Herstellung von Fluoreszenz-markierten Arrestin-Varianten zum Funktionsnachweis rekombinanter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren
©2006
Diplomarbeit
87 Seiten
Zusammenfassung
Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit wurden Fluoreszenz-markierte Arrestin-Varianten hergestellt, die in einem geplanten, auf FRET basierenden Funktionstest für rekombinante renaturierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Glukagon like peptide-1-Rezeptor (GLP-1-Rezeptor) und Parathormon-Rezeptor (PTH-Rezeptor)) eingesetzt werden können.
Die in der Literatur beschriebene Expression und Reinigung des Arrestins konnte für die Mutante Arrestin2 (1-382) erfolgreich nachvollzogen werden. Durch eine aufeinander folgende Heparin- und Q-Sepharose-Chromatographie wurde das Protein mit der erwateten Reinheit und Ausbeute gewonnen.
Diese Mutante bindet mit hoher Affinität den aktivierten, aber unphosphorylierten Rezeptor. Hierdurch wird der geplante FRET-assay bedeutend vereinfacht, da weder ATP noch eine G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase benötigt werden. Es wurden Reaktionsbedingungen gefunden, die zu einer äquimolaren Markierung des sieben Cystein-Reste enthaltenden Arrestin2 mit einem Fluoreszenzfarbstoff führten, wenngleich es nicht gelang, die Verteilung des Modifikationsgrades zu ermitteln.
Durch Auswahl eines geeigneten Stammes und Fermentation bei 10 °C wurden erstmals größere Mengen der Fusionsproteine Arr2-L-EGFP und Arr2-L-EYFP löslich in E.coli exprimiert.
Nach anfänglichen Schwierigkeiten bei der Verwendung des etablierten Protokolls und zwischenzeitlichen Reinigungsversuchen mit der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) gelang es, diese hydrophoben, zur Aggregation neigenden Proteine durch Abwandlung des etablierten Reinungsprotokolls zu isolieren.
Die sehr geringe Ausbeute führte zu der Überlegung, die Reinigung durch Anfügen eines His-tags an beide Fusionsproteine zu erleichtern. Nach der erfolgreichen Klonierung der beiden His-tag-Konstrukte wurden diese in Schüttelkulturen exprimiert und mittels IMAC gereinigt.
Die Ausbeute und die Reinheit beider Varianten blieben hinter den Erwartungen zurück. Versuche, diese Parameter durch den Zusatz verschiedener Additive zu verbessern, waren erfolglos. Die Bindungsaktivität des Arrestin2, des AEDANS-markierten Arrestin2 und der beiden Fusionsproteine mit und ohne His-tag wurde durch biomolekulare Interaktionsanalyse (BIACORE) nachgewiesen.
Eine eindeutige Bestätigung dieser Messungen durch die Isotherme Titrationskaloriemetrie ITC) gelang aufgrund von Substanzmangel und des hohen KD-Wertes der untersuchten Bindungsreaktion nicht. […]
In der vorliegenden Arbeit wurden Fluoreszenz-markierte Arrestin-Varianten hergestellt, die in einem geplanten, auf FRET basierenden Funktionstest für rekombinante renaturierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Glukagon like peptide-1-Rezeptor (GLP-1-Rezeptor) und Parathormon-Rezeptor (PTH-Rezeptor)) eingesetzt werden können.
Die in der Literatur beschriebene Expression und Reinigung des Arrestins konnte für die Mutante Arrestin2 (1-382) erfolgreich nachvollzogen werden. Durch eine aufeinander folgende Heparin- und Q-Sepharose-Chromatographie wurde das Protein mit der erwateten Reinheit und Ausbeute gewonnen.
Diese Mutante bindet mit hoher Affinität den aktivierten, aber unphosphorylierten Rezeptor. Hierdurch wird der geplante FRET-assay bedeutend vereinfacht, da weder ATP noch eine G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase benötigt werden. Es wurden Reaktionsbedingungen gefunden, die zu einer äquimolaren Markierung des sieben Cystein-Reste enthaltenden Arrestin2 mit einem Fluoreszenzfarbstoff führten, wenngleich es nicht gelang, die Verteilung des Modifikationsgrades zu ermitteln.
Durch Auswahl eines geeigneten Stammes und Fermentation bei 10 °C wurden erstmals größere Mengen der Fusionsproteine Arr2-L-EGFP und Arr2-L-EYFP löslich in E.coli exprimiert.
Nach anfänglichen Schwierigkeiten bei der Verwendung des etablierten Protokolls und zwischenzeitlichen Reinigungsversuchen mit der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) gelang es, diese hydrophoben, zur Aggregation neigenden Proteine durch Abwandlung des etablierten Reinungsprotokolls zu isolieren.
Die sehr geringe Ausbeute führte zu der Überlegung, die Reinigung durch Anfügen eines His-tags an beide Fusionsproteine zu erleichtern. Nach der erfolgreichen Klonierung der beiden His-tag-Konstrukte wurden diese in Schüttelkulturen exprimiert und mittels IMAC gereinigt.
Die Ausbeute und die Reinheit beider Varianten blieben hinter den Erwartungen zurück. Versuche, diese Parameter durch den Zusatz verschiedener Additive zu verbessern, waren erfolglos. Die Bindungsaktivität des Arrestin2, des AEDANS-markierten Arrestin2 und der beiden Fusionsproteine mit und ohne His-tag wurde durch biomolekulare Interaktionsanalyse (BIACORE) nachgewiesen.
Eine eindeutige Bestätigung dieser Messungen durch die Isotherme Titrationskaloriemetrie ITC) gelang aufgrund von Substanzmangel und des hohen KD-Wertes der untersuchten Bindungsreaktion nicht. […]
Leseprobe
Inhaltsverzeichnis
Alexander Bepperling
Herstellung von Fluoreszenz-markierten Arrestin-Varianten zum Funktionsnachweis
rekombinanter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren
ISBN-10: 3-8324-9893-1
ISBN-13: 978-3-8324-9893-1
Druck Diplomica® GmbH, Hamburg, 2006
Zugl. Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle, Deutschland, Diplomarbeit, 2006
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Printed in Germany
Inhaltsverzeichnis
2
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ... 5
1.1
Interzelluläre Kommunikation ... 5
1.2
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ... 6
1.3
GPCR-Signaltransduktion ... 7
1.4
Desensitisierung und Internalisierung von GPCR... 8
1.5
Die Familie der Arrestine ... 10
1.6
Parathormon- , Glucagon-like-Peptide-1-Rezeptor und ihre Liganden ... 12
1.7
Fluoreszierende Proteine ... 15
1.8
Ziel dieser Arbeit... 16
2
Material und Methoden ... 19
2.1
Material ... 19
2.1.1
Chemikalien ... 19
2.1.2
Standards und Kit-Systeme ... 20
2.1.3
Enzyme und Antikörper ... 20
2.1.4
Chromatographiematerial, Säulen und sonstige Materialien ... 20
2.1.5
Oligodesoxynukleotide... 20
2.1.6
Peptide... 21
2.1.7
Organismen und Plasmide... 21
2.1.8
Medien, Antibiotika und Puffer ... 21
2.1.9
Technische Geräte und Anlagen ... 25
2.2
Methoden... 26
2.2.1
Molekularbiologische Methoden... 26
2.2.1.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ... 26
2.2.1.2 Restriktionsverdau... 27
2.2.1.3 Reinigung von DNA-Fragmenten ... 28
2.2.1.4 Ligation ... 28
2.2.1.5 Elektrotransformation von E. coli ... 29
2.2.1.6 Plasmidisolierung ... 29
Inhaltsverzeichnis
3
2.2.1.7 Sequenzierung ... 30
2.2.2
Proteinexpression und Zellaufschluss ... 30
2.2.2.1 Bakterienkultivierung im Schüttelkolben... 30
2.2.2.2 Fed-Batch-Fermentation ... 30
2.2.2.3 Expressionstest ... 31
2.2.2.4 Zellaufschluß durch Hochdruckdispersion... 31
2.2.3
Proteinchemische Methoden ... 32
2.2.3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration... 32
2.2.3.2 TCA-Fällung ... 32
2.2.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 32
2.2.3.4 Western-Blot ... 33
2.2.3.5 Ammoniumsulfatfällung ... 34
2.2.3.6 Heparin-Sepharose-Chromatographie... 34
2.2.3.7 Ultrafiltration... 35
2.2.3.8 Dialyse... 35
2.2.3.9 Anionenaustausch-Chromatographie ... 35
2.2.3.10
Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ... 36
2.2.3.11
Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) ... 36
2.2.3.12
AEDANS-Modifikation ... 36
2.2.3.13
Gelfiltration (NAP-5) und Bestimmung des Modifizierungsgrades ... 37
2.2.3.14
High performance liquid chromatography (HPLC) ... 37
2.2.3.15
Synthese des V
2
R-Peptids ... 37
2.2.4.1 Oberflächenplasmonresonanz (SPR, BIACORE) ... 38
2.2.4.2 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)... 38
2.2.4.3 Massenspektrometrie... 39
3
Experimente und Ergebnisse... 40
3.1
Expression und Reinigung von Arrestin2 ... 40
3.2
Auswahl des Expressionsstamms für die Expression der
Fusionskonstrukte.. 42
3.3
Expression und Reinigung der Fusionsproteine... 44
3.4
Klonierung der His-tag-Konstrukte ... 49
3.5
Expression und Reinigung der His-tag-Fusionsproteine ... 51
3.6
AEDANS-Modifikation von Arrestin2 ... 54
3.7
Aktivitätstest (Biacore / ITC) der Arrestin-Varianten ... 56
Inhaltsverzeichnis
4
4
Diskussion... 59
4.1
Expression und Reinigung von Arrestin2 ... 59
4.2
Auswahl des Expressionsstamms für die Expression von Arr2-L-EGFP und
Arr2-L-EYFP... 60
4.3
Expression und Reinigung der Fusionsproteine... 62
4.4
Klonierung der His-tag-Konstukte ... 66
4.5
Expression und Reinigung der His-tag-Konstrukte... 67
4.6
Chemische Modifikation des Arrestin2... 68
4.7
Der Einsatz der fluoreszenzmarkierten Arrestin2-Varianten im Rahmen des
geplanten FRET-assays... 70
4.8
Funktionsnachweis der gereinigten Arrestin-Varianten ... 73
4.9
Ausblick... 74
5
Zusammenfassung ... 76
6
Anhang... 77
Abkürzungsverzeichnis... 77
Vektorkarten... 78
Literaturverzeichnis... 80
Einleitung
5
1
Einleitung
1.1
Interzelluläre Kommunikation
Die Fähigkeit, mit der Umwelt zu interagieren, ist eine der Definitionen von Leben.
Extrazelluläre Signale müssen empfangen, verarbeitet und in eine (intrazelluläre) Antwort
umgewandelt werden.
Die Zellen höherer Lebensformen müssen zudem untereinander kommunizieren, um ihr
Wachstum, ihre Differenzierung und ihren Stoffwechsel im Rahmen des Gesamtorganismus
zu koordinieren. Dies geschieht unter anderem durch die Bildung von Hormonen, die in das
Blut oder andere extrazelluläre Flüssigkeiten sezerniert werden. Lipophile Botenstoffe, wie
Steroidhormone, Vitamin D oder Thyroidhormone werden meist nur langsam abgebaut oder
aus dem Blutkreislauf entfernt und entfalten so eine längerfristige Wirkung. Sie können direkt
durch die Zellmembran diffundieren und binden oft an cytosolische Rezeptoren oder
regulieren die Transkription von Zielgenen (Gronemeyer, 1992).
Die kurzlebigeren hydrophilen Botenstoffe wie Peptidhormone oder Aminosäure-Derivate
binden jeweils an einen spezifischen Rezeptor auf der Zelloberfläche, der das Signal in das
Zellinnere weiterleitet. Rezeptoren sind integrale Membranproteine und werden nach ihrem
Signaltransduktions-Mechanismus und ihrer Struktur in drei Klassen unterteilt. Kanal-
gekoppelte Rezeptoren (Ionenkanäle) ändern nach Bindung des Liganden ihren
Porendurchmesser und ihre Öffnungswahrscheinlichkeit und erlauben so den Durchfluss
bestimmter Ionen. Bei katalytischen Rezeptoren (Tyrosinkinasen) führt die Bindung des
Botenstoffes zur Autophosphorylierung durch eine Kinase-Domäne des Rezeptors. Dieser
wird dadurch aktiviert und phosphoryliert nun weitere zytoplasmatische Proteine. Die größte
Gruppe der Rezeptoren stellen die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) dar. Ca 3-4 %
der menschlichen Gene codieren für Rezeptoren dieser Klasse (Lefkowitz, 2000). Sie
vermitteln das extrazelluläre Signal durch die Aktivierung eines heterotrimeren G-Proteins,
welches eine Signalkaskade auslöst.
Einleitung
6
1.2
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
Seit der Entdeckung des -adrenergen Rezeptors vor 20 Jahren (Insel et al., 1976) sind mehr
als 2000 Mitglieder der GPCR-Familie beschrieben worden. Allen gemeinsam ist eine
charakteristische Struktur mit sieben Transmembranhelices. Einer N-terminalen,
extrazellulären Domäne folgen sieben -Helices, die jeweils die Zytoplasmamembran
durchspannen. Folglich gibt es drei extra- und drei intrazelluläre loop-Regionen, welche die
Helices miteinander verbinden (Abb. 1). Die N-terminale Domäne ist für die
Ligandenbindung zuständig, während die intrazelluläre C-terminale Domäne mit G-Proteinen
und anderen Rezeptor-bindenden Proteinen interagiert. Sequenzhomologie-Studien zeigten,
dass die GPCRs in sechs Familien eingeteilt werden können (Kolakowski, 1994). Die
Familien A, B und C sind ausschließlich in Metazoen zu finden, während die Gruppen D und
E in einzelligen Pilzen vorkommen. Rezeptoren der Familie F wurden bisher nur in dem
Schleimpilz Dictyostelium discoideum gefunden. Die Familien A und B stellen die
zahlenmäßig größten Gruppen dar. Für beide gibt es einen namensgebenden Modellrezeptor.
Die Mitglieder der Klasse A werden auch als Rhodopsin-ähnliche, die der Klasse B als
Sekretin-Rezeptor-ähnliche Rezeptoren bezeichnet.
Fast 50 % aller heute erhältlichen Medikamente entfalten ihre Wirkung durch die Regulation
eines GPCRs (Claing et al., 2002). Trotz ihrer enormen pharmazeutischen Relevanz ist
bislang nur wenig über die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren bekannt. Erst im Jahr
2000 gelang es, die Kristallstruktur des Rhodpsin in hoher Auflösung (2,8 Å) zu lösen
(Palczewski et al., 2001).
Einleitung
7
Abbildung 1: Allgemeine schematische Darstellung eines Sieben-Transmembran-Helix-
Rezeptors (Bockaert &Pin, 1999)
1.3
GPCR-Signaltransduktion
GPCRs werden durch sehr unterschiedliche Signale gesteuert: Photonen, Lipide, Ionen,
Duftstoffe, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Nukleotide und Prostaglandine können z.B.
durch GPCRs ihre Wirkung auf die Zielzelle entfalten. Diesen heute gut verstandenen Prozess
bezeichnet man als Signaltransduktion (Abb. 2).
Nach der Bindung eines Liganden am entsprechenden Rezeptor erfährt dieser eine
konformationelle Änderung, die zur Aktivierung eines G-Proteins führt (Gether et al., 1994).
Diese heterotrimeren Proteine bestehen aus einer und einer -Untereinheit (Lambright et
al., 1996). Die -Untereinheit besitzt eine intrinsische GTPase-Aktivität und bindet im
inaktiven Zustand GDP, welches nach der Rezeptoraktivierung durch die Ligandenbindung
gegen GTP ausgetauscht wird. Hierdurch zerfällt der Komplex in die und die -
Untereinheit und die G
-Untereinheit kann an verschiedene Effektorproteine binden. Die
Adenylatzyklase und die Phospholipasen A, C und D werden auf diese Art aktiviert und
bilden sog. second messenger. Auch die freie G
-Untereinheit kann die Bildung von second
messengern induzieren und z.B. Ionenkanäle aktivieren (Wess, 1997). Die intrinsische
GTPase-Aktivität der G
-Untereinheit führt zur Hydrolyse des gebundenen GTP und zur
Einleitung
8
Freisetzung von anorganischem Phosphat. G
-GDP und G
lagern sich wieder zum inaktiven
G-Protein zusammen (Iiri et al., 1998). Neben dieser Deaktivierung auf der Ebene des G-
Proteins existieren auch Mechanismen auf der Rezeptor-Ebene, die zur Termination der
Signaltransduktion führen.
Abbildung 2: Ligandenvielfalt und schematischer Wirkungsmechanismus der
G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
(Bockaert &Pin, 1999)
1.4
Desensitisierung und Internalisierung von GPCR
Nach der Dissoziation des G-Proteins vom aktivierten Rezeptor kann dieser durch eine
membranständige G-Protein-gekoppelte Rezeptor Kinase (GRK) phosphoryliert werden. Der
durch Ligandenbindung aktivierte und phosphorylierte GPCR wird nun von einem Arrestin-
Molekül gebunden und in einen Clathrin-ummantelten Vesikel verpackt (Claing et al., 2002).
Nach der Dynamin-vermittelten Abschnürung des Vesikels von der Innenseite der
Zytoplasmamembran kann dieses mit einem Endosom oder Lysosom fusionieren. Die Fusion
mit einem Lysosom führt zum Abbau des Rezeptors, während der Weg über das Endosom zur
Wiederverwertung des Rezeptors führt (Abb. 3). Hierbei wird der Ligand abgelöst und der
Rezeptor dephosphoryliert. Arrestin kann nicht mehr binden und der Vesikel reintegriert mit
Einleitung
9
dem Rezeptor in die Membran. Der Weg, den die GPCR der Klassen A und B bei diesem
Prozeß nehmen, unterscheidet sich in einigen Details. Die Rezeptoren der Familie A binden
im Allgemeinen mit höherer Affinität an Arrestin3 als an Arrestin2, während die Mitglieder
der Familie B beide Isoformen mit etwa gleicher Affinität binden. Rezeptoren der Klasse A
setzen das gebundene Arrestin schon während der Internalisierung wieder frei, während bei
Rezeptoren der Klasse B der Rezeptor-Arrestin-Komplex bis zu den späten Endosomen
erhalten bleibt (Oakley et al., 2000). Der Abbau spielt hier im Verhältnis zur
Wiederverwertung des Rezeptors eine untergeordnete Rolle. Ausnahmen zu diesen Befunden
sind zum Beispiel der Glutamat-Rezeptor 1a, der selektiv nur mit Arrestin2, nicht aber mit
Arrestin3 interagiert (Dale et al., 2001) oder der Somatostatin-Rezeptor 3, der nach der
Internalisierung größtenteils abgebaut wird (Tulipano et al., 2004).
Abbildung 3: Arrestin-vermittelte Desensitisierung und Internalisierung von GPCR
(Gurevich & Gurevich, 2006)
Einleitung
10
1.5
Die Familie der Arrestine
Wie bereits zuvor erwähnt, spielen Arrestine bei der Regulation der Aktivität von GPCRs eine
entscheidende Rolle. Sie verhindern die weitere Bindung von G-Proteinen an den aktivierten
Rezeptor und bestimmen dessen Weg während der Desensitisierung und Internalisierung.
Das erste Protein dieser Proteinfamilie, von der bisher vier Mitglieder bekannt sind, wurde
1978 entdeckt (Kuhn, 1978). Dieses so genannte visuelle Arrestin bindet an nur einen
einzigen Rezeptor, das Rhodopsin, und wird nur in den Stäbchen-Zellen der Retina
exprimiert. Ein weiterer spezialisierter Vertreter ist das c-Arrestin (cone-Arrestin), das an die
je nach Spezies zwei bis vier verschiedenen Opsine der Zapfen-Zellen bindet. Die beiden
anderen, nicht-visuellen Arrestine werden in allen übrigen Zelltypen exprimiert und binden
jeweils mehrere hundert GPCR (Gurevich et al., 1993). Von beiden Proteinen, Arrestin2 und
Arrestin3 (früher: -Arrestin1 und -Arrestin2), wurden je zwei gewebsspezifische splice-
Varianten identifiziert (Lohse et al., 1990). Trotz Unterschieden in der Rezeptorspezifität
weisen alle vier Arrestine eine nahezu identische 2-Domänen-Struktur auf (Hirsch et al.,
1999; May Han et al., 2001; Sutton et al., 2005). Ebenso ist der Bindungsmechanismus an
aktivierte und phosphorylierte GPCR konserviert. Zwei Elemente spielen hierbei eine zentrale
Rolle: Der ,,polare Kern", der als Phosphat-Sensor fungiert, und die ,,3-Element-Interaktion",
die für die Erkennung des Aktivierungszustandes des Rezeptors verantwortlich ist.
Der ,,polare Kern" ist eine für ein zytosolisches, lösliches Protein ungewöhnliche Struktur.
Alle Arrestine besitzen eine extrem hydrophobe Oberfläche, durch die sie eine Anordnung
von drei Aspartat- und zwei Arginin-Resten im Zentrum des Moleküls vom umgebenden
Medium abschirmen (Hirsch et al., 1999; Han et al., 2001; Gurevich et al., 2004). Diese
geladene Region des Arrestins bindet an die phosphorylierte Domäne des aktivierten GPCR,
wodurch das Arrestin-Molekül eine konformationelle Änderung erfährt. Möglicherweise
bindet Arrestin auch als Dimer an den Rezeptor (Storez et al., 2005), obwohl bisher Dimere
nur als inaktive Speicherform diskutiert wurden. Der gesamte in das Zytoplasma ragende Teil
des Rezeptors wird nun von Arrestin umschlossen, während gleichzeitig der C-Terminus des
Arrestins exponiert wird. Dieser Vorgang kann auch durch Bindung an polyanionische
Materialen, wie Heparin oder Phosphopeptide ausgelöst werden. Immobilisiertes Heparin
kann zur affinitätschromatographischen Reinigung der Arrestine (Palczewski et al., 1991)
genutzt werden. Synthetische Phosphopeptide können für Bindungsstudien (Liu et al., 2004;
Xiao et al., 2004) mit Arrestin eingesetzt werden. Handelt es sich bei dem Bindungspartner
des Arrestins um einen aktivierten und phosphorylierten GPCR, kommt es neben dieser
Einleitung
11
ionischen Wechselwirkung zu einer Destabilisierung der ,,3-Element-Interaktion". Diese
hydrophobe Region des Arrestins wird von der -Helix 1 und dem -Faltblatt 1 der N-
terminalen Domäne, sowie dem -Faltblatt 20 der C-terminalen Domäne gebildet. Neun
großvolumige Aminosäurereste sind involviert (Abb. 4). Wird diese ,,3-Element-Interaktion"
gestört, setzt sie einen flexiblen loop frei, der an den aktivierten Rezeptor bindet
(Vishnivetskiy et al., 2000 und 2004) (Abb. 5). Mutationen im Bereich der ,,3-Element-
Interaktion" führen zu konstitutiv aktiven Arrestin-Varianten, die mit hoher Affinität an
unphosphorylierte, aber aktivierte Rezeptoren binden (Gurevich et al., 1998). Diese Proteine
stellen wertvolle Werkzeuge bei der Aufklärung von Struktur und
Signalübertragungsmechanismen der GPCRs dar.
Abbildung 4: Strukturelemente der Rezeptorerkennung durch Arrestin
a) Röntgenkristallstruktur des Arrestin2, (May Han et al., 2001)
b) Raumstrukturmodel der Arrestine mit der Lage des ,,polaren Kerns" (rot)
und der 3-Element-Interaktion (blau), (Gurevich et al., 2006)
c) Der ,,polare Kern" mit den drei Aspartat- (rot) und den drei Arginin-Resten
(blau), (Gurevich et al., 2006)
d) Komponenten der 3-Element-Interaktion, (Gurevich et al. 2006)
Einleitung
12
Abbildung 5: Bindung des Arrestins an den aktivierten und phosphorylierten Rezeptor
unter Freisetzung des C-Terminus
Phosphat-Reste (blau-gelbe Kugeln), C-Terminus (grün), (Gurevich &
Gurevich, 2004)
1.6
Parathormon- , Glucagon-like-Peptide-1-Rezeptor und
ihre Liganden
Die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Rainer Rudolph untersucht unter anderem den GLP1- und
den PTH-Rezeptor sowie deren Liganden. Die Expression in E.coli, die Solubilisierung,
Rückfaltung, Reinigung und biophysikalische Charakterisierung dieser Proteine stehen dabei
im Mittelpunkt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit einem intrazellulären Bindungspartner der
zwei Rezeptoren, dem Arrestin2.
Einleitung
13
Das Parathormon im Säugetierorganismus
Das 84 Aminosäuren lange Parathormon wird in den Epithelkörperchen der Nebenschilddrüse
gebildet und bei Absinken der Kalziumkonzentration im Plasma ausgeschüttet. Durch
Aktivierung verschiedener Mechanismen wird die Ca
2+
-Konzentration im Blut konstant bei
2,25 bis 2,75 mM gehalten. Dies geschieht über die Mobilisierung von Ca
2+
aus den Knochen.
Gleichzeitig fördert es die Ca
2+
-Resorption im distalen Tubulus und hemmt die renale
Resorption von Phosphat- und Carbonationen, um die Ausfällung von schwerlöslichem
Kalziumphosphat und carbonat zu verhindern (Bringhurst et al., 1989).
Das primäre Translationsprodukt der PTH-mRNA ist 115 Aminosäuren lang. Dieses prä-pro-
PTH wird nach Abspaltung der ersten 25 Aminosäuren in den Golgi-Apparat transportiert, wo
eine Endopeptidase weitere sechs N-terminale Aminosäuren entfernt (Friedman & Goodman,
2006). Durch alternatives mRNA-splicing von Vorläuferformen entsteht das PTHrP
(Parathormon related peptide), welches bei gesunden Menschen die Skelettentwicklung
steuert, bei Überproduktion infolge maligner Tumorerkrankungen aber eine schwere
Hyperkalzämie verursacht (Suva et al., 1987). Beide Peptidhormone binden an den PTH-
Rezeptor-1 und zeigen eine Sequenzhomologie in den ersten 13 Aminosäuren, was auf eine
Beteiligung des N-Terminus der Liganden an der Rezeptorbindung hindeutet (Mannstadt et
al., 1999). Durch Untersuchungen an Mensch (Reeve, 1996) und Tier (Mitlak et al., 1996)
wurde die knochenaufbauende Wirkung des PTH nachgewiesen. Zur Osteoporose-Therapie
werden derzeit osteoanabole PTH- oder PTHrP-Analoga eingesetzt und weitere entwickelt,
deren Nebenwirkungen (Hyperkalzämie) möglichst gering sind. Dazu sind weitere Kenntnisse
über die Ligandenbindung des Rezeptors und das Zusammenspiel von PTH und PTHrP bei
der Regulation des Knochenmetabolismus notwendig.
Der PTH-Rezeptor
Der PTH-Rezeptor gehört zur Klasse B der GPCR-Familie und wird hauptsächlich im
Knochengewebe und der Niere exprimiert. Die Identifikation als GPCR erfolgte bereits 1978
(Goltzmann et al., 1978). Die Rezeptoraktivierung kann auch mit einer C-terminal verkürzten
Variante des PTH, dem PTH (1-34) erreicht werden, während ein intakter N-Terminus für die
Wirkung notwendig ist. Dabei bestimmt die PTH-Konzentration, welche second messenger
gebildet werden und damit, welche intrazelluläre Signalkaskade ausgelöst wird. Hohe PTH-
Einleitung
14
Konzentrationen aktivieren über die Freisetzung von Ca
2+
-Ionen aus dem Endoplasmatischen
Retikulum die Proteinkinase C (PKC). Niedrige PTH-Konzentrationen induzieren durch die
Bildung von cAMP durch die Adenylatzyklase die Aktivierung der Proteinkinase A (PKA).
In vitro-Studien (Civitelli et al., 1990) zeigten, dass die Freisetzung von cAMP die Grundlage
der knochenaufbauenden Wirkung des PTH sein könnte.
Die biologische Funktion des Glukagon like peptide-1 (GLP-1)
Das Peptidhormon GLP-1 wird von den endokrinen Zellen des Gastro-Intestinaltrakts nach
Aufnahme von Kohlenhydraten durch den Organismus sezerniert. Es wird in Gehirn, Darm
und Pankreas expimiert (Fehmann et al., 1995). GLP-1 entsteht durch posttranslationale
Prozessierung des Präproglucagons in den L-Zellen des Darms. In den A-Zellen des Pankreas
hingegen entstehen aus Präproglucagon Glucagon, Glicentin-related pankreatic peptide und
das major proglucagonfragment (MPF), welches die Sequenzen für GLP-1 und Glucagon-like
peptide 2 enthält. Das MPF wird hier aber nicht weiter gespalten (Colon et al., 1988). Nach
der Synthese in den L-Zellen des Darms werden vom GLP-1 (1-37) die ersten sechs
Aminosäuren entfernt und die letzte Aminosäure wird größtenteils (zu 80 %) durch eine
Amidgruppe ersetzt, wodurch die biologisch aktive Form, GLP-1 (7-36)-amid, entsteht
(Orskov et al., 1994). Die Hauptwirkung des GLP-1 besteht in der Stimulation der
Insulinsekretion der Zellen des endokrinen Pankreas. Daneben wird auch die
Glucagonsekretion der pankreatischen Zellen verringert und die Darmentleerung
verlangsamt, wodurch ein Sättigungsgefühl vermittelt wird (Fehmann et al., 1995).
Von besonderem therapeutischen Interesse ist die Fähigkeit des GLP-1, die Zahl der nur ca.
6000 Zellen des Pankreas signifikant zu erhöhen und ihre Funktion zu erhalten (Drucker et
al., 2003).
Der GLP-1-Rezeptor
Auch der GLP-1-Rezeptor gehört zur Klasse B der GPCR. Seine Expression wurde in
Magen, Darm und Hypothalamus nachgewiesen (Alvarez et al., 1996). Auf mRNA-Ebene
gelang dieser Nachweis auch in Herz, Niere, Lunge und den Inselzellen des Pankreas
(Bullock et al., 1996). Nach Abspaltung einer 23 Aminosäuren langen Signalsequenz umfasst
der Rezeptor noch 440 Aminosäuren, wovon 122 auf die N-terminale Domäne entfallen.
Auch die isolierte Domäne besitzt eine Bindungsaktivität (Wilmen et al., 1996). Das
Einleitung
15
Disulfidbrückenmuster der sechs hochkonservierten Cysteine ist essentiell für die
Ligandenbildung (Bazarsuren et al., 2002). Nach Bindung des GLP-1 an seinen Rezeptor
erfolgt die Aktivierung der Adenylatzyklase über die G
-Untereinheit des an den GLP-1-
Rezeptor gekoppelten G-Proteins. Die erhöhte cAMP-Konzentration inhibiert ATP-abhängige
K
+
-Kanäle, wodurch es zur Depolarisation der Zellmembran kommt. Diese Depolarisation
führt zur Aktivierung spannungsabhängiger Ca
2+
-Kanäle und dem Einstrom von Ca
2+
-Ionen
in die Zelle. Auch die Aktivierung der Phospholipase C-Kaskade führt zu einer weiteren
Erhöhung der intrazellulären Ca
2+
-Konzentration durch den Ausstrom von Ca
2+
-Ionen aus
dem Endoplasmatischen Retikulum (Wheeler et al., 1993). Die erhöhte Kalziumkonzentration
verstärkt die Ca
2+
-abhängige Exocytose von Insulingranula aus den Zellen des Pankreas
(Holz, 2004). Über beide Signaltransduktionswege fördert GPL-1 so die Insulinsekretion der
Inselzellen.
1.7
Fluoreszierende Proteine
Als mögliche Fusionspartner für Arrestin2 und die Liganden wurden Proteine gewählt, die in
reifer Form autokatalytisch ein Fluorophor ausbilden. Geeignet hierfür sind DsRed aus der
Warmwasserkoralle Discosoma sp. und die von GFP (green fluorescent protein) aus der
Tiefseequalle
Aequorea victoria abgeleiteten Proteine EGFP, EYFP und ECFP. Sowohl GFP
als auch DsRed besitzen ein Molekulargewicht von ca. 27 kDa. Zusammen mit dem 43 kDa
schweren Arrestin2 (1-382) weisen die Fusionsproteine Arr2-L-EGFP und Arr2-L-EYFP ein
Molekulargewicht von etwa 70 kDa auf.
DsRed liegt in vitro als obligates Tetramer vor, Monomere sind farblos. Der Chromophor reift
erst bei Temperaturen von 25 °C oder höher innerhalb von 24-48 Stunden (Baird et al., 2000).
Der Fluorophor des GFP hingegen wird bei Temperaturen unter 20 °C innerhalb einer Stunde
gebildet (Tsien, 1998). Durch gezielte Mutagenese oder DNA-shuffling (Crameri et al., 1996)
wurden GFP-Varianten erzeugt, die auch bei Temperaturen über 20 °C eine hohe
Faltungseffizienz und Stabilität aufweisen (Siemering et al., 1996) oder deren Fluoreszenz um
das 35fache gesteigert werden konnte (Kimata et al., 1997). Von diesem EGFP (enhanced
green fluorescent protein) wurden durch Mutationen im Bereich des Chromophors weitere
Varianten erzeugt. Der Austausch von Threonin203 durch Tyrosin erweitert das System
konjugierter Doppelbindungen während Threonin anstelle des Serins an der Position 65 die
Deprotonierung des Chromophors fördert. Diese Mutante des EGFP, das EYFP (enhanced
yellow fluorescent protein) fluoresziert gelb-grün. Die Anlagerung von Protonen oder
Einleitung
16
Chlorid-Ionen an den Chromophor des EYFP führt zum quenching der Fluoreszenz (Nagai et
al., 2002). Der Austausch des Tyrosin66 durch Tryptophan führt einen Indol-Ring anstelle
des Phenols bzw. Phenolat-Anions ein und erzeugt ein blau fluoreszierendes Protein, das
ECFP (enhanced cyan fluorescent protein). Mögliche FRET-Paare für den Einsatz in einem
geplanten Funktionstest sind DsRed/EGFP und ECFP/EYFP.
1.8
Ziel dieser Arbeit
Der großen Bedeutung der GPCRs bei der Signaltransduktion steht ein bislang nur geringes
Wissen über ihre Struktur und die konformationellen Änderungen während dieses Prozesses
gegenüber. Daher ist die Strukturaufklärung von Mitgliedern dieser Rezeptorklasse von
hohem Interesse. GPCRs können nur in sehr geringen Mengen aus biologischem Material
isoliert werden. Daher wird in unserer Arbeitsgruppe versucht, durch heterologe
Überexpression in E.coli genügend Protein für die biophysikalische Charakterisierung
herzustellen. GLP-1- und PTH-Rezeptor werden in Form von inclusion bodies in E.coli
exprimiert und sollen nach der Solubilisierung und Reinigung zu funktionellen Rezeptoren
renaturiert werden.
Zur Überprüfung der nativen Struktur der renaturierten Rezeptoren soll langfristig ein
FRET(Förster Resonanz Energie Transfer)-assay entwickelt werden (Abb.6). Durch die
Verwendung von natürlichen intra- und extrazellulären Bindungspartnern der Rezeptoren
wird die Funktionalität des Gesamtrezeptors nachgewiesen. Als N-terminale Bindungspartner
werden die Liganden PTH und GLP-1 verwendet, während Arrestin2 als Bindungspartner für
den C-Terminus der beiden Rezeptoren ausgewählt wurde. Die Grundidee besteht darin, die
Liganden und Arrestin2 mit geeigneten Fluorophoren zu markieren und mit dem Rezeptor zu
inkubieren. Der native Rezeptor wird nach Bindung des Liganden an der N-terminalen
Domäne aktiviert und ermöglicht so die Bindung des Arrestin2 am C-Terminus. Hierdurch
werden beide Fluorophore unter Umständen in ausreichend große räumliche Nähe zueinander
gebracht (ca. 30 Å), um nach Anregung des Donors einen FRET beobachten zu können.
Durch eine Überlappung des Emissionsspektrums des Donors mit dem Absorptionsspektrum
des Akzeptors findet ein strahlungsloser Energietransfer statt. Da die Effizienz dieses
Energietransfers mit der Entfernung der Partner (r
6
) abnimmt, ist nur bei enger räumlicher
Nähe (allgemeiner Bereich zwischen 10-80 Å) ein FRET zu beobachten. Um diesen Test zu
vereinfachen, wird statt des Wildtyp-Arrestins eine konstitutiv aktive Mutante verwendet, die
spezifisch den aktivierten, aber unphosphorylierten Rezeptor erkennt. Bei dieser Variante des
Details
- Seiten
- Erscheinungsform
- Originalausgabe
- Jahr
- 2006
- ISBN (eBook)
- 9783832498931
- ISBN (Paperback)
- 9783838698939
- DOI
- 10.3239/9783832498931
- Dateigröße
- 2.5 MB
- Sprache
- Deutsch
- Institution / Hochschule
- Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg – Biochemie / Biotechnologie, Biotechnologie
- Erscheinungsdatum
- 2006 (Oktober)
- Note
- 1,0
- Schlagworte
- biotechnologie biochemie rezeptor biacore fermentation
