soll den Gewässerkomplex der Talsperre Saidenbach hinsichtlich einiger ausgewählter ökologischer Gesichtspunkte mit dem Schwerpunkt der mikrobiellen Biozönose charakterisieren. Die Untersuchungsobjekte sind die Talsperre Saidenbach mit den Probenahmestellen E (Entnahmestelle), S (Saidenbach) und H (Haselbach) sowie die Vorsperre Forchheim mit der Probenahmestelle F. Die geographische Lage der Gewässer sowie die näherungsweise Angabe der Beprobungsstellen sind aus Abbildung 1.1 ersichtlich.

Die Talsperre Saidenbach sowie die Vorsperre Forchheim befinden sich im Mittleren Erzgebirgskreis in Sachsen, in der Nähe von Marienberg. Die Zuläufe erreichen die Talsperre aus dem Kreis Freiberg bzw. dem Mittleren Erzgebirgskreis.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.1: Geografische Lage des Untersuchungsgebietes

Abbildungsnachweis: Bild oben: LVA 2001

Bild mitte: LfUG 2002

Bild unten: LfUG 2006

Die Elimination des durch die Landwirtschaft eingetragenen Phosphors und Stickstoffs sowie von Schwebstoffen wird sowohl durch die Vorsperre Forchheim mit der Probenahmestelle F als auch durch 10 Vorbecken, wovon vier als Unterwasser- Vorsperren angelegt sind, realisiert. Die Unterwassersperre des Saidenbaches ist in Abbildung 1.2 dargestellt. Die Verweildauer des Wassers in diesen nährstoffeliminierenden Becken sollte 3 bis 5 Tage betragen, um die Sedimentation von allochthonem Material und Phytoplanktern, welche zunächst frei verfügbares Phosphat binden, sicherzustellen. Bedingt durch diese Funktion ist eine Beräumung dieser Absetzbecken relativ häufig nötig (Uhlmann und Horn 2001).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.2: Unterwasser-Vorsperre der Talsperre Saidenbach, verändert nach Uhlmann und Horn 2001

Die Geschwindigkeit des Wassers wird an der Tauchwand herabgesetzt. Dadurch können Partikel geringerer Größe sedimentieren, welche sonst bei höheren Fließgeschwindigkeiten mitgerissen werden. Die Probenahmestelle H befindet sich in Fließrichtung direkt vor der Unterwassermauer, an welcher das Sediment folglich mächtiger ist als an der Probenahmestelle S, welche sich nach der Mauer befindet. Aufgrund der Architektur der Tauchwand und der Unterwassermauer gelangt nur das vorgereinigte meta- bzw. hypolimnische Wasser in die Talsperre Saidenbach. Die nächste und letzte Barriere in Fließrichtung stellt die Staumauer mit einer Höhe von 48 m und einer Länge von 334 m dar. Davor befindet sich die Probenahmestelle E. Das Sediment ist an dieser Stelle erwartungsgemäß am mächtigsten.

1.3 Aspekte der Trinkwasseraufarbeitung

Das Rohwasser der Talsperre Saidenbach wird in den Wasserwerken Zschopau und Einsiedel zu Trinkwasser aufgearbeitet. Um eine gleichbleibend gute Qualität des Trinkwassers zu gewährleisten, steht mit der novellierten Trinkwasserverordnung (TVO), inkraftgetreten 2003 (BGBl 2001), ein nationaler Standard zur Verfügung. Darin ist geregelt, daß je 1 ml Trinkwasser nicht mehr als 100 Bakterien mittels Kultivierung auf Nähragar bei Inkubation für 24 Stunden bei 20 °C bzw. 36 °C nachweisbar sein dürfen. Außerdem dürfen sich in 100 ml Wasser weder coliforme Keime, E. coli oder Fäkalstreptokokken sowie in Trinkwasser aus Oberflächengewässern keine Clostridien bzw. deren Sporen befinden. Coliforme Bakterien sind Indikatororganismen für fäkale Verunreinigung. Da sich im Falle des Auftretens humanpathogener Bakterien und Viren in einem Säugetierorganismus diese in den Fäkalien befinden, wird der Nachweis von coliformen Keimen bzw. Fäkalstreptokokken als Hinweis auf das mögliche Vorkommen potentieller Krankheitserreger gewertet. Im Rohwasser, so wie es in der Talsperre verfügbar ist, lassen sich allerdings coliforme Keime und gelegentlich E. coli nachweisen. Es ist die Aufgabe der Wasserwerke, die Trinkwasserqualität entsprechend der TVO sicherzustellen. Dafür werden neben physikalischen Fällungs- und Filtriermethoden auch diverse Desinfektionsmaßnahmen, wie zum Beispiel Chlorierung oder Ozonierung, durchgeführt. Die Effektivität dieser Behandlung ist unter anderem von der Behandlungsdauer, dem Wiederverkeimungspotential, der Konzentration der eingesetzten Substanz und der Resistenz bestimmter Mikroorganismen abhängig. In Abbildung 1.3 ist dargestellt, wie resistent Mikroorganismen bzw. biologische Strukturen wie Prionen gegenüber Desinfektionsmitteln im Allgemeinen sind.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.3: Resistenz gegenüber Bioziden (verändert nach MARA 2003)(- geringe Resistenz, + hohe Resistenz)

Interessant in Hinblick auf die Eliminierung von Krankheitserregern aus dem Trinkwasser ist die Tatsache, daß Mycobakterien, bedingt durch ihre Mykolsäure-Zellwand, relativ hohe Resistenzen gegenüber Desinfektionsmitteln aufweisen. Sehr resistent sind auch Interaktionen zwischen Pro- und Eukatyonten, wie sie zum Beispiel bei Legionellen vorkommen, oder Sporen, wie sie von Clostridien gebildet werden.

1.4 Mikrobielle Biozönose

Die mikrobielle Biozönose eines Gewässers ist durch diverse Interaktionen zwischen den Lebewesen gekennzeichnet. So gibt es neben den autotrophen Produzenten, welche anorganischen Kohlenstoff in organische Formen überführen, auch heterotrophe Organismen, welche diesen durch ihre Abbauleistung wieder zu Kohlendioxid oxidieren. Dabei kann es vorkommen, daß schwer zersetzbare Moleküle zum vollständigen Abbau zunächst von Mikroorganismen mit einem dafür prädestinierten Enzymbestand degeneriert werden müssen. Die so entstehenden Fragmente können wiederum durch andere Bakterien oder Pilze verwertet werden (Rheinheimer 1991). Viele Mikroorganismen verwerten Substrate unter Freisetzung von Verbindungen, welche durch andere Arten nutzbar sind. Die Spezies Escherichia coli und Proteus vulgaris können in Form einer Metabiose zum Beispiel ein Harnstoff-Lactose-Medium verstoffwechseln. Escherichia coli ist dabei in der Lage, Lactose zu zersetzen, während Proteus vulgaris Harnstoff abbaut. Die Spaltprodukte werden vom jeweils anderen Bakterium als C- bzw. N-Quelle genutzt (Schwartz 1961). Als Interaktionen sind neben der Metabiose auch Aufwuchs, Kommensalismus, Symbiose, Konkurrenz, Grazing und Parasitismus zu beobachten (Rheinheimer 1991). Diese Wechselwirkungen finden auf so vielfältige Weise statt, daß erst ein geringer Teil davon verstanden ist.

Bakterien können im Wasser entweder frei suspendiert, in Flocken, als Aggregate oder oberflächenassoziiert an organischem sowie anorganischem Material als Biofilm vorkommen. In Sediment sind viele Spezies partikelgebunden.

Die meisten im Freiwasser und Sediment der gemäßigten Breiten natürlich vorkommenden Bakterienspezies sind psychrophil oder psychrotolerant. Diese Kaltwasseradaptation ermöglicht die Nutzung von Nährstoffressourcen in kühlen, tiefen Gewässerschichten bzw. im Winterhalbjahr.

Da der Bestand an Mikroorganismen in einem Gewässer so groß ist, daß eine komplette Erfassung mit derzeitigen Diagnosemethoden unmöglich ist, wurden, um Untersuchungen zu vereinheitlichen und vergleichbar zu machen, einige Bakterienspezies zu phylogenetischen Gruppen zusammengefaßt. Für diese Gruppen wurden spezielle Nachweismethoden entwickelt, mit welchen eine erste Charakterisierung einer Gewässer- bzw. Sedimentprobe durchgeführt werden kann. So werden zum Beispiel Archaea- spezifische Primer genutzt, um Aussagen über den Bestand der Archaebakterien treffen zu können. In der Catalyzed Reporter Deposition Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (CARD FISH) kommen Oligonukleotidsonden zum Einsatz, mit welchen sich zum Beispiel die einzelnen Gruppen der Proteobakterien oder des Cytophaga-Flavobakterien-Komplexes nachweisen lassen.

1.4.1 Phagen

Eine besondere Form der Interaktion zwischen Mikroorganismen stellt die Beziehung zwischen Phagen und Bakterien dar.

Phagen sind Viren, welche Bakterien infizieren. Sie sind ubiquitär und befallen eine Vielzahl von Archae- und Eubakterienspezies, auch Cyanobakterien (Suttle 2000), Mycobakterien oder die zur Lebensmittelherstellung genutzten Lactobazillen (Kutter 2005). Phagen sind die zahlenmäßig am häufigsten vorkommenden „Lebensformen“ auf der Erde. Ihre Gesamtzahl wird weltweit auf 10[30] bis 10[32] geschätzt (Kutter 2005). Selbst in voralpinen Gebirgsseen wurden Konzentrationen von bis zu 2 * 10[8] plp ml-[1] nachgewiesen (Bergh 1989). Phagen sind nicht zur Eigenbewegung befähigt. Sie werden entweder im Wirtsorganismus transportiert oder mittels Diffusion in stehenden bzw. durch Strömung in fließenden limnischen oder marinen Systemen verfrachtet. Die Erkennung des Wirtes erfolgt durch spezifische Rezeptorareale an der Bakterienzellwand, welche durch Lipopolysaccharide bzw. Lipoproteide gebildet werden. Diese Domänen bedingen auch die Wirtsspezifität. Diese ist außerdem abhängig vom Trophiegrad des Gewässers. Je nährstoffreicher ein Ökosystem ist, desto höher ist die Wirtsspezifität (Kutter 2005). Diese Selektivität kann dazu führen, daß nur noch einzelne Stämme einer Bakterienart durch eine Phagenspezies befallen werden können (Baross 1978).

Phagen besitzen eine überaus hohe Resistenz gegenüber UV- Licht der Wellenlänge 260 nm sowie einige Spezies gegenüber pH-Werten bis 3. Der normale Toleranzbereich liegt jedoch bei pH 5 bis pH 8 (Kutter 2005).

F-spezifische Bakteriophagen

Einige Bakterien, wie z.B. Salmonella typhimurium, können filamentöse Ausstülpungen der Zelloberfläche, sogenannte Pili, ausbilden, welche dem Gentransfer innerhalb der Bakterienspezies dienen. Einige Phagenarten der Gruppen Podoviridae (DNA) bzw. Leviviradae (RNA) adsorbieren ausschließlich an spezifische Rezeptorareale an den Pili.

Infektionszyklus am Beispiel der T-Phagen:

Der Infektionszyklus bei T-Phagen wird eingeleitet, indem das Virus mit dem Schwanz an spezielle Rezeptordomänen bindet. Dabei wird die Phagenadsorption durch die Konzentration bestimmter Ionen, wie z.B. Ca[2]+ und Mg[2]+, im umgebenden Medium beeinflußt. Nach der Anheftung des Phagen erfolgt die Bindung der Spikes an die Wirtszellwand. Eine Kontraktion der viralen Schwanzröhre führt zur Beschädigung der äußeren Lagen der bakteriellen Zellwand. Deren Mureinschichten werden mittels Phagenlysozym in Disaccharide zerlegt. Nach vollständiger Penetration wird durch fortlaufende Kontraktion des Virus die Nukleinsäure aus dem Kopf des Phagen in den Wirt injiziert. Sofort beginnt in der Bakterienzelle die Translation der frühen Proteine.

Diese bedingen z.B. die Synthese und Methylierung der Phagen-DNA, so daß diese nicht durch das Restriktionssystem der Wirtsorganismen abgebaut wird. Die sogenannten späten Proteine sind hauptsächlich Struktureiweiße, welche zur Kapselsynthese notwendig sind. Ein enzymatisch wirkendes spätes Protein ist das zur Penetration der Wirtszelle notwendige Lysozym. Dieses wird terminal in den Phagenschwanz integriert (Schuster 1998). Vor der Lyse der Bakterienzelle erfolgt das self-assembling der Viren, welches mittels bestimmter molekularer Konformationen der Strukturproteine realisiert wird. Das Platzen der Wirtszelle wird durch Lysine erreicht, welche die vier Hauptbindungen des Mureins hydrolysieren. Als konservierte Lysine werden Muramidase, Glucosamidase, Endopeptidase und L-Alanin-Amidase gebildet. Darüber hinaus können spezifische Substrate zur Lyse synthetisiert werden (Kutter 2005). Bei Einzelstrang-DNA-Phagen, wie z.B. ΦX174, wird nach Infektion zunächst aus der ssDNA ein Doppelstrang mittels der wirtseigenen DNA-Polymerase synthetisiert. Dieser wird als replikative Form (RF) bezeichnet. Je besser der Ernährungszustand einer Bakterienzelle ist, desto mehr Replikationsorte für RF sind vorhanden (Schuster 1998).

Temperente Phagen:

Unter temperenten Phagen versteht man Viren, welche sich zunächst in das bakterielle Genom integrieren und dort bei jeder Zellteilung an die nächste Generation weitergegeben werden. Es kommt erst zur Lyse des Wirtes, wenn ein spezifischer Repressor in der Bakterienzelle inaktiviert wird, was durch Stressoren wie UV-Licht, Mitomycin oder Ascorbinsäure geschehen kann. Die DNA der Phagen trägt Informationen, welche die Physiologie und die Morphologie der Bakterienzelle manipulieren können. So kann es zur Geißelbildung durch Phagenbefall kommen (Schuster 1998). Manche apathogenen Bakterien werden nach Infektion mit Phagen humanpathogen. So wird erst nach Integration des tox -Genes des Phagen β in das Genom von Corynebacterium diphtheriae das Diphtherietoxin gebildet, was Membranschädigung, Herzschäden, vasomotorische Schocks und Blutungsneigung bedingt (Schuster 1998). Weder der Phage noch das Bakterium sind einzeln für den Menschen pathogen. Ähnlich verhält es sich mit der Evolution von Vibrio cholerae. Die Pathogenität dieses Bakteriums wurde durch zwei Phagenspezies bedingt. Nach der Aufnahme des tcp -Operons vom VPI-1 Phagen ins bakterielle Genom wird der Rezeptor TCP exprimiert. An diesen Rezeptor bindet CTXΦ, ein temperenter Phage, welcher nach Insertion seiner DNA ins Wirtsgenom die Pathogenität des Bakteriums durch Bildung des Choleratoxins vermittelt (Faruque 1998). Auch die Produktion der zwei Shiga-Toxine Stx1 und Stx2 in E. coli O157:H7 wird durch Bakteriophagen induziert (Dumke et al. 2004).

Viele Bakterien tragen temperente Phagen im ihrem Genom. Bei der Untersuchung der Sequenzdaten wurde festgestellt, daß bei Eliminierung der viralen DNA aus dem Genom eine Sequenzhomologie erreicht wird. Daher mußten einige bis dahin unterschiedliche Spezies zu einer Art zusammengefaßt werden (Schuster 1998).

Phagen als Indikatorsystem:

In den Fäces von Säugetieren können sich neben apathogenen Bakterien, welche immer ausgeschieden werden, sowohl pathogene Bakterien als auch Viren befinden. Einige Phagen befallen Enterobacteriaceae. Da humanpathogenen Bakterien, so diese vorhanden sind, häufig mit Enterobacteriaceae ausgeschieden werden, ist der Nachweis hinsichtlich fäkaler Kontaminationen auch mittels einer Untersuchung der Proben auf Bakteriophagen möglich. Phagen werden permanent und in höheren Konzentrationen als humanpathogene enterale Viren ausgeschieden. Für die Untersuchung von Proben auf humanpathogene Viren ist der Phagennachweis bedingt geeignet. Da das Verhältnis zwischen humanpathogenen Viren und Bakteriophagen mehr als 1:1000 beträgt, kann man davon ausgehen, daß sich bei negativem Phagenbefund auch keine medizinisch relevanten Viren in der Probe befinden (Röske 2005). Da sich in einer Bakterienzelle mehrere hundert Viruspartikel befinden können, ist der Phagennachweis eine sehr sensible Indikatormethode.

Spezies folgender Phagengruppen sind in der Lage Enterobacteriaceae zu infizieren (Kutter 2005):

Microviridae: Diese lytischen ssDNA-Viren mit Polyederform haften sich an die Zellwand an und bilden als Haftstruktur Spikes aus. Ein Beispiel aus dieser Gruppe ist der somatische Coliphage ΦX174.

Tectiviradae: Die Rezeptoren dieser lytischen dsDNA-Viren befinden sich an der Zellwand bzw. an den Pili der Bakterien. Die polyedrischen Phagen bilden Spikes aus.

Leviviradae: Diese Gruppe piliassoziierter Viren haftet mit apikalen Proteinen an der Wirtszelle. Die lytischen ssRNA-Phagen ähneln bezüglich der polyedrischen Morphologie dem Poliovirus.

Inovirus: Die filamentösen ssDNA-Viren haben einen temperenten Lebenszyklus. Die Anheftung an die Pili des Wirtes erfolgt mittels eines Virus- „Dorns“

1.4.2 Mycobakterien

Mycobakterien sind aerobe, unbewegliche, langsam wachsende, stäbchenförmige Bakterien (Sneath 1986). Sie bilden keine Toxine. Die Zellwand enthält neben dem Peptidoglycan Polysaccharide, Proteine, Phospholipide und vor allem Wachse und Glycolipide, welche bis zu 60 % der Bakterientrockenmasse ausmachen (Hof 2005). Die Wachse bestehen größtenteils aus Mycolsäuren, welche 60 bis 80 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette enthalten können (Vinzelberg 2002). Dieser besondere Aufbau der Zellwand bedingt die relativ hohe Resistenz gegenüber vielen Desinfektionsmitteln (Taylor 2000, LE Chevallier 2001) sowie die Säurefestigkeit, welche als ein Nachweiskriterium für Mycobakterien gilt. Die Resistenzen der Mycobakterien stellen ein Problem bei der Trinkwasseraufarbeitung dar. So wurden schon viele Infektionen durch Spezies dieser Gattung durch kontaminiertes Trinkwasser hervorgerufen. In Tabelle 1.2 sind einige ausgewählte Fälle zusammengefaßt. An diesen Beispielen wird deutlich, daß trotz ordnungsgemäßer Aufarbeitung des Wassers immer wieder Infektionen durch Mycobakterien hervorgerufen werden. Diese Bakterien konnten offensichtlich bei der Fällung bzw. Desinfektion im Wasserwerk nicht eliminiert werden.

Tabelle 1.2: Beispiele für Infektionen durch mit Mycobakterien kontaminiertes Trinkwasser (MAC…Mycobacterium avium complex)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Spezies der Gattung Mycobacterium lassen sich in Komplexe von Arten mit ähnlicher 16S rRNA Sequenz gruppieren.

So gehören dem Mycobacterium-tuberculosis-Komplex die Arten M. tuberculosis, M. bovis,M. africanum, M. microti, M. leprae und M. lepramurium an (Vinzelberg 2002). Die Spezies unterscheiden sich jedoch in ihrer Pathogenität. Statistisch betrachtet infiziert sich in jeder Sekunde ein Mensch mit Tuberkuloseerregern. Jedes Jahr sind 7 bis 8 Millionen Menschen davon betroffen. Nach Angabe der WHO werden bis 2020 eine Milliarde neue Infektionen, 200 Millionen Neuerkrankungen und 70 Millionen daraus resultierende Todesfälle erwartet (Küchler 1998). Die Bakterien dieses Komplexes sind direkt von Mensch zu Mensch übertragbar. Bei allen anderen durch Mycobakterien hervorgerufenen Krankheiten spielen bis auf wenige Ausnahmen andere Infektionsquellen, welche nicht selten in der Natur zu finden sind, eine entscheidende Rolle (Pedley 2004). Die Bakterien des Mycobacterium avium Komplexes (MAC) sind die in Europa am häufigsten isolierten humanpathogenen Mycobakterien (Pedley 2004). Meist bedingen diese Bakterien pulmonale Erkrankungen oder Hautinfektionen.

Viele Mycobakterien sind humanpathogen oder führen in Kombination mit einem geschwächten Immunsystem wie bei AIDS-Infizierten oder immunsupprimierten Patienten zum Ausbruch einer Krankheit. Von den 31 zwischen 2003 und 2005 neu beschriebenen Mycobakterien-Arten wurden 26 aus Menschen isoliert (Tortoli 2005).

Es existieren jedoch auch einige Mycobakterien-Spezies, welche keine Infektionen hervorrufen bzw. bei denen dieses möglicherweise vorhandene Potential noch nicht bekannt ist. Zu diesen in der Literatur als atypische Mycobakterien bezeichneten Spezies, gehören unter anderem Mycobacterium agri bzw. Mycobacterium vaccae.

Die taxonomische Einordnung der Mycobakterien ist aus Abbildung 1.4 ersichtlich.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.4: Taxonomische Einordnung der Mycobakterien

Darüber hinaus werden die Mycobakterien auch entsprechend der Parameter Farbstoffbildung der Kolonien und Wachstumsgeschwindigkeit nach Runyon (s. Tab. 1.3) klassifiziert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1.3: Gruppeneinteilung der Mycobakterien nach Runyon (verändert nach HOF 2005)

Der Aufwand für die Kultivierung von Mycobakterien unterscheidet sich erheblich von dem der meisten anderen Mikroorganismen. Da Mycobakterien sehr langsam wachsen und konkurrierende Mikroorganismen während dieser Wachstumsphase das Kulturmedium besiedeln würden, muß dem Selektivagar ein Antibiotikasupplement hinzugefügt werden. Das so genannte PACT besteht aus vier Antibiotika. Während der Wirkstoff Polymyxin B gegen viele gramnegative Bakterien wirkt, hemmt Amphotericin, ein Fungizid, das Wachstum von Hefen und Pilzen. Carbenicillin inaktiviert die Transpeptidase, welche zur Vernetzung der Pepdigoglycanschichten bei gramnegativen Bakterien notwendig ist. Das vierte Antibiotikum Trimethoprim wirkt effektiv gegen Streptokokken und Aktinomyceten, allerdings auch gegen Mycobacterium marinum (AHC 2006).

Mycobakterien können auch durch Phagen infiziert werden. Bisher sind einige temperente Phagen (Pedulla 2003) und ein lytischer Phage, der Myovirus Bxz1, in Mycobakterien nachgewiesen worden. Der Versuch, Phagen als Indikatorsystem für den Nachweis von Mycobakterien zu nutzen, war jedoch nicht erfolgreich (Kutter 2005).

1.5 Zielstellung

Um die Funktion und Interaktion von Mikroorganismen in Gewässersystemen aufzuklären soll die mikrobielle Biozönose des Pelagials sowie des Sedimentes der Talsperre Saidenbach und deren Vorsperre Forchheim charakterisiert werden. Dazu soll mittels Catalyzed Reporter Deposition Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (CARD FISH) untersucht werden, welche Bakteriengruppen in welcher Häufigkeit in Abhängigkeit von der Jahreszeit, der Probenahmestelle und der Horizonttiefe im Sediment bzw. in einer Sedimentfalle vorkommen.

Außerdem sollen Klonbibliotheken der gleichen Proben, welche in der CARD FISH untersucht wurden, angelegt und die Ergebnisse der Klonierung mit denen der CARD FISH verglichen werden.

Das Sediment soll weiterhin mittels Klonierung mykobakterienspezifischer 16S rRNA und Kultivierung auf Selektivnährmedien auf das Vorkommen und das Artenspektrum von Mycobakterien untersucht werden.

Des weiteren soll im Sediment und dem Porenwasser die Menge somatischer Coliphagen und F-spezifischer Bakteriophagen, welche Indikatororganismen für fäkale Verunreinigungen darstellen, bestimmt werden.

Das Wasser aus dem Pelagial soll auf die Zusammensetzung hinsichtlich kultivierbarer Bakterien untersucht werden.

2 Material und Methoden

2.1 Bakterienstämme, Phage, Plasmid

Phagenuntersuchung:

Für die Untersuchung des Sedimentes auf das Vorkommen von F-spezifischen RNA-Bakteriophagen wurde als Wirtsorganismus Salmonella typhimurium, Stamm WG49, phage type 3, Nalr (F’ 42 lac::Tn5), NCTC 12484 nach ISO 10705-1:1995(E) eingesetzt. Der Stamm ist der Risikoklasse 2 zugeordnet.

Die Ermittlung der Konzentration der Somatischen Coliphagen im Sediment sowie im Porenwasser erfolgte mittels Escherichia coli, Stamm WG5, ATCC 700078 entsprechend ISO/DIS 10705-2.2.

Als Positivkontrolle für Somatische Coliphagen wurde eine Kultur von ΦX174, ATCC 13706-B1 nach ISO/DIS 10705-2.2 mitgeführt.

Klonierung:

Zur Klonierung wurden Aliquote von Escherichia coli, Stamm F’ { lac IqTn 10 (TetR)} mcr A Δ(mrr-hsd RMS- mcr BC) Φ80 lac ZΔM15 Δ lac X74 rec A1 ara D139 Δ(ara-leu)7697 gal U gal K rps L (StrR) end A1 nup G sowie das Plasmid pCR®2.1-TOPO® (Abbildung 2.1) mit Insertionssequenz im lac Z-Operon und kombinierter Ampicillin- und Kanamycinresistenz eingesetzt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.1 Plasmid pCR®2.1-TOPO® (Abb.: Invitrogen 2004)

2.2 Nährmedien

2.2.1 Nährmedium zur Anzucht von E. coli bei der Klonierung

S.O.C. Medium

Dieses Medium dient der initialen Vermehrung von E. coli direkt nach der Klonierung vor dem Ausspateln auf LB-Medium.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Luria-Bertani-Agar (LB)

Escherichia coli wurde im Rahmen der Klonierungen sowie zur Erstellung der Klonbanken auf LB-Agar (Sambrook et al. 1989) angezüchtet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Dem LB-Agar wurde nach dem Autoklavieren und Temperieren auf 50°C Ampicillinlösung mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugefügt, um den ampicillinresistenten Stamm (s. 2.1) selektiv zu begünstigen.

2.2.2 Nährmedien zur Untersuchung biochemischer Stoffwechselleistungen

Die nachfolgend aufgeführten Nährmedien dienten ausschließlich der Untersuchung kultivierbarer Mikroorganismen aus den untersuchten Proben.

Wasser-Agar:

Dieses Medium wurde zur Kultivierung von Bakterien verwendet, um diesen möglichst alle an ihrem natürlichen Standort vorkommenden Nährstoffe zur Verfügung zu stellen. Zur Herstellung wurde Wasser analog der zu untersuchenden Region (F bzw. E) mit 10 g Agar versetzt und autoklaviert.

Schwärm-Agar (SAA-NBK-SCHWRAG2)

Die Beweglichkeit der Bakterien, welche durch Begeißelung bzw. motorische Proteine (Kapitel 3.4.2) bedingt sein kann, läßt sich im Schwärm-Agar mittels Impfstichtechnik nachweisen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nähragar (SAA-NBK-NAEHPAG-03)

Nähragar dient der Kultivierung der verschiedensten Bakterienspezies. Er eignet sich nur eingeschränkt zur Selektion bestimmter Spezies.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

DEV-Simmons-Citrat-Schrägagar (SAA-NBK-CITRTAG-03)

Citrat-Agar ist ein Selektivmedium zur Differenzierung von E. coli und Coliformen. Letztere bewirken durch Citratverwertung einen Farbumschlag des enthaltenen Indikators Bromthymolblau von Grün nach Blau (Biotest 1992).

Citrat-Agar: 0,2 g Ammoniumdihydrogenphosphat

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Aeromonaden-Agar (SAA-NBK-AEROMAG-03)

Aeromonas spp. und Pleisiomonas shigelloides wachsen auf diesem Medium als dunkelgrüne, matte Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,5 mm.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Campylobacter-Agar nach Blaser-Wang (SAA-NBK-CAMPYAG-04)

Die Basis des Nährmediums ist vergleichbar mit Blut-Agar, jedoch hemmt das Supplement Enterobakterien, grampositive Keime sowie Hefen und Pilze weitgehend.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Eigelb-Lactose-Agar (SAA-NBK-EILACAG-03)

Lactosespaltende Bakterien bedingen einen Farbumschlag des Indikators nach Gelb, während lactosenegative Keime Weiß- Violett wachsen. Besitzen die Mikroorganismen Lecithinase, wie zum Beispiel die Cereus -Gruppe der Bacillus spp., ist ein getrübtes Präzipitat um die Kolonien zu erkennen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach dem Autoklavieren wurde das Medium auf 50°C temperiert, ein pH-Wert von 7,4 mit Na2CO3 (1 M) eingestellt und 107 ml Eigelb-Emulsion zugegeben.

Leifson-Agar (SAA-NBK-LEIFSAG-04)

Hohe Konzentrationen Desoxycholat und Citrat im Leifson-Agar hemmen das Wachstum grampositiver Flora sowie teilweise das der Coliformen. Gutes Wachstum zeigen Salmonellen und Shigellen (Biotest 1992).

Leifson-Agar: 5 g Pepton aus Fleisch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Winkle-Agar (SAA-NBK-WINKLAG-03)

Bakterien, welche zur Lactosespaltung befähigt sind, verursachen eine Säuerung des Nährmediums, in dessen Folge die Farbe des Indikators Bromthymolblau nach Gelb umschlägt. Keime der Salmonella-Shigella-Gruppe wachsen in glasig grünen Kolonien. Proteus spp. schwärmt auf diesem Medium nicht.

Winkle-Agar: (1) 10 g Lactosemonohydrat in 30 ml Aqua dest. lösen

(2) 5 g Metachromgelb bei 70°C in 250 ml Aqua dest. lösen

Lösung (2) filtrieren und bei 70°C sterilisieren

(3) 30 ml Lösung (1), 14 ml Lösung (2) und 20 ml Bromthymolblau 0,5% kurz aufkochen

(4) 1 l Aqua dest und 56 g Nähragar autoklavieren und auf 50°C abkühlen und Ansatz (3) zugeben

Blut-Agar (SAA-NBK-SCHOKAG-03)

Dieser Agar ist ein relativ nährstoffreiches Medium für eine Vielzahl von Bakterienspezies. Auch sehr anspruchvolle Mikroorganismen können auf Blut-Agar kultiviert werden. Die Verwertung des Hämoglobins während des Mikroorganismenwachstums läßt eine Einteilung der Bakterien in drei Gruppen zu. Erfolgt eine Reduktion des Hämoglobins zu Biliverdin (Oethinger 2000), bezeichnet man dies als α-Hämolyse. Sie ist an grünen Zonen um die Bakterienkolonien zu erkennen. Bei der β-Hämolyse wird der Blutfarbstoff vollständig abgebaut, so daß die Kolonien von einem hellen Hof umgeben sind. Findet keine Hämolyse statt, bezeichnet man dies als γ-Hämolyse (Seeliger 1990).

Blut Agar: 39 g Columbia Agar Basis sterilisieren, abkühlen auf 50 °C

50 ml defibriniertes Schafblut und

5 ml Hämin-Stammlösung (0,05%) zugeben

bei 72 °C sterilisieren, abkühlen auf 45 °C

2 ml NAD-Stammlösung (0,5%) zugeben

Kligler-Schrägagar (SAA-NBK-KLIGLAG-02)

Der Eisen-Zweizucker-Agar nach Kligler dient der Identifizierung gramnegativer Darmbakterien. Der enthaltene Indikator Phenolrot zeigt durch Farbreaktion an, ob Zucker unter Säurebildung abgebaut werden kann. Der Farbumschlag erfolgt im gegebenen Fall von Rot-Orange nach Gelb (Biotest 1992).

Kligler-Agar: 1,5 g Pepton aus Casein

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Sabouraud-Agar (SAA-NBK-SABGKAG-03):

Dieses Nährmedium dient der selektiven Vermehrung von Hefen, Schimmelpilzen und Dermatophyten.

Sabouraud-Agar: 10 g Caseinpepton

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Bei diesem Agar handelt es sich um ein Mangelmedium für heterotrophe Mikroorganismen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Galle-Chrysoidin-Glycerol-Agar (SAA-NBK-GRUENAG-03)

Der Nährboden dient der Kultivierung gramnegativer Bakterien und ähnelt in der Selektivität dem MacConkey-Agar, ermöglicht jedoch charakteristischere Koloniebildung pathogener Enterobacteriaceae.

Galle-Chrysoidin-Glycerol-Agar: 42,8 g Galle-Chrysoidin-Agar-Basis (Oxoid)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.3 Mycobakterien-Kultivierung

N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Lösung

Zur Vorbehandlung der Proben für die Mycobakterien-Kultur wurde N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Lösung entsprechend DIN 58943-3 / SAA-TBC-TBCKULT-03 des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der TU Dresden genutzt.

N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Lösung: 100 mg N-Acetyl-L-Cystein

Agares zur Mycobakterien-Kultur:

10 ml sterile NaOH-Lösung (5%)

10 ml sterile Na3-Citrat2H2O-Lösung (2,9%)

Zur Kultivierung von Mycobakterien auf Schrägagar wurden der Eigelb- sowie der Ogawa- Nährboden mit PACT der Firma Artelt ENCLIT genutzt. Die Zusammensetzung entspricht den Herstellerangaben und ist je 1 Liter Medium zu verstehen.

Eigelb-Nährboden: 420 ml Salzlösung

580 ml Eiemulsion mit Pyruvat

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.4 Medien zur Phagen-Untersuchung

Modified Scholtens’-Broth, -Agar (MSB / MSA)

Die initiale Anzucht der E. coli für die Untersuchung somatischer Coliphagen erfolgte in Modified Scholtens’-Broth (MSB) nach ISO/DIS 10705-2.2.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Versuchsansatz erfolgte im halbfesten Medium (ssMSA) auf festem Modified Scholtens’-Agar (MSA).

ss MSA: MSB mit 7 g Agar je 1 l Medium

MSA: MSB mit 15 g Agar je 1 l Medium

Tryptone-yeast extract-Glucose-Broth, -Agar (TYGB / TYGA)

S. typhimurium wurde als Wirtsorganismus für F-spezifische Bakteriophagen in Tryptone-yeast extract-Glucose Broth (TYGB) nach ISO 10705-1:1995(E) kultiviert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Phagentest erfolgte in ssTYGA auf festem Tryptone-yeast-extract-Glucose-Agar (TYGA).

ssTYGA: TYGB mit 7 g Agar je 1 l Medium

TYGA: TYGB mit 15 g Agar je 1 l Medium

2.3 Probenahme und Abtrennung

Das Ziel der Probenahmen war, in der Vorsperre Forchheim (F), vor und nach einer Unterwassermauer (S und H) sowie an der Entnahmestelle (E) vor der Staumauer genug Sediment zu gewinnen, um chemische und mikrobiologische Untersuchungen durchführen zu können. Es wurden je Probenahmestelle 6 Sedimentkerne entnommen. Die Gewinnung dieser Kerne sowie die Messung der physikalischen Gewässerdaten erfolgte von einem Boot aus. Physikalische Parameter wie Wassertemperatur, Sauerstoffgehalt, Leitfähigkeit und pH-Wert wurden meterweise vor Ort mit den Geräten Oxi 197-S, LF 197-S und pH 197-S von WTW erhoben. Diese wurden zuvor entsprechend der Herstellerangaben kalibriert. Die Sedimentproben wurden mit einem Uwitec-Sedimentstecher (Bild 2.2) entnommen. Dazu wurde der Ball neben der Plexiglasröhre fixiert und der Sedimentstecher an der Auslöse- / Bergeleine durch das Pelagial bis zum Sediment hinabgelassen. Durch den Widerstand, welcher beim Auftreffen des Sedimentstechers auf dem Gewässerboden entsteht, wird der Ball aus seiner Position gelöst und verschließt die untere Öffnung der Plexiglasröhre. Nach dem Bergen des Sedimentstechers wurde die Röhre mit einer Gummidichtung verschlossen und die Qualität der Proben kontrolliert.

Abbildung 2.2 Sedimentstecher (verändert nach UWITEC, 2006)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Probenahmen erfolgten zu den in Tabelle 2.1 aufgelisteten Daten. Im Februar 2006 wurden durch ein Loch in der 35 cm dicken Eisschicht an der Entnahmestelle 11 Sedimentkerne gewonnen. Die Beprobung vom Juni 2006 wurde ohne die Probenahmestellen H und S, die vom August 2006 ohne E durchgeführt. Das Sediment der Sedimentfalle E0 von der Entnahmestelle wurde nur im September 2005 und im August 2006 untersucht.

Tabelle 2.1 Probenahmedaten und beprobte Gewässerregionen sowie durchgeführte Untersuchungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Sedimentkerne wurden über Nacht in der Kühlzelle bei 8°C gelagert. Die Abtrennung der Horizonte (Bild 2.3) erfolgte jeweils am Tag nach den Probenahmen. Die Zuordnung der Horizonte zu bestimmten Tiefen ist aus Abbildung 2.3 ersichtlich. Der weitere Ablauf der Untersuchungen ist im Schema 2.1 dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.3: Horizontzuordnung am Sedimentkern[1]

2.4 Molekularbiologische Methoden

2.4.1 DNA-Extraktion

Die DNA-Extraktionsmethoden Fast DNA® Spin for Soil (Fa. Q-Biogene) und der Bead- Beater-Aufschluß (Fa. Retsch) lassen sich grundlegend in 4 Funktionsschritte einteilen. Zunächst müssen die Zellen mechanisch aufgeschlossen werden. Dies geschieht in beiden Fällen durch Kugeln mit bestimmtem Durchmesser, welche beim Schütteln in den jeweiligen Geräten die Zellwände zerstören. Dies wird bei den Extraktionsmethoden QIAamp® DNA-Stool Mini Kit und QIAamp® DNA Blood Mini Kit von Qiagen durch Erwärmen der Zellen im Puffer erreicht. Nach der Lyse erfolgt ein Reinigungsschritt, um die DNA von den Zelltrümmern und -organellen zu trennen. Beim anschließenden Waschschritt wird die DNA gereinigt und danach eluiert.

2.4.1.1 Fast DNA® Spin for Soil (Q Biogene)

Diese Methode wurde genutzt, um die DNA aus Organismen zu gewinnen, welche sich im Sediment befanden.

Schritt 1: Lyse

Um die Gesamt-DNA aus dem Sediment zu extrahieren, wurden 500 mg der Probe mit 978 μl Sodium-Phosphatpuffer und 122 μl MT-Puffer (Q Biogene) in das Multimix 2 Tissue Matrix Tube gegeben. Die Aufschlußgefäße wurden im „Fast Prep“-Gerät (Bio 101®) befestigt und 40 s bei Stufe 5.5 geschüttelt. Danach wurden die Proben bei 13000 rpm 30 s (Biofuge frescos Fa. Heraeus) zentrifugiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Nach Zugabe von 205 μl PBS wurde dies durch vorsichtiges „Überkopf“-Drehen des Gefäßes mit der Probe vermengt.

Aufreinigung:

Um ein Pellet zu präzipitieren, wurde die Probe bei 13000 rpm 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben, welches 1 ml bereits suspendierte Binding Matrix enthielt. Dieser Ansatz wurde 2 min durch Schütteln vermengt. Nach dem Sedimentieren der Matrix wurden 500 μl aus dem Überstand verworfen, die Matrix im Rest suspendiert und in zwei Aliquote aufgeteilt. Diese wurden nacheinander auf einen Spin ™ (Q Biogene) Filter gegeben und 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert.

Waschen:

Der Spin™ Filter wurde nach Auftragen von 500 μl Salz-Ethanol-Waschlösung (SEWS-M) bei 13000 rpm 1 min zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen und der Filter nochmals bei gleicher Drehzahl für 2 min zentrifugiert.

Eluieren:

Die Rücklösung der DNA vom Filter wurde durch Auftragen von 80 μl DNA Elution Solution-ultra pure water (DES) auf die Matrix des SPIN™ Filters und anschließendes Zentrifugieren bei 13000 rpm für 1 min realisiert.

2.4.1.2 Bead Beater- Aufschluß

Diese Aufschlußmethode wurde genutzt, um Mycobakterien-DNA aus den Sedimentproben zu gewinnen.

Die DNA-Extraktionsmethode wurde mit der Schwingmühle MM 2000 (Fa. Retsch) in Sarstedt-Röhrchen durchgeführt. In einem Reaktionsgefäß mit Schraubverschluß wurden 500 μl Zirconia/Silica-Beads 0,1 mm (Fa. Roth) mit 500 μl Phenol und 500 μl Probe vermengt. Dieser Ansatz wurde zum mechanischen Zellaufschluß 12 min in der Schwingmühle bei maximaler Geschwindigkeit (Amplitude 100) behandelt. Aus dem wäßrigen Überstand wurden 400 μl abgenommen und mit 400 μl A-Puffer (Qiagen) versetzt. Die weitere Behandlung der Proben erfolgte nach den Extraktionsmethoden QIAamp® DNA-Stool Mini Kit bzw. QIAamp® DNA Blood Mini Kit von Qiagen.

2.4.1.3 QIAamp® DNA-Stool Mini Kit (Qiagen 2001)

Die DNA-Extraktion erfolgte entsprechend der Anleitung des im Kit enthaltenen Protokolls von Qiagen und wurde zur Gewinnung von DNA aus Reinkulturen genutzt.

2.4.1.4 QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen 2003)

Die Methode wurde zur Extraktion von DNA aus Reinkulturen genutzt. Die Durchführung entsprach der im Begleitheft von Qiagen angegebenen Prozedur.

2.4.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Die Polymerase Kettenreaktion (PCR), 1984 von Kary Mullis entwickelt (Löffler 2003), wird genutzt, um geringe DNA-Mengen zu amplifizieren. Grundlage der Reaktion ist, daß DNA einen bestimmten Schmelzpunkt hat, bei welchem sich der Doppelstrang aufspaltet. Diese Temperatur hängt davon ab, wie viele Guanin- (G) Cytosin- (C) und Adenin- (A) Thymin- (T) Wasserstoffbrückenbindungen vorhanden sind. Sind mehr GC-Paare vorhanden, ist die Schmelztemperatur höher, da zwischen G und C drei und zwischen A und T nur zwei Wasserstoffbrückenbindungen ausgebildet werden.

An die Einzelstränge bindet bei annähernder primerspezifischer Schmelztemperatur (z.B. TPU1 bei 57 °C) je ein Primer (= annealing), welcher die komplementäre Sequenz zum zu amplifizierenden DNA-Fragment enthält. Die Elongation erfolgt bei 72°C mittels der Taq-Polymerase, welche thermostabil ist und z.B. in Thermophilus aquaticus vorkommt. Die PCRs wurden mit einem T3 Thermocycler (Biometra) durchgeführt. Aus dem Gesamt-DNA-Extrakt (Kap. 2.4.1.1) wurde eine Verdünnung von 1:50 für die weiteren Untersuchungen in der PCR genutzt. Die 25 μl Reaktionsansätze setzten sich wie folgt zusammen:

PCR-Ansatz: 5 μl 5 x Green-Reaktionspuffer inkl. MgCl2 7,5 mM (Promega)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die in Tabelle 2.2 dargestellten Primer wurden von der Firma biomers.net, Ulm bzw. der Primer R264 von Thermo Biosciences, Ulm oder TIB MOLBIO, Berlin bezogen.

Tabelle 2.2: Primerübersicht

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Schmelztemperaturen (Tm) der Primer wurden auf den Internetseiten von Integrated DNA Technologies (IDT 2006) berechnet.

2.4.2.2 PCR-Programme

Abbildung 2.4 zeigt ein Standardprogramm für eine PCR mit den Variablen Tm, was für die Schmelztemperatur des Primers steht, und X, was die Anzahl der Zyklen darstellt. Für sämtliche PCRs mit den Primern TPU1, TPU2, 1387R, 1492R, –M13, +M13 und MB1 wurden Tm = 57 °C und X = 32 Zyklen genutzt. Reaktionen mit dem Primer R264 wurden mit Tm = 64 °C und X = 35 entsprechend SAA-NAT-MYKOUNI-03 durchgeführt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.4: Standard-PCR-Programm

Bei Reaktionsansätzen von Zellen mit intakter Zellwand als Probe wurde die initiale Denaturierung auf 10 min erhöht, um die DNA durch die Lyse der Zellen freizusetzen. Außerdem wurden 2,5 μl PCR-Wasser mehr eingesetzt, um ein Probenvolumen von 25 μl zu erreichen.

2.4.3 Gelelektrophorese und DNA-Detektion

Die Gelelektrophorese wurde in 1% Agarose (Biozym LE Agarose) in 1x TAE Elektrophoresepuffer durchgeführt.

Agarose 1%: 1 g Agarose

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Längenstandard „Smart Ladder“ der Firma Eurogentec (s. Abbildung 2.5) wurde zu gleichen Teilen mit Gelauftragspuffer vermengt. Von diesem Ansatz wurden je Gelreihe 5 μl genutzt. Von der DNA wurden 5 μl Probe ohne Ladepuffer aufgetragen, da sich dieser bereits durch Nutzung von Green-Reaktionspuffer im PCR-Ansatz befand.

Gelauftragspuffer: 250 mg Bromphenolblau

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.5: Smart Ladder

250 mg Xylencyanol FF

15 g Ficoll 400

100 ml Aqua dest.

Für die Energieversorgung wurden die Geräte E844 von Consort und das Electrophoresis power supply – EPS 1001 von Amersham Pharmacia Biotech genutzt. Die Auftrennung der DNA erfolgte bei 120 V, 176 mA für 35 min. Im Anschluß wurde das Gel in 1 μg/ml Ethidiumbromid (Fa. Roth) für 30 min gefärbt. Die Visualisierung der DNA erfolgt in der Geldokumentationsanlage Gel Doc 200 (Bio-Rad). Mittels einer eingebauten Kamera konnten Bilder auf einen PC übertragen und gespeichert werden.

2.4.4 DNA-Extraktion aus Agarosegel

Das Ausschneiden ausgewählter DNA-Banden aus dem Agarosegel erfolgte mittels Skalpell auf dem Transilluminator „Gel vue“ der Firma Syngene unter Nutzung von UV-Augenschutzvorrichtungen (Pulsafe Clearways). Die anschließende Extraktion der DNA aus dem Gel wurde entsprechend dem Protokoll des GENECLEAN® II Kit von Bio 101® Systems durchgeführt. Die Methode läßt sich in 4 Schritte untergliedern:

1. Auflösen des Agarosegels
2. Binden der DNA an Silica-Matrix durch hohe Konzentrationen chaotroper Salze (Q Biogene)
3. Waschen der Nukleinsäure
4. Eluieren der DNA durch Verringerung des Salzgehaltes

2.4.5 Klonierung (Invitrogen 2004)

Durch die Klonierung ist es möglich, ein Nukleinsäuregemisch zu trennen. Das kann erforderlich sein, wenn, wie im vorliegenden Fall, ein DNA-Gesamtextrakt zur Verfügung steht und der Bestand an Organismen durch Sequenzierung erfaßt werden soll.

Die PCR-Produkte wurden mittels QIAquick (Fa. Qiagen) entsprechend dem Protokoll des Herstellers aufgereinigt. Für den TOPO® Klonierungsansatz wurden 4 μl gereinigtes PCR-Produkt mit 1 μl Salzlösung (1,2 M NaCl; 0,06 M MgCl2) und 1 μl TOPO®-Vector 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieses Schrittes bindet das zu klonierende DNA-Fragment an den Vector. Je Reaktion wurde ein Aliquot One Shot® E. coli (s. 2.1) auf Eis aufgetaut und danach mit 2 μl des TOPO® Klonierungsansatzes vermengt. Die chemische Kompetenz der Zellen wird dabei durch Magnesiumchlorid vermittelt. Der Ansatz wurde 15 min auf Eis inkubiert. Nach dem Hitzeschock bei 42 °C für 30 s erfolgte eine Vermehrung der Bakterien in 250 μl S.O.C.-Medium (Kap. 2.2.1) für 1 h bei 37 °C. Danach wurden je Probe 1 mal 100 μl und je 2 mal 50 μl bzw. 25 μl auf LB-Platten (Kap. 2.2.1) ausgespatelt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Aufgrund der plasmidvermittelten Antibiotikaresistenz der Kulturen (s. 2.1) konnten nur Bakterien mit Plasmid auf dem LB-Medium mit Ampicillin wachsen. Außerdem erfolgte eine Blau- Weiß- Selektion auf Basis der lacZ-Gene auf dem Plasmid. Weiße, einzelne Klone wurden mit sterilen Zahnstochern entnommen und als Impfstrich auf LB-Platten übertragen. Die so angelegten Klonbanken wurden wiederum über Nacht bei 37 °C inkubiert und danach bei 4 °C gelagert. Die Biomasse, welche beim Überimpfen am Zahnstocher verblieb, wurde in einem zuvor angesetzten PCR-Mastermix überführt. Dieser Mix enthielt die Primer M13r und M13f (-40), welche an Nukleotide vor bzw. nach der inserierten DNA am Plasmid binden. Die Angabe der Basen in Abbildung 2.6 entspricht der Position der Nukleotide ohne Insert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Verwendung von M13 hat bei universellen, z.B. 16S-Inserts den Vorteil, daß schon nach der PCR im Kontrollgel anhand der Bandengröße festgestellt werden kann, ob die Klonierung erfolgreich war. Würde man die Produkte der Klonierung mit TPU1 amplifizieren, erhält man aufgrund der hohen Kopiezahl der Plasmide bei erfolgreicher Insertion PCR-Produkte, welche fast ausschließlich die klonierte DNA enthalten. Weist ein Plasmid jedoch kein Insert auf, wird bei Nutzung von TPU1 die 16s rRNA der zur Klonierung genutzten E. coli amplifiziert.

2.4.6 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)

Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, welche DNA an spezifischen Stellen schneiden. Diese Schnittstellen befinden sind aufgrund der genomischen Unterschiede zwischen den Arten an verschiedenen Stellen. Ein Restriktionsverdau der DNA verschiedener Arten bedingt demnach unterschiedlich große Restriktionsfragmente. Diese Eigenschaft nennt man Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus. Die Erkennungssequenzen der genutzten Enzyme sind in Abbildung 2.7 dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.6: Plasmidarchitektur vereinfacht

Die Enzyme sowie die zugehörigen Puffer wurden in einer Konzentration von 10 u/μl von Fermentas bezogen. Für den Restriktionsverdau wurden 9 μl PCR-Produkt mit 1,2 μl 10 x Puffer, 0,5 μl PCR-Wasser und 0,5 μl Enzym in PCR-Reaktionsgefäßen 3 h bei 37 °C im Thermocycler inkubiert. Für die Inaktivierung der Enzyme wurde die Temperatur für 20 min bei Eco RI und Rsa I auf 65 °C bzw. bei Hha I auf 80 °C erhöht.

2.4.7 Sequenzierung

Die Sequenzierung erfolgte automatisiert nach dem Prinzip der Didesoxymethode nach Sanger (1975). Dazu wurden innerhalb der Sequenzierungs-PCR neben dNTPs auch fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide (ddNTPs) eingebaut, welche aufgrund der fehlenden Hydroxygruppe die Polymerisation der DNA verhindern, so daß es zum Kettenabbruch kommt. Durch den zufälligen Einbau der ddNTPs entstanden DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge. Im Sequenzierer wurde dieses Fragmentgemisch im Gel nach Längen aufgetrennt und die jeweilige Base, welche zum Kettenabbruch führte, durch Laserscanner identifiziert.

2.4.7.1 Aufreinigung der Proben für die Sequenzier-PCR

Die PCR-Produkte, welche sequenziert werden sollten, mußten zunächst aufgereinigt werden. Das erfolgte mittels EXO-SAP, einem Gemisch aus Exonuclease I, welche einzelsträngige DNA inklusive übriggebliebener Primer bei 37 °C abbaut, und Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP), welche verbleibende dNTP’s bei 80 °C hydrolysiert. Je nach DNA-Gehalt des PCR-Produktes, was an der Gelbande der vorausgehenden Gelelektrophorese abgeschätzt werden kann, wurden 0,5 μl bis 2 μl Probe mit 0,8 μl EXO-SAP-Mix versetzt und im Thermocycler 30 min bei 37 °C und anschließend 15 min bei 80 °C inkubiert.

2.4.7.2 Sequenzier-PCR

Für den Mastermix wurden je Probe 2 μl Premix (DTCS-Beckmann bzw. BigDye® Terminator Applied Biosystems), 4,2 μl PCR-Wasser und 1 μl Primer genutzt. Auf die aufgereinigten Proben (Kap. 2.4.7.1) wurden 7 μl des Mastermixes aufgetragen. Da zur Sequenzierung verschiedene Sequenzer (Kap. 2.4.7.4) genutzt wurden, unterscheiden sich auch die dafür notwendigen PCR-Programme. Die in Tabelle 2.3 aufgeführten Abfolgen wurden für die Sequenzier-PCRs mit sämtlichen in Tabelle 2.2 aufgelisteten Primern genutzt.

Tabelle 2.3: Übersicht Sequenzier-PCR-Programme

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.4.7.3 Aufreinigung der Proben für die Sequenzierung

Aufreinigung bei Nutzung des ABI Prism 310 (Fa. Applied Biosystems):

Verwendet wurden die AutoSeq™ G-50 Säulchen von GE Healthcare, welche vor Gebrauch gevortext und nach Abbrechen des unteren Verschlusses 2 min bei 5000 rpm in einem 2 ml- Gefäß zentrifugiert wurden. Danach wurde das Säulchen in ein neues, beschriftetes 1,5 ml- Reaktionsgefäß gestellt, das gesamte PCR-Produkt (s. 2.4.7.2) aufgetragen und nochmals 2 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde die Probe für 35 min bei 42 °C in der Vakuumzentrifuge (Christ RVC 2-18) getrocknet.

Aufreinigung bei Nutzung des 3100 Avant (Fa. Applied Biosystems):

Die Aufreinigung erfolgte entsprechend der Anleitung der Prozedur für den Sequenzer ABI Prism 310, jedoch mit dem System DyeEx 2.0 von Quiagen. Die Zentrifugation der Säulchen erfolgte bei 2800 rpm für 3 min.

Aufreinigung bei Nutzung des CEQ™ 2000XL (Fa. Beckmann):

Für diesen Sequenzer wurden die Proben mittels einer Ethanolfällung gereinigt. Die Fällungslösung bestand je Probe aus 2 μl 3 M Natriumacetatlösung, 2 μl 100 mM EDTA und 1 μl Glycogen. 5 μl der Fällungslösung wurden in Reaktionsgefäßen, welche auf Eis gelagert wurden, vorgelegt. Danach wurden 20 μl Probe und umgehend 60 μl eiskaltes Ethanol 95 % zugegeben. Nach vorsichtigem Mischen des Ansatzes erfolgte der Fällungsschritt durch Inkubation für 15 min auf Eis. Zur Verdichtung des Pellets wurde die Probe 20 min bei 13000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde, ohne das Pellet zu beschädigen, entnommen und verworfen. Zum Waschen wurden 200 μl eiskaltes Ethanol 70 % zugegeben und der Ansatz 10 min bei 13000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum verworfen und das Pellet 35 min bei 42 °C in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Die trockenen Pellets können mehrere Wochen bei -20 °C gelagert werden.

2.4.7.4 Sequenzierung

Für die Sequenzierung wurden die Geräte Abi Prism 310 sowie Abi Prism 3100 Avant von Applied Biosystems Hitachi und CEQ™ 2000XL von Beckmann genutzt. Die Analysen mit den zwei zuerst genannten Sequenzern wurden in der Diagnostik-Abteilung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der TU Dresden durchgeführt. Für die Sequenzierungen mit dem Beckmann Coulter wurden die trockenen Pellets in 35 μl Sample loading solution (SLS) aufgenommen. Die Proben wurden nach 10 min Inkubation bei Zimmertemperatur in Sequenzier-Mikrotiterplatten pipettiert und mit einem Tropfen Mineralöl (Fa. Beckmann) abgedeckt. Danach wurde die Probenplatte in den Sequenzer gestellt und der automatisierte Teil der Sequenzierung am Computer gestartet. Je Probe wurde von den Sequenzern eine abi- bzw. scf- Datei erstellt. Diese wurden mit dem Programm Chromas light, Version 2.01 (Technelysium 2005) manuell editiert.

2.4.8 Datenbank NCBI Blast

Korrekte Sequenzbereiche wurden in die Suchmaske der Datenbank von NCBI Blast eingegeben. Mittels dieser Datenbank wurde die Sequenz mit einer angegebenen Wahrscheinlichkeit einem gelisteten Eintrag zugeordnet. Da zwischen Probe und Datenbankeintrag kaum Sequenzhomologien von 100 % erreicht werden, sind alle Ergebnisse als Spezieszuordnungen höchster Wahrscheinlichkeit zu verstehen.

[...]


[1] Ab April 2006 E, H, S Horizont 5: 8 cm bis 10 cm

Details

Seiten
155
Erscheinungsform
Originalausgabe
Jahr
2006
ISBN (eBook)
9783836614290
Dateigröße
8.8 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v225860
Institution / Hochschule
Technische Universität Dresden – Mathematik und Naturwissenschaften, Professur für angewandte Mikrobiologie
Note
1,1
Schlagworte
bakterien mikrobiologische analytik talsperre population trinkwasser

Autor

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Titel: Charakterisierung der mikrobiellen Biozönose im Sediment und Freiwasser der Talsperre Saidenbach