Screening und Identifizierung allelopathischer Substanzen aus Nährlösungen der Cyanobakterie Nodularia spumigena

Scholz, Bettina

Screening und Identifizierung allelopathischer Substanzen aus Nährlösungen der Cyanobakterie Nodularia spumigena

Zusammenfassung

Inhaltsangabe:Einleitung:
Von Cyanobakterien ist aus pharmakologischen Studien bekannt, dass sie Sekundärmetabolite mit algizider, fungizider sowie antibakterieller Wirkung bilden können. Mittlerweile sind über 330 Sekundärmetabolite aus unterschiedlichen Taxa isoliert worden, allerdings nur wenige mit bekannter ökologischer Funktion. Am Beispiel des gut untersuchten cyano-bakteriellen Toxins Microcystin aus Microcystis aeruginosa ist erkennbar, dass pharma-kologische Fragestellungen oft bevorzugt betrachtet werden. So ist der Mechanismus der Toxinwirkung auf höhere, warmblütige Vertebraten bis auf Zellebene aufgeklärt. Dagegen ist der ökologische Nutzen der Microcystine für die Cyanobakterien bis jetzt unbekannt.
Evolutionsbiologisch lässt sich die Toxizität gegen höhere Vertebraten nicht mit einem adaptiven Wert der Toxinbildung für M. aeruginosa erklären. Ein möglicher Grund für die bisherige Vernachlässigung ökologischer Untersuchungen ist, dass die zu untersuchenden Substanzen in der Regel nur in sehr geringen Mengen vorkommen. Dies stellt experimentell hohe Anforderungen an die Nachweisanalytik und gleichzeitig bedarf es einer hohen Biomasse des produzierenden Cyanobakteriums bei der gezielten Untersuchung der bioaktiven Komponente. Die meist komplexen Interaktionen im Freiland erschweren gleichzeitig die exakte Zuordnung der produktiven Spezies zu der detektierten biogenen Substanz.
Wertvolle Hinweise auf einen möglichen ökologischen Nutzen der Cyanobakterienmetabolite für ihre Produzenten ergaben sich aus der Untersuchung benthischer Cyanobakterien in photoautotrophen Biofilmen. Neben der Konkurrenz um abiotische Faktoren, wie z.B. Licht, spielt der Schutz vor Herbivorie eine wichtige Rolle. Für beides stellen biochemische Interaktionen eine geeignete Strategie für Cyanobakterien dar, um ihre Kon-kurrenzstärke zu erhöhen. Hierbei ermöglicht es der enge Kontakt zwischen benthischen Primärproduzenten wie Cyanobakterien und Algen in Biofilmen, dass biochemische Wechselwirkungen zwischen konkurrierenden Arten effizient sein können. Nach der Definition von MOLISCH (1937) werden solche Interaktionen als Allelopathie bezeichnet, eine biochemische Wechselwirkung sowohl intra- als auch inter-spezifischer Natur. Allelopathisch aktive Substanzen aus Cyanobakterien wirken bereits in geringen Konzentrationen gegen andere Cyanobakterienarten und Chlorophyceen, wobei das Angriffsziel häufig das Photosystem II ist.
Allelopathisch aktive Substanzen sind […]

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

ID 9577

Scholz, Bettina: Screening und Identifizierung allelopathischer Substanzen aus

Nährlösungen der Cyanobakterie Nodularia spumigena

Druck Diplomica GmbH, Hamburg, 2006

Zugl.: Fachhochschule Oldenburg/Ostfriesland/Wilhelmshaven, Standort Wilhelmshafen,

Diplomarbeit, 2006

Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte,

insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von

Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der

Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen,

bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine Vervielfältigung

dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen

der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik

Deutschland in der jeweils geltenden Fassung zulässig. Sie ist grundsätzlich

vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des

Urheberrechtes.

Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in

diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme,

dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei

zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften.

Die Informationen in diesem Werk wurden mit Sorgfalt erarbeitet. Dennoch können

Fehler nicht vollständig ausgeschlossen werden, und die Diplomarbeiten Agentur, die

Autoren oder Übersetzer übernehmen keine juristische Verantwortung oder irgendeine

Haftung für evtl. verbliebene fehlerhafte Angaben und deren Folgen.

Diplomica GmbH

http://www.diplom.de, Hamburg 2006

Printed in Germany

Inhaltsverzeichnis

_________________________________________________________________________________

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ... I

Danksagung...

Abkürzungsverzeichnis... V

Zusammenfassung ... VI

Einleitung ...

2. Stand des Wissens ... 3

2.1. Morphologie und Systematik der Cyanobakterien mit besonderer

Berücksichtigung von Nodularia spumigena... 3

2.2. Cyanobakterielle Sekundärmetabolite aus Nährlösungen... 10

2.2.1. Exopolysaccaride ... 10

2.2.2. Fett- und Aminosäuren... 12

2.2.3. Cyanobakterielle Toxine... 13

Problemstellung ...

4. Material und Methoden ... 17

4.1.

Nodularia spumigena... 17

4.1.1. Stammhaltung und Vorkultivierung von N. spumigena ... 18

4.1.2. Up scale und Versuchsbedingungen ... 19

4.1.3. Beprobung der 6 L-Batchkulturen ... 19

4.1.4. Auswertung der Zellzählungen (nach UTHERMÖHL 1958)... 20

4.1.5. Ernte der Nährlösungen von N. spumigena... 21

4.1.6. Aufarbeitung der Nährlösungen ... 22

4.1.6.1. Extraktion mit Methanol (nach FRANZ & KOEHLER, 1992) ... 22

4.1.6.2. Extraktion mit Ethanol (nach HOUGHTON & TRAMAN, 1988) ... 22

4.1.6.3. Extraktion mit Dichlormethan und Methanol (nach

WÖSTMANN, 2000)... 24

4.1.6.4. Abtrennung der Fettsäuren (nach WÖSTMANN, 2000)... 25

4.2. Chemisches Screening (nach LELLAU & LIEBEZEIT, 2003)... 27

Inhaltsverzeichnis

_________________________________________________________________________________

4.2.1. Alkaloide ... 27

4.2.2. Flavonoide ... 29

4.2.3. Saponine... 30

4.2.4. Tannine und andere phenolische Komponenten ... 30

4.3. Testsysteme auf biologische Wirksamkeiten (nach LELLAU 2000)... 32

4.3.1. Algizide Aktivität... 32

4.3.2. Antibakterielle Aktivität ... 33

4.3.3. Fungizide Aktivität ... 34

4.3.4. Cytotoxische Aktivität ... 35

4.3.4.1. Der Leuchtbakterien Test ... 35

4.3.4.2. Cytotoxizitätstest mit Artemia salina LEACH ... 36

4.4. Screening der Nährlösungen von N. spumigena mittels instrumenteller

Analytikmethoden ... 38

4.4.1. Analytische Dünnschichtchromatographie (nach FRANZ & KOEHLER

1992)... 38

4.4.2. HPLC ... 40

4.4.3. Gaschromatographie (GC/FID) ... 40

4.4.4. Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC/MS) ... 41

5. Ergebnisse und Diskussion ... 42

5.1. Wachstumskurven: Ergebnisse und Diskussion... 42

5.2. Ergebnisse und Diskussion des chemischen Screenings ... 43

5.2.1. Alkaloide ... 43

5.2.2. Flavonoide und Saponine... 44

5.2.3. Tannine und andere phenolische Komponenten... 45

5.2.4. Zusammenfassung und Diskussion ... 46

5.3. Ergebnisse und Diskussion der Tests auf biologische Wirksamkeiten ... 47

5.3.1. Algizide Aktivität... 47

5.3.2. Antibakterielle Aktivität ... 48

5.3.3. Fungizide Aktivität ... 49

5.3.4. Cytotoxische Aktivität ... 50

5.3.4.1. Der Leuchtbakterien Test ... 50

5.3.4.2. Cytotoxizitätstest mit Artemia salina LEACH ... 51

5.3.5. Zusammenfassung und Diskussion ... 53

5.4. Ergebnisse und Diskussion des Screenings der Nährlösungen von N.

spumigena mittels Instrumenteller Analytikmethoden ... 55

Inhaltsverzeichnis

_________________________________________________________________________________

III

5.4.1. Analytische Dünnschichtchromatographie... 55

5.4.2. HPLC ... 59

5.4.3. Gaschromatographie (GC/FID) ... 60

5.4.4. Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC/MS) ... 60

5.4.5. Diskussion des Screenings mittels Instrumenteller Analytikmethoden ... 71

Schlussbetrachtung ...

6.1. Das Screening nach allelopathischen Substanzen in Nährlösungen der

Cyanobakterie N. spumigena Methoden und Ergebnisse ... 76

6.2. Bioaktive sekundäre Naturstoffe ... 83

6.3. Allelochemikalien aus Nährlösungen von N. spumigena... 87

6.4. Flavonoide und Alkaloide aus Nährlösungen von N. spumigena ... 90

6.5. Effekte der identifizierten allelopathischen Substanzen sowie deren

ökologische Relevanz... 93

Ausblick...

Literaturverzeichnis...

9. Anhang... 116

Danksagung

_________________________________________________________________________________

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Gerd Liebezeit danke ich sehr herzlich für die interessante Themenstellung,

für die Möglichkeit diese Arbeit am Forschungszentrum T

ERRAMARE

anfertigen zu dürfen,

stete Diskussionsbereitschaft und die engagierte Betreuung dieser Arbeit.

Weiterhin gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. Eike Siefert für das Interesse an dieser Arbeit sowie

die freundliche Übernahme des Koreferates.

Frau Susanne Busch vom Leibnitz-Institut für Ostseeforschung in Warnemünde möchte ich

für die Bereitstellung der Stammkultur von Nodularia spumigena danken.

Ein ganz besonderer Dank geht an Herrn Dr. Ralf Wöstman für die gute Zusammenarbeit

und die ergänzende Hilfestellung bei so manchen GC/MS-Problemen.

Bei Frau Ursula Pijanowska möchte ich mich sehr herzlich für die Aufnahme des HPLC-

Spektrums bedanken, sowie ihre freundliche und kompetente Unterstützung.

Besonders Danken möchte ich an dieser Stelle auch Frau Diplom-Biologin Elke Ahrensfeld

für die interessanten Gespräche und die Unterstützung jeglicher Art, wann immer eine

kleinere Katastrophe anstand.

Schließlich sei allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern des Forschungszentrum

ERRAMARE

sowie der Meeresstation des ICBM der Universität Oldenburg herzlich für ihre

stete Hilfsbereitschaft und der allgemeinen guten Arbeitsatmosphäre gedankt.

Abkürzungsverzeichnis

_________________________________________________________________________________

Abkürzungsverzeichnis

Kohlendioxid

Dünnschichtchromatographie

DCM

Dichlormethan

DNA Desoxiribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

Fd Ferredoxin

ER Endoplasmatisches

Retikulum

EtOH Ethanol

GC Gaschromatograph

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

IR Infrarot-Absorptionsspektroskopie

Nodularia

Elementarer Stichstoff

NMR Kernresonanzspektroskopie

MeOH Methanol

MS Massenspektrometrie

PAR

Photosynthetic Actice Radiation

STEMI

Stereomikroskop SV 11

UV /VIS

Ultraviolett /sichtbares Licht

Zusammenfassung

_________________________________________________________________________________

Zusammenfassung

Die Resultate des am Forschungszentrum T

ERRAMARE

durchgeführten Screenings der Nährlö-

sungen von

Nodularia spumigena

wiesen ein interessantes Potential allelopahischer Aktivitäten

auf. Die Cyanobakterie wurde hierbei unter variierten abiotischen Parameter kultiviert, um eine

Produktion der bioaktiven Substanzen zu induzieren.

Die detektierten Aktivitäten konnten sowohl in den Nährlösungsextrakten der Standardkultur als

auch in den Nährlösungsextrakten der unterschiedlichen Versuchsansätze festgestellt werden

und verursachten teilweise signifikante Wachstumsinhibitionen bei den getesteten Bioassay-

organismen, wobei eine ausgeprägte Wirkungsselektivität der Extrakte beobachtet wurde. So

konnten vereinzelt teilweise bezeichnende Letalitäten in den Cytotoxizitätstests mit

Artemia

salina

festgestellt werden, während gegenüber der getesteten Mikroalge

Chlorella vulgaris

, den

Fungi sowie den heterotrophen und autotrophen Bakterien keinerlei Aktivität verzeichnet werden

konnte.

Im Laufe der Untersuchung kamen neben dem chemischen und biologischen Screening vor

allem chromatographische sowie spektroskopische Methoden wie DC, HPLC, GC/FID und

GC/MS zur Anwendung. Letztere Methode führte zu einer Identifizierung isoprenoider Natur-

stoffe wie Steroide und Terpenoide sowie -, - und -Tocopherol als phenolische Kompo-

nenten. Neben einer großen Anzahl von Lipiden wie Palmitin-, Linol- und Arachnidonsäure,

konnten Benzo-2-pyron als Flavonoid- sowie L-(-)-Pipecolinsäure als Alkaloidkomponente

identifiziert werden. Letztere wurden lediglich in dem Extrakt DCM-NI detektiert. Aufgrund der

Verwendung unterschiedlicher Extraktionsmethoden sowie der Aufreinigung der DCM-Extrakte

durch eine Säulenchromatographie gingen vermutlich einzelne der im chemischen Screening

nachgewiesenen Komponenten wie Tannine und Saponine verloren. Weiterhin lassen die

während der analytischen Dünnschichtchromatographie determinierten Einzelsubstanzen auf

die Anwesenheit weiterer Alkaloide und Flavonoide schließen, die hier allerdings nicht einer

Identifikation zugeführt werden konnten. Diese Beobachtungen führten zu der Schlussfolgerung,

dass die im Rahmen dieser Untersuchung verwendeten Analytikmethoden weiterer Modifika-

tionen bedürfen.

Die im Laufe des biologischen Screenings festgestellten allelopathischen Aktivitäten, konnten

durch Literaturrecherche größtenteils den durch die Cyanphyceae

Nodularia spumigena

in die

Nährlösung abgegeben Fettsäuren zugeordnet werden. Mangels geeigneter Literaturreferenzen

konnte dagegen dem hier identifizierten Flavonoid sowie Alkaloid keine der beobachteten

biologischen Aktivitäten zugeordnet werden, wobei additive Effekte mit den beobachteten Lipid-

komponenten nicht ausgeschlossen werden können.

Einleitung

_________________________________________________________________________________

1 Einleitung

Von Cyanobakterien ist aus pharmakologischen Studien bekannt, dass sie Sekundärmetabolite

mit algizider, fungizider sowie antibakterieller Wirkung bilden können. Mittlerweile sind über 330

Sekundärmetabolite aus unterschiedlichen Taxa isoliert worden, allerdings nur wenige mit

bekannter ökologischer Funktion (JÜTTNER 1999). Am Beispiel des gut untersuchten cyano-

bakteriellen Toxins Microcystin aus Microcystis aeruginosa ist erkennbar, dass pharma-

kologische Fragestellungen oft bevorzugt betrachtet werden. So ist der Mechanismus der

Toxinwirkung auf höhere, warmblütige Vertebraten bis auf Zellebene aufgeklärt. Dagegen ist der

ökologische Nutzen der Microcystine für die Cyanobakterien bis jetzt unbekannt (KAEBERNICK

& NEILAN 2001).

Evolutionsbiologisch lässt sich die Toxizität gegen höhere Vertebraten nicht mit einem adaptiven

Wert der Toxinbildung für M. aeruginosa erklären. Ein möglicher Grund für die bisherige

Vernachlässigung ökologischer Untersuchungen ist, dass die zu untersuchenden Substanzen in

der Regel nur in sehr geringen Mengen vorkommen (GROSS et al. 1991). Dies stellt

experimentell hohe Anforderungen an die Nachweisanalytik und gleichzeitig bedarf es einer

hohen Biomasse des produzierenden Cyanobakteriums bei der gezielten Untersuchung der

bioaktiven Komponente. Die meist komplexen Interaktionen im Freiland erschweren gleichzeitig

die exakte Zuordnung der produktiven Spezies zu der detektierten biogenen Substanz

(JÜTTNER & WU 2000).

Wertvolle Hinweise auf einen möglichen ökologischen Nutzen der Cyanobakterienmetabolite für

ihre Produzenten ergaben sich aus der Untersuchung benthischer Cyanobakterien in

photoautotrophen Biofilmen. Neben der Konkurrenz um abiotische Faktoren, wie z.B. Licht,

spielt der Schutz vor Herbivorie eine wichtige Rolle (JÜTTNER 1999). Für beides stellen

biochemische Interaktionen eine geeignete Strategie für Cyanobakterien dar, um ihre Kon-

kurrenzstärke zu erhöhen (GROSS 1990, 1999, JÜTTNER 1999). Hierbei ermöglicht es der

enge Kontakt zwischen benthischen Primärproduzenten wie Cyanobakterien und Algen in

Biofilmen, dass biochemische Wechselwirkungen zwischen konkurrierenden Arten effizient sein

können (GROSS 1999). Nach der Definition von MOLISCH (1937) werden solche Interaktionen

als Allelopathie bezeichnet, eine biochemische Wechselwirkung sowohl intra- als auch inter-

spezifischer Natur. Allelopathisch aktive Substanzen aus Cyanobakterien wirken bereits in

geringen Konzentrationen gegen andere Cyanobakterienarten und Chlorophyceen, wobei das

Angriffsziel häufig das Photosystem II ist (SRIVASTAVA et al. 1998, 1999, JÜTTNER 1999,

SMITH & DOAN 1999).

Einleitung

_________________________________________________________________________________

Allelopathisch aktive Substanzen sind Sekundärmetabolite, die von den Zellen nicht für ihren

Grundstoffwechsel benötigt werden. Daher wird vermutet, dass ihre Produktion durch Umwelt-

faktoren gesteuert wird. Abiotische Faktoren wie Stresssituationen durch Nährstoffmangel oder

Lichtlimitation können eine gesteigerte Produktion bewirken (BOYER et al. 1987). Um die

Auswirkungen von Nährstoffmangel zu untersuchen, wurden in Laborexperimenten vor allem die

Makronährstoffe Phosphor und Stickstoff limitiert. Während Phosphatmangel in vielen Fällen zu

einer gesteigerten Produktion an Sekundärmetaboliten in Cyanobakterien und Dinoflagellaten

führte (BOYER et al. 1987, VON ELERT & JÜTTNER 1996, GROSS 1999, SCHWARTZ et al.

1990), variierten die Auswirkungen von Stickstoffmangel.

Mikroalgen und Cyanobakterien sind offensichtlich in der Lage, unterschiedliche Metaboliten in

ihr Kulturmedium abzugeben. So konnten bereits biogene Amine (HERRMANN & JÜTTNER

1977), Aminosäuren (POULET & MARTIN-JÉZÉQUEL 1983), Exopolysaccharide (FISCHER

1996, SCHULZE 2000, VENZKE 2005) und cytotoxische (FISH & CODD 1994a, 1994b) sowie

algizide (GROMOV et al. 1991, VOLKMANN 1999) Verbindungen in den Nährlösungen isoliert

werden. Dennoch ist bisher nur wenig über solche extrazellulären Metaboliten in den

Kulturüberständen bekannt.

Bei der Untersuchung des Nährlösungsfiltrats einiger Cyanobakterienspezies hinsichtlich ihrer

wachstumshemmenden Wirkung gegenüber anderen in einer Planktonpopulation vorkommen-

den Mikroalgen erwies sich Nodularia spumigena als effektiver Produzent allolopathisch

wirkender Verbindungen. Die detektierbare Aktivität dieser Substanzen war hierbei auf die

exponentielle Wachstumsphase beschränkt. Eine maximale Konzentration des Hepatotoxins

Nodularin konnte allerdings erst in der stationären Phase der Kultur beobachtet werden. Diese

Beobachtung lässt die Schlussfolgerung zu, dass eventuell auch andere Verbindungen mit

allelopathischem Effekt als das Toxin Nodularin von dieser Spezies synthetisiert werden könnten

(SUIKKANEN et al. 2004). Auf dieser Vermutung basierend sollten nun im Rahmen dieser

Diplomarbeit Verbindungen, die durch ein chemisches Vorscreening, nachgewiesen werden

konnten, aus den Nährlösungen von Nodularia spumigena extrahiert, die biologische Wirk-

samkeit getestet und - wenn möglich - die Strukturen dieser biogenen Substanzen aufgeklärt

werden. Einen einleitenden Überblick in die Vielfalt bisher detektierter und isolierter extra-

zellulärer Verbindungen aus Cyanobakterien und speziell aus Kulturen von Nodularia

spumigena soll in dem folgenden Kapitel vermittelt werden. Zuvor soll in einem Exkurs in die

Morphologie und Systematik der im Mittelpunkt dieser Untersuchung stehende Organismus

vorgestellt werden.

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

2 Stand des Wissens

2.1. Morphologie und Systematik der Cyanobakterien - unter besonderer Berücksich-

tigung von

Nodularia spumigena

Wie in Abbildung 2.1. erkennbar, zeigen Cyanobakterien eine typische prokaryotische Zell-

organisation. Das Cytoplasma ist nicht in Kompartimente eingeteilt, das heißt, es existieren

keine klar abgegrenzten Organellen, sondern alle funktionellen Bestandteile der Zelle sind über

das Cytoplasma verteilt. Trotzdem lässt sich das Cytoplasma grob in zwei Regionen einteilen,

eine periphere und eine zentrale. Die zentrale Region, auch Nucleoplasma genannt, weist eine

leicht granulierte Struktur durch die Anwesenheit von Ribosomen auf. Weiterhin enthält sie die

stark verdrillten ringförmigen Chromosomen. In der peripheren Region befindet sich das

Photosynthesemembransystem, welches durch Invaginationen der Plasmamembran ausgebildet

wird. Diese Region wird auch als Chromatoplasma bezeichnet. Das Cytoplasma von

Cyanobakterien enthält eine Reihe verschiedener Einschlüsse, welche meistens der Bevor-

ratung mit Nährstoffen dienen, um unter extremen Umweltbedingungen zu überleben (TAND-

EAU DE MARSAC & HOUTNARD 1993).

Abbildung 2.1. Querschnitt durch eine typische Zelle eines Cyanobakteriums (VAN DEN HOEK et al.

1993).

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

Als Kohlenstoff und Energiereserve dienen Glycogengranula. Der Reservestoff wird Cyano-

phyceanstärke genannt und ist ein dem tierischen Glykogen ähnliches Glucan. Lipide werden in

Lipidtröpfchen nahe der äußeren Membran gespeichert, sie dienen hauptsächlich der

Membransynthese. Cyanophycingranula sind essentiell für den Stickstoffumsatz und bestehen

aus einem einzigartigen Polypeptid, welches nur aus zwei Aminosäuren aufgebaut ist; Arginin

und Asparaginsäure. Die Speicherung des Phosphatvorrates erfolgt in sogenannten Volutin-

körpern, während die Enzyme der Photosynthese in Carboxysomen gelagert werden.

Das Cytoplasma ist von einer Membran, dem Plasmalemma begrenzt. Außerhalb des

Plasmalemmas schließt sich eine Gram-negative Zellwand an, die noch von einer schleimigen

Kapsel umgeben sein kann. Cyanobakterien umfassen Mikroorganismen, die morphologisch

grob in zwei Gruppen eingeteilt werden können: die einzelligen coccoidalen sowie die mehr-

zelligen filamentösen Formen. Coccoidale Formen, wie z.B.

Microcystis aeruginosa

, bestehen

aus einfachen Einzelzellen, deren Form oval, kugelig oder zylindrisch sein kann. Sie liegen

entweder als freie Zellen oder als Zellaggregate in einer schleimigen Matrix vor (Kolonien).

Coccoidale Einzelzellen können einen Durchmesser von 0,4 bis über 40 µm aufweisen. Die

Reproduktion der Cyanobakterien erfolgt generell durch Teilung (VAN DEN HOEK et al. 1993).

Bei filamentösen Formen, wie

N. spumigena

, kann der Durchmesser bis zu 100 µm betragen, in

der diametralen Ebene jedoch weisen diese nur einen sehr geringen Durchmesser auf. Sie

stellen somit kleine Scheiben dar, die sich zu einem langen Faden aneinander reihen

(DEMOULIN & JANSSEN 1989). Spezies, die echte Verzweigungen ausbilden, bilden auch

Hormogonien. Diese Strukturen wurden von DESIKACHARY (1959) als kurze, bewegliche

Ketten gleichgeformter Einzelzellen definiert, wobei nicht alle Hormogenien in dieses Schema

passen. Hormogonien spielen eine entscheidende Rolle bei vielen wichtigen physiologischen

Prozessen in Cyanobakterien (TANDEAU DE MARSAC 1994). Im Wesentlichen handelt es sich

hierbei um modifizierte Filamente, die der Reproduktion und Verbreitung dienen (vgl. Abbildung

2.4.). In Organismen mit Heterocyten sind diese morphologisch einfacher gebaut als andere

Filamente, besitzen aber große Vorräte an Stickstoff, Phosphor sowie weitere Nährstoffe

(RIPPKA et al. 1979, RIPPKA & HERDMANN 1992). Das Photosynthesesystem der Cyano-

bakterien liegt typischerweise in der peripheren Region des Cytoplasmas. In einzelligen Formen

besteht es meistens aus ein paar Membranschichten, die konzentrisch um die zentrale Region

angeordnet sind. In filamentösen Formen sind die Membranen komplizierter angeordnet. Das

Membransystem wird als Thylakoid bezeichnet. In die Lipiddoppelschicht der Thylakoidmembran

sind die lipophilen Photosynthesepigmente, wie Chlorophyll a und verschiedene Carotenoide

eingebaut (HALL & RAO 1999). Chlorophyll a ist das einzige Chlorophyll, das Cyanobakterien

synthetisieren. -Caroten ist anscheinend in allen Cyanobakterienspezies anzutreffen, wohin-

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

gegen das Vorkommen von verschiedenen Xanthophyllen, wie Zeaxanthin, Oscillaxanthin oder

Myxoxanthophyll von Art zu Art unterschiedlich ist. Eine weitere wichtige Rolle im Photo-

synthesesystem der Cyanobakterien spielen die Phycobilisomen (vgl. Abbildung 2.2.). Sie

bestehen aus wasserlöslichen Proteinen, Biliproteinen c-Phycocyanin und c-Allophycocyanin,

sowie c-Phycoerythrin (KOHL & NICKLISCH 1988).

Abb. 2.2. a) Struktur eines Thylakoiden. b) Aufbau eines Phycobillisoms (VAN DEN HOEK et al. 1993).

In Abbildung 2.3. sind Akineten der Cyanobakterie

Nodularia spumigena

aus einer Plankton-

probe dargestellt. Akineten stellen größere und robustere Zellen als die vegetativen Formen dar.

Diese werden unter ungünstigen Umweltbedingungen gebildet, wobei es von Spezies zu

Spezies verschieden ist, welche Faktoren für die Ausbildung Akineten verantwortlich sind

(WHITTON 1992). Ihre Aufgabe ist es, die Art während Austrocknungs- oder Nährstoff-

mangelphasen zu erhalten, um später wieder vegetative Formen bilden zu können (Abbildung

2.4.). Sie sind größtenteils auf Spezies mit Heterocyten beschränkt (CARR 1979, WHITTON &

CARR 1982).

Cyanobakterien können Stickstoff in Form von Nitrat, Nitrit, Ammonium, Hydroxylamin.

Harnstoff, Kasein, Aminosäuren und als elementaren Stickstoff assimilieren. Es ist von der

jeweiligen Spezies sowie von den physiologischen Gegebenheiten abhängig, welche Stickstoff-

quellen effizient genutzt werden können; alle Cyanobakterienarten können jedoch mit Nitrat als

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

Stickstoffquelle wachsen (HOLM-HANSEN 1968). Von großer biologischer Bedeutung ist der

Umstand, dass heterocytenbildende Cyanobakterien elementaren Stickstoff fixieren können

(WHITTON & CARR 1982).

Abb. 2.3. Akineten von

Nodularia spumigena

Abb. 2.4. Bildung von Akineten und

Hormogonien am Beispiel der

Gattung

Nodularia

(DIXIT et al.

1985). Aus dem ursprünglichen

Trichom (a) entstehen Hormogonien

(b) durch Bildung von ,,Trennschei-

ben" (T). Akineten werden durch An-

reicherung mit Reservestoffen (c)

und Verdickung der Zellwand (d)

gebildet. Aus den Akineten bildet

sich ein Trichom (e bis h).

Der Enzymkomplex Nitrogenase katalysiert hierbei die ATP-verbrauchende Reaktion, bei der

elementarer Stickstoff zu zwei Ammoniummolekülen reduziert wird. Der Nitrogenase-Enzym-

komplex ist extrem sauerstoffempfindlich und kann somit nur unter anaeroben Bedingungen

funktionieren (CARR & BRADLEY 1973). Durch direkten Kontakt mit Sauerstoff wird der

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

Enzymkomplex inaktiviert und es werden sogar begleitende Proteine zerstört (FAY 1983). Daher

findet dieser Vorgang normalerweise in so genannten Heterocyten statt. Bei den Heterocyten

handelt es sich um spezialisierte Zellen, die in mehr oder weniger regelmäßigen Abständen

zwischen die vegetativen Zellen eingebaut werden. Sie sind dickwandiger und in ihnen findet

keine Photosynthese statt, so dass sie als sauerstofffreier Raum der Stickstofffixierung dienen

können (FLORES & HERRERO 1994). Manche Cyanobakterien haben Strategien entwickelt um

Stickstoff auch ohne Heterocyten zu fixieren, über die Mechanismen um den Schutz des

Nitrogenasekomplexes vor Sauerstoff zu gewährleisten ist dagegen wenig bekannt (TANDEAU

DE MARSAC 1994).

Heterocyten bilden sich gewöhnlicherweise in Labor-Kulturen erst aus, wenn die Konzentration

von Stickstoffquellen im Medium minimalisiert wird (FOGG 1944, CASTENHOLZ & WATER-

BURY 1989). Diese Beobachtung wird bestätigt durch die Tatsache, dass in vielen Freiland-

Untersuchungen Heterocytenbildung nur in sehr stickstoffarmer Umgebung zu beobachten ist

(FOGG et al. 1973, MARINO et a. 1990).

Viele fädige Cyanobakterien wie

N. spumigena

sind fähig sich fortzubewegen, wenn sie sich in

Kontakt zu einem Substrat befinden auf dem es möglich ist zu gleiten. Die Organismen nutzen

diese Fähigkeit einerseits um Zonen optimaler Bestrahlungsstärke in ihrer Umgebung

aufzusuchen, aber auch um sich in Form von Hormogonien auf symbiotische Wirte zu

zubewegen. Der Mechanismus dieser Fortbewegung ist noch nicht vollständig geklärt, hierbei

werden derzeitig zwei Hypothesen diskutiert. Angenommen wird einerseits, dass sich das

Cyanobakterium durch den Ausstoß von Exopolysacchariden aus bestimmten Poren durch

Scherkräfte auf einer Oberfläche bewegen kann (BOLD & WYNNE 1985), bzw. andererseits

dass es sich durch Kontraktion bestimmter Filamente fortbewegt (HALFEN & CASTENHOLZ

1971).

Die ersten taxonomischen Einteilungen der Cyanobakterien wurden um 1753 von LINNAEUS

vorgenommen, während des 19. und 20. Jahrhunderts wurden diese weiterentwickelt. Die

klassische Taxonomie der Cyanobakterien richtete sich nach morphologischen Gesichtspunkten

und beschrieb an die 2000 verschiedene Arten und 150 Gattungen (GEITLER 1932). In den

Siebzigerjahren begann die Einteilung der Cyanobakterien nach dem bakteriologischen Aspekt.

Hierbei bildeten physiologische Kriterien wie die Pigmentzusammensetzung, die Fettsäure-

analytik und die Nitrogenaseaktivität, sowie genomische Aspekte wie Genomgröße und DNA-

Zusammensetzung die Grundlage der Klassifizierung (HERDMAN 1979a, HERDMAN et al.

1979b, KENYON et al. 1972, RIPPKA et al. 1979). Aus diesen Daten ergibt sich die, dem

botanischen System sehr ähnliche, Einteilung in zwei Unterklassen mit sechs Ordnungen

(STRASBURGER et al. 2002). In Abbildung 2.6. erfolgt eine taxonomische Einordnung der

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

Cyanobakterie

Nodularia spumigena

nach CAMPBELL (1997)

sowie KOMÁREK & ANAGNOS-

TIDIS (1989). Hiernach gehört

N. spumigena

der Ordnung Nostocales an. Die dieser Ordnung

zughörigen Familien besitzen eine Reihe gemeinsamer Merkmale wie z.B. die Bildung von

Trichomen sowie das Wachstum durch interkalare Zellteilung in nur einer Raumrichtung.

Weiterhin können Heterozyten und Akineten beobachtet werden.

Abbildung 2.5. Trichome von

Nodularia spumigena

. a) Skizziert von NORDIN & STEIN (1980) und b) bei

1000facher Vergrößerung. Maßstab: 20 µm.

Zur Vermehrung dienen Hormogonien und Akineten (WILMOTTE 1994). Spezies, die von einer

Gallertscheide umgeben sind können nach RIPPKA & HERDMAN (1992) unechte

Verzweigungen bilden. Einige Arten sind an den Querwänden eingeschnürt und besitzen

dadurch kugelige oder ovale Zellmorphologien (VAN DEN HOEK et al. 1993). Die Gattung

Nodularia

wird der Familie der Nostocaceae zugeordnet (KOMÁREK & ANAGNOSTIDIS 1989).

Die Trichome sind hier von einer mehr oder weniger festen Gallertscheide umgeben (vgl.

Abbildung 2.5.). NORDIN & STEIN (1980) beschreiben lediglich zwei Arten der Gattung

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

Nodularia

N. harveyana

und

N. spumigena

. Durch ultrastrukturelle Merkmale, wie Gasvesikel,

Konsistenz der Gallert-scheide und die Anzahl der Thylakoide, konnten jedoch weitere Spezies,

wie die in der Ostsee vertretene

N. baltica

und

N. litorea

unterschieden werden (KOMÁREK et

al. 1993, LAMPERT & SOMMER 1999).

Abbildung 2.6. Taxonomische Einordnung der Organismen am Beispiel von

Nodularia spumigena

und

Anabaena oscillarioides

. Abbildung erfolgt in Annäherung an CAMPBELL (1997).

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

2.2. Cyanobakterielle Sekundärmetabolite aus Nährlösungen

Chemisch gesehen gehören Sekundärmetabolite aus Cyanobakterien in unterschiedlichste

Stoffklassen: unter anderem -Lactone (MASON et al. 1982, PATTERSON et al. 1994),

cyclische Oligosaccharide (ENTZEROTH et al. 1986), Lipopolysaccharide (BOHLMANN et al.

1964, SATO & MURATA 1982, POHL 1982, KAEBERNICK & NEILAN 2001), Fettsäure-Derivate

(CARDELLINA & MOORE 1980, MOORE et al. 1996, JÜTTNER & WU 2000), polychlorierte

Aromaten (FALCH et al. 1993), cyclische Peptide, Alkaloide (BECKER 1994), darunter Indol-

Alkaloide (PARK et al. 1992, MOORE 1984) und Isonitril-Alkaloide (SMITKA et al. 1992),

Pyrrolidin-Diine (HAGMANN & JÜTTNER 1996; PAPKE et al. 1997) und Amide (AINSLIE et al.

1985, GERWICK et al. 1987). Hier sollen vor allem cyanobakterielle Exopolysaccaride (2.2.1.),

Fett- und Aminosäuren (2.2.2.) sowie Toxine (2.2.3.) näher betrachtet werden.

2.2.1. Exopolysaccharide

Seit langem ist bekannt, dass Cyanobakterien große Mengen an Polysacchariden bilden können

(DREWS & WECKESSER 1982). Wie schon in den vorherigen Kapiteln erwähnt, dienen diese

Polysaccharide den Cyanobakterien zu verschiedenen Zwecken. Sie spielen eine große Rolle in

der Koloniebildung und Fortbewegungsmöglichkeit durch Gleiten. Des Weiteren sind sie beteiligt

an symbiotischen Prozessen, der Anpassung an verschiedene Lebensräume und den

Überlebensstrategien bei Austrocknung (BERTOCCHI et al. 1990, MORVAN et al. 1997,

PAINTER 1993, DE PHILIPPIS & VINCENZINI 1989). Viele Cyanobakterien sind von einer

schleimigen Schicht umgeben, welche als Kapsel, Scheide, Schleim oder Glycocalyx

ausgebildet wird. Dieses extrazelluläre Material besteht hauptsächlich aus so genannten

Exopolysacchariden. Man kann drei Typen von Exopolysacchariden unterscheiden (SAMY et al.

1999, LI et al. 2001):

· Die Scheide, eine dünne einheitlich strukturierte Schicht, die direkt auf der äußeren

Zellmembran aufliegt und die aus konzentrischen oder radialen Fibrillen besteht.

· Die Kapsel (CPS = capsular polysaccharid), eine unstrukturierte Zone, die aber noch eng

mit der Zelloberfläche verbunden ist.

· Der Schleim (RPS = released polysaccharide), der entweder nur locker mit der Zelle

assoziiert ist oder vereinzelt im Nährmedium vorliegt.

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

Die Extraktion der Scheide wird mittels Dichtezentrifugation, nach Homogenisierung der Zellen,

im Saccharosegradienten vorgenommen (BERTOCCHI et al. 1990). Die CPS erhält man durch

eine Behandlung des Zellpellets mit warmen Wasser, Puffer oder Natriumchlorid-Lösung

(NAKAGAWA et al. 1987, VINCENZINI et al. 1990, PLUDE et al. 1991). RPS können durch

Ethanolfällung des biomassefreien Nährmediums gewonnen werden. Die meisten Studien

beschäftigen sich entweder mit den CPS oder den RPS, da diese leichter zu isolieren sind und

in wesentlich größeren Mengen vorhanden sind.

Im Allgemeinen ist zwischen den CPS und den RPS eines Cyanobakteriums kein signifikanter

Unterschied in der Monosaccharidzusammensetzung zu beobachten. Dies wurde durch mehrere

Arbeiten zu verschiedenen Cyanobakterienspezies wie

Anabaena flos-aquae

Palmella mucosa

oder

Cyanospira capsulta

belegt (MOORE & TISCHER 1964, VINCENZINI 1990, NICOLAUS et

al. 1999). Manche Arbeiten zeigten, dass für CPS und RPS die gleichen Monosaccharid-

bestandteile vorkamen, wenn auch in verschiedener quantitativer Verteilung (GLOAGUEN et al.

1995a). Aufgrund der geringen Unterschiede zwischen CPS und RPS kann angenommen

werden, dass es sich bei RPS nur um von der Zelloberfläche abgelöste CPS handelt, darum

werden im Weiteren beide unter dem Begriff Exopolysaccharide (EPS) zusammengefasst.

Glucuron- und/oder Galacturonsäure sind in fast allen bisher untersuchten EPS vorhanden. Das

EPS von

Microcystis wesenbergii

besteht nur aus Uronsäuren (FORNI et al. 1997). In allen

anderen EPS konnten zusätzlich bis zu neun verschiedene Neutralzucker nachgewiesen

werden. Normalerweise ist Glucose das Hauptmonosaccharid, aber auch Uronsäure, Xylose,

Arabinose, Fucose, Rhamnose und Mannose können in großen Mengen vorhanden sein.

Galactose wurde bisher nur in den EPS von

Anabaena sphaerica

als dominanter Zucker

nachgewiesen. Weitere Bestandteile von EPS können Ribose, Osamine oder Methylzucker sein.

Charakteristische Gruppen sind Pyruvat und Acetat. Es ist bemerkenswert, dass einige EPS

ebenfalls Sulfat-Gruppen besitzen, von denen angenommen wurde, sie könnten nur von

Eukaryonten produziert werden (SUTHERLAND 1994).

Weiterhin wurde in fast allen EPS Proteinanteile gefunden. Bisher konnte noch kein

Zusammenhang zwischen der systematischen Einteilung der Cyanobakterien und den von ihnen

abgegebenen Polysacchariden gefunden werden. Die meisten bisher vorliegenden Studien

befassen sich nur mit der Zuckerzusammensetzung der Polysaccharide, strukturelle Daten

liegen kaum vor. Dies liegt vor allem an der hohen strukturellen Komplexität der

Cyanobakterienpolysaccharide. Es ist noch fraglich, ob sie überhaupt eine regelmäßige Struktur

besitzen oder nach dem Zufallsprinzip zusammengesetzt werden. Strukturelle Untersuchungen

von EPS aus

Cyanospira capsulata

konnten eine sich wiederholende Sequenz von acht oder

zehn verzweigten Monosacchariden nachweisen (MARRA et al.1990). Für die Struktur des EPS

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

von

Nostoc commune

wurde eine 1,4-verknüpfte Xylose-Galaktose-Hauptkette mit Ribofuranose

und 3-O-[-(R)-1-carboxyethyl-]-D-Glucuronsäure als Seitenketten vorgeschlagen (HELM et al.

2000). Für die Hauptfraktion des EPS von

Aphanocapsa halophytica

wurde eine Hauptkette aus

Glucose, Arabinose, Fucose, Mannose und Glucuronsäure mit Verzweigungspunkten an der

Mannose nachgewiesen; als Seitenketten werden Glucose und Glucuronsäure angenommen (LI

et al. 2001). Für das EPS von

Mastigocladus laminosus

wurde eine sich wiederholende

Sequenz von 15 Monosacchariden vorgeschlagen (GLOAGUEN et al.1995b, 1997, 1999).

2.2.2. Fett- und Aminosäuren

Lipide und essentielle Fettsäuren werden von einigen Vertretern der Cyanobakterien in großer

Menge gebildet (SKULBERG 2000). Sie können daher sowohl zur Nahrungsergänzung einge-

setzt werden, wie zum Beispiel

Spirulina

sp. (RICHMOND 1988), als auch der gezielten

Gewinnung von ungesättigten Fettsäuren dienen.

Mikroalgen und Cyanobakterien enthalten sowohl gesättigte als auch ungesättigte Fettsäuren,

die zum größten Teil als Triglyceride, Phospholipide und Glycolipide gebunden vorliegen. Sie

dienen den Organismen einerseits als Energiequelle und als Lieferant verschiedener

Metaboliten, andererseits sind sie Bestandteile der Biomembranen. Freie Fettsäuren kommen

nur selten vor. Die häufigsten gesättigten Fettsäuren in Cyanobakterien sind die geradzahligen

12:0

- bis C

18:0

-Fettsäuren. Ungesättigte Fettsäuren werden meistens in größerer Vielfalt

produziert, so reicht die Kettenlänge von C

bis C

und die Anzahl der Doppelbindungen von 1

bis 4 (SKULBERG 2000). Diese sind besonders interessant für den medizinisch-pharmazeu-

tischen Bereich, vor allem die ungesättigten Fettsäuren Linolsäure und -Linolensäure (COHEN

et al. 1992, 1993). In Kulturen von

Nodularia spumigena

konnten beide Linolsäureformen, und

, nachgewiesen werden, wobei die -Form nur in Spuren vorhanden war. Des Weiteren konnte

ein relativ hoher Anteil an Palmitinsäure verzeichnet werden (VENZKE 2005).

Eine weitere verwendungsrelevante Inhaltsstoffklasse von Mikroalgen sind Proteine bzw.

Aminosäuren. Die Aminosäurezusammensetzung variiert zwischen den Arten und hängt

außerdem von den Kulturbedingungen und dem Alter der Kultur ab (BECKER & VENKATARA-

MANN 1982, SIEGEL & BRÜCKNER 1998). Die beiden Hauptaminosäuren in den Proteinen von

Mikroalgen sind Glutamin- und Asparaginsäure; weitere häufig vorkommende Aminosäuren sind

Lysin, Tryptophan, Alanin und Phenylalanin, dagegen sind die schwefelhaltigen Vertreter Cystein

und Methionin meist in nur geringen Mengen vorhanden oder fehlen ganz (BOROWITZKA 1988).

Auch ist es möglich aus Cyanobakterien Vitamine, vor allem Vitamin B

und B

, zu gewinnen

(BOROWITZKA 1995). Als weitere interessante Inhaltsstoffe findet man Sterole und Terpene

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

(WU & JÜTTNER 1988), vor allem Cholesterolderivate (KOHLHASE & POHL 1988) sowie

Carotinoide (AHMAND & WEEDON 1953a, 1953b) und Polysaccharide (FISCHER 1996), die

als Geliermittel in der Lebensmitteltechnologie eingesetzt werden können.

2.2.3 Cyanobakterielle Toxine

Toxische cyanobakterielle Wasserblüten sind weltweit anzutreffen, sie können in Seen, Flüssen

und Küstengewässern vorkommen. Ihr Auftreten zeigt meistens eine schlechte Wasserqualität

an, denn Cyanobakterien vermehren sich am besten in überdüngten, stickstoffreichen

Gewässern (SIVONEN & JONES 1999). Wasserblüten sind gefürchtet wegen der toxischen

Verbindungen, die von den Cyanobakterien freigesetzt werden können. Ihre Auswirkung auf

Mensch und Tier können neurotoxischer, hepatotoxischer, cytotoxischer oder anderer Natur sein

(CARMICHAEL et al. 1990, CARMICHAEL 1997, CRAWFORD & SWOBODA 2000). Im Zuge

der Untersuchungen der toxischen Substanzen, die bei einer Wasserblüte freigesetzt werden,

konnten eine Reihe von Sekundärmetaboliten mit interessanten chemischen und biologischen

Eigenschaften nachgewiesen werden. Strukturell gehören die cyanobakteriellen Toxine drei

unterschiedlichen Stoffklassen an: den cyclischen Peptiden, den Alkaloiden und den

Lipopolysacchariden (LPS) (CODD et al. 1999). Alkaloide können neurotoxisch, cytotoxisch,

sowie dermatotoxisch wirken oder die Proteinsynthese hemmen. Lipopolysaccharide wirken

reizend, ihr genauer Wirkmechanismus ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt (BOYER et

al. 1984).

Abb. 2.7. Struktur von Nodularin-R

. Mdhb steht für 2-(Methylamino)-2-dehydrobuttersäure und Adda für

(2S, 3S, 8S, 9S)-3-Amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4E,6E-diensäure.

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

Zu den wichtigsten Neurotoxinen gehören die Alkaloide Anatoxin-a, Anatoxin-a(s) und die

Saxitoxine, die im englischsprachigen Raum auch Paralytic Shellfish Poisons (PSPs) genannt

werden (NAMIKOSHI et al. 1989, 1994). Zu den cyclischen Hepatotoxinen gehören cyclische

Pentapeptide (Nodularine) und Heptapeptide (Microcystine). Nodularine werden vorwiegend von

Nodularia spumigena

hergestellt, einer Spezies, die auch in Meerwasserhabitaten vorkommt.

Die chemische Struktur von Nodularin-R ist in der Abbildung 2.7. dargestellt und lautet cyclo-

(DMeAsp1-L-Arg2-Adda3-D-Glu4-Mdhb5), wobei D-MeAsp für D-

erythro

-ß-Methylasparagin-

säure und Mdhb für 2-(Methylamino)-2-dehydrobuttersäure steht (BRUUN et al. 1951). Wie

Microcystine besitzen Nodularine die charakteristische ß-Aminosäure Adda ((2S, 3S, 8S, 9S)-3-

Amino-9-methoxy-2, 6, 8-trimethyl-10-phenyldeca-4E, 6E-diensäure) (RINEHART et al. 1988,

CUNDY et al.1998).

Es existieren nur wenige Strukturvarianten von Nodularin. Diese unterscheiden sich durch

Methylierung, Demethylierung oder in der Konfiguration der Doppelbindung der Adda-Seiten-

kette von Nodularin-R. Eine weitere Strukturvariante enthält statt der polaren L-Aminosäure

Arginin (R) die hydrophobe Aminosäure L-Valin (V) in Position 2. Nodularin-V, auch Motuporin

genannt, wurde in einem Meeresschwamm (

Theonella swinhoei

) gefunden (DE SILVA et al.

1992). Da dieser Meeresschwamm in Symbose mit Cyanobakterien existiert, ist es wahr-

scheinlich, dass auch Motuporin cyanobakteriellen Ursprungs ist. Die Kristallstruktur der

cyclischen Hepatotoxine als Komplex mit dem Rezeptor und die Struktur in Lösung wurden

mittels Röntgenbeugung bzw. NMR bestimmt. In Lösung nimmt sowohl Microcystin als auch

Nodularin eine starre Wannenkonformation ein. Einzig die Seitenketten von Adda und Arginin

besitzen eine höhere Flexibilität (HARADA 1996). Diese Seitenketten stehen im Mittel fast

senkrecht zueinander (vgl. Abbildung 2.8.).

Microcystine und Nodularine sind relativ stabile chemische Verbindungen (HARADA et al. 1996).

Bei neutralem pH- Wert, Raumtemperatur und Dunkelheit sind sie über Monate stabil. Die

reaktiveren Teilstruk-turen dieser Substanzen sind einerseits die konjugierte Doppelbindung der

Adda-Seitenkette und andererseits die Enamid-Struktur der Aminosäure 7 (

-Methyldehydro-

alanin). Da die Adda-Seitenkette eine wichtige Rolle bei der Erkennung durch die Rezeptoren

(Proteinphosphatasen) ausübt, führen Änderungen der Konformation oder Struktur meist zu

einer Verminderung der Toxizität. Oxidative Prozesse und UV-Strahlung greifen die konjugierte

Doppelbindung der Adda-Seitenkette an (HUMPHREY et al. 1996). Diese Prozesse werden in

der Trinkwasseraufbereitung häufig eingesetzt und sind eingehend untersucht worden. Als

Oxidationsmittel wurden Chlor, Natriumhypochlorid, Calciumhypochlorid, Wasserstoffperoxid,

Kaliumpermanganat und Ozon eingesetzt (NICHOLSON et al. 1994, TSUJI et al. 1997). Ozon

hat die höchste Effektivität in der Zerstörung von gelösten Microcystinen und Nodularinen

Stand des Wissens

_________________________________________________________________________

(ROSITANO et al. 1998). UV-Strahlung im Bereich des Absorptionsmaximums und Photo-

katalyse mit Titandioxid haben zwei photochemische Reaktionen zur Folge. Einerseits werden

die Doppelbindungen isomerisiert, andererseits wird eine [2+2]-Cycloaddition zwischen dem

Phenylring und einer Adda-Doppelbindung beobachtet (KENDE & SMITH 1988, KAYA & SANO

1998).

Abb. 2.8. Struktur von Microcystin-LR , Röntgenstruktur (Brookhaven-Datenbank).

Die Änderung der all-trans-Konformation der Adda- Doppelbindung durch UV-Strahlung führt zu

einer drastischen Verminderung der Toxizität. Allerdings wird durch diese Reaktion ein Gleich-

gewichtszustand zwischen Z- und E-Konformation erreicht, der dazu führt, dass ein voll-

ständiges Abreagieren zu einer untoxischen Variante unmöglich wird. Die enzymatische

Hydrolyse der Microcystine und Nodularine wird nur selten beobachtet (LATHI et al. 1997). Dies

liegt einerseits an der cyclischen Struktur der Peptide und damit dem Fehlen von N- oder C-

terminalen Amino-säuren und andererseits an dem Vorhandensein von fünf bzw. vier nicht

proteinogenen Amino-säuren. Microcystine und Nodularine werden deshalb von den üblichen

Proteasen, wie z. B. Trypsin, nicht hydrolysiert. HERESZTYN und NICHOLSON (1997), SHEP-

HARD (1998), JONES et al. (1999) sowie IKAWA et al. (2001) konnten zeigen, dass Nodularin

in Gewässern, in denen es häufiger zu cyanobakteriellen Blüten kommt, schneller abgebaut wird

als in solchen, in denen selten Blüten auftreten. Da der Prozess von Kupfersulfat inhibiert

wurde, folgerten sie einen bakteriellen Abbau. Dieses Ergebnis würde bedeuten, dass im Falle

einer Gewässerbehandlung mit Kupfersulfat nicht nur mehr Toxine durch Absterben der

Cyanobakterien freigesetzt werden, sondern auch der bakterielle Abbau inhibiert würde.

Problemstellung

_________________________________________________________________________________

3 Problemstellung

Massenentwicklungen von Cyanobakterien, so genannte ,,Wasserblüten" (NAUMANN

1922),

wurden in der Vergangenheit sowohl im unmittelbaren Bereich der Küste von Nord- und Ostsee

als auch in vielen kommunalen Badegewässern Nordwestdeutschlands während der Sommer-

monate beobachtet. Die Cyanobakterie Nodularia spumigena gehört zu den Toxinprodu-

zierenden ,,blütenbildenden" Spezies und konnte in einem Monitoring im Rahmen eines am

Forschungszentrum T

ERRAMARE

durchgeführten Forschungsprojektes in den Jahren 2000,

2003, 2004 und 2005 jeweils zu Beginn der Badesaison im Wilhelmshavener ,,Banter See"

erfasst werden. Die Produktion des Hepatotoxins Nodularin führte in den genannten Jahren zu

einer Sperrung dieses oligotrophen Naherholungsgewässers. Gleichzeitig konnte eine Verrin-

gerung der Abundanz anderer Cyanobakterien- und Mikroalgenspezies beobachtet werden

(LIEBEZEIT & SCHOLZ 2005). Ein erstes chemisches Screening eines Seewasserfiltrats,

angereichert aus Planktonmischproben des Banter Sees (

), ergab schwach positive Reak-

tionen bei den Stoffgruppen der Alkaloide und Flavonoide. Weiterhin konnte eine relative

Toxizität von 86,9% im LUMIStox-Test nachgewiesen werden. Im Rahmen der vorliegenden

Arbeit sollen mögliche Effekte der Kulturlösungen von Nodularia spumigena auf andere

Mikroorganismen wie Mikroalgen, Cyanobakterien, Bakterien und Pilze untersucht werden, die

im Vorfeld der Untersuchung aus dem Banter See isoliert wurden (SCHOLZ & LIEBEZEIT a und

b, eingereicht). Mögliche Effekte einiger variierter abiotischer Faktoren, wie Temperatur und

Lichtintensitäten, auf die Substanzsynthese bzw. exkretion sollten hierbei mit einbezogen

werden. Durch Einsatz instrumenteller Analytikmethoden, wie DC, GC, GC/MS und HPLC,

sollen dann Einblicke in das Gesamtspektrum der in die Nährlösungen ausgeschiedenen

Substanzen gewonnen werden und soweit möglich zu einer Identifizierung der wirksamen

allelopathischen Verbindung/Verbindungen führen. Folgende Zielsetzungen lassen sich zusam-

menfassen:

Anzucht der Cyanobakterienspezies N. spumigena unter variierten Kulturbedingungen.

Suche nach determinierten Substanzklassen in einem chemischen Screening.

Prüfung der biologischen Aktivität, unter Berücksichtigung der Fragestellung nach

Effekten der synthetisierten Substanzen auf unterschiedliche Mikroorganismen aus dem

Brackwasserhabitat ,,Banter See". Darüber hinaus Test der cytotoxischen Aktivität.

,,Fingerprint" und Vergleich der unterschiedlichen Ansätze hinsichtlich der produzierten

Substanzen mittels DC, HPLC und GC. Strukturaufklärung mittels Einsatz von GC/MS.

Unveröffentlichter Bericht an das Umweltbundesamt der Stadt Wilhelmshaven.

Material und Methoden

_________________________________________________________________________________

4 Material und Methoden

4.1.

Nodularia spumigena

Die Stammkultur von

Nodularia

spumigena

wurde vom Leibnitz-Institut für Ostseeforschung

Warnemünde zur Verfügung gestellt, da alle Versuche, diese Spezies aus dem Banter See zu

kultivieren, fehlschlugen. Für die Kultivierung von

N. spumigena

wurde eine modifizierte f/2-

Nährlösung nach GUILLARD & RYTHER (1962) verwendet (Tab. 4.1.). Zur Herstellung von

einem Liter Medium wurde zu 997 ml Wasser je 1 mL der Stammlösungen A, B und C

zugegeben. Die Zusammensetzung der Lösungen B und C sind den Tabellen 4.2. bzw. 4.3. zu

entnehmen. Eine für die Kultivierung dieser Spezies notwendige Salinität von 10 wurde durch

Verdünnung von Meerwasser mit VE-Wasser in einem Verhältnis von 3:7 erreicht.

Stammlösung

Menge [ml/L]

Bestandteil

Konz. Stammlösung

NaH

* 2H

75 g/ 1000 mL

Spurenelement-Lösung

siehe Tab. 2.3

Vitamin-Stammlösung

siehe Tab. 2.4.

Tab. 4.1. f/2-Nährlösung (modifiziert nach GUILLARD & RYTHER 1962).

Stammlösung

Konzentration [g/ 1000 mL]

EDTA

4,360

FeCl

* 6H

3,15

CuSO

* 5H

0,01

ZnSO

* 7H

0,022

CoCl

* 6H

0,01

MnCl

* 4H

0,18

1 mL

NaMoO

* 2H

0,006

Tabelle 4.2. Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung für das f/2-Medium (Lösung B).

Material und Methoden

_________________________________________________________________________________

Stammlösung

Konzentration [g/ 1000 mL]

Vitamin B

0,0005

Biotin

0,0005

1 mL

Thiamine HCl

0,1

Tabelle 4.3. f/2 Vitamin-Stammlösung (Lösung C).

Das Nährmedium, bestehend aus Lösung A sowie dem VE/Seewasser mit einer Salinität von

10 , wurde 20 min bei 121 °C autoklaviert. Nach Abkühlen erfolgte die Zugabe der Lösungen

B und C. Steril verschlossen und bei 4 °C gelagert war das Medium über einen längeren Zeit-

raum haltbar.

4.1.1. Stammhaltung und Vorkultivierung von

N. spumigena

Aus Stammkulturen entnommene

Nodularia spumigena

wurde für die spätere Anzucht zur

Biomassegewinnung vorkultiviert. Die Vorkultivierung (vgl. Abbildung 4.1.) erfolgte steril bei

18 ± 2 °C in 100 mL Erlenmeyerkolben mit 50 mL Nährmedium auf einem Schüttelinkubator

(115 rpm). Die Lichtstärke betrug durchschnittlich 80 + 10 µE PAR m

-2

-1

bei einer täglichen

Beleuchtungsdauer von 15 h. In etwa 1-2 Wochen waren die Kulturen hochgewachsen.

Abbildung 4.1. Vorkulturen und Stammhaltung von

N. Spumigena

Material und Methoden

_________________________________________________________________________________

4.1.2. Up scale und Versuchsbedingungen

Für das up scale wurden jeweils 100 mL der Vorkulturen von

Nodularia spumigena

in 2000 mL

Erlenmeyerkolben, gefüllt mit 900 mL Nährmedium, überführt. Belichtet wurde mit durchschnitt-

lich 80 + 10 µE PAR m

-2

-1

aus einer Warmlichtröhre (Osram L36 W/76-1 Natura de Luxe,

Germany), die waagrecht in einem Abstand von 4,5 cm vor den Kulturen angebracht war. Nach

2-3 Wochen wurde die Biomasse geerntet. Die Züchtung zur Biomassegewinnung erfolgte für

die Standardkultur (Ansatz IV) unter keimarmen Bedingungen in 6 LiterBatchkulturen unter

Belichtung (80 + 10 µE PAR m

-2

-1

), ständiger Belüftung bis zum Erreichen der stationären

Wachstumsphase bzw. Absterbephase. Die Temperierung der Kulturen erfolgte in einem

klimatisierten Raum bei 18 + 2 °C. Der Wachstumsverlauf wurde mit Hilfe mikroskopischer

Zählungen der Kultursuspensionsdichte verfolgt. Für die vorliegende Diplomarbeit wurde die

Auswirkung unterschiedlicher abiotischer Faktoren auf die Substanzproduktion untersucht.

Hierbei wurde

Nodularia spumigena

in drei Versuchsreihen unter veränderten Parametern

kultiviert (Versuche I-III, vgl. Tab. 4.4.).

Versuchsreihe

bzw. Ansatz

veränderter Faktor

Versuchsbedingungen

Temperatur

80 µE m

-2

-1

; T = 30

Licht/Temperatur

30 µE m

-2

-1

; T = 4

III

Licht

30 µE m

-2

-1

; T = 18

Phytoplankton Mischprobe

Standard

80 µE m

-2

-1

; T = 18

Tabelle 4.4. Übersicht der Versuchsreihen, sowie deren variierten Bedingungen.

4.1.3. Beprobung der 6 L-Batchkulturen

Die Beprobung der Versuchsreihen erfolgte in Abständen von 48-72 h, indem der Belüftungs-

schlauch entfernt und je 20 mL der Kulturlösung in sterile Kulturröhrchen überführt wurde. Ca.

1500 mL wurden zusätzlich für die weitere Aufarbeitung der Standardkultur entnommen und, wie

in den Kapiteln 4.1.5. und 4.1.6. beschrieben, behandelt. Das Probevolumen wurde anschlies-

send durch Zugabe von sterilem Kulturmedium wieder aufgefüllt.

Material und Methoden

_________________________________________________________________________________

Eine erste Auswertung der Proben erfolgte durch Zellzählung und führte zur Determination der

jeweiligen Wachstumsphase, in der die Standard- sowie die Versuchskulturen sich befanden.

Auf diese Weise konnten insgesamt fünf Proben (N0, N1, N2, N3, N4 und N5) aus der

Standardkultur gewonnen werden, die jede für sich eine Wachstumsphase repräsentierte und im

weiteren Verlauf analysiert werden sollte (vgl. Abbildung 4.2.). Dagegen wurde je 20 mL Probe

aus den Versuchsreihen I, II und III lediglich zu Auszählungszwecken verwendet und nach

Beendigung der Kultivierung das Kulturvolumen als Gesamtprobe behandelt (vgl. Tabelle 4.5.).

Weiterhin erfolgte im Verlauf der Untersuchung zu Vergleichszwecken die Aufarbeitung einer

Planktonmischprobe des Banter Sees (Ansatz IV).

Abbildung 4.2. Wachstumskurve der Cyanobakterie

Nodularia spumigena

in 1000 mL-Batchkultur unter

Standardkulturbedingungen (Vorkultur). Die Pfeile weisen auf den Zeitpunkt der jeweiligen Probenahme

hin.

4.1.4. Auswertung der Zellzählungen (nach Uthermöhl 1958)

Jeweils drei Unterproben von 5 mL Volumen wurden zur Zellzahlbestimmung in einer Utermöhl-

Zählkammer angereichert mit, 10 µL Lugol´scher Lösung fixiert und nach einer Sedimentations-

zeit von mindestens 12 h mit einem Umkehrmikroskop quantitativ ausgewertet. Dazu wurden

jeweils 50 Quadrate ausgezählt. Die mittlere Standardabweichung betrug 12 %.

Wachstumskurve von

Nodularia spumigena

unter normalen Kulturbedingungen

t [h]

200

400

600

800

1000

Zellen pro mL

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

22000

Material und Methoden

_________________________________________________________________________________

Die Anzahl der Individuen pro Liter Seewasser = ZN

wurden über die Auszählergebnisse der

mikroskopischen Untersuchungen wie folgt berechnet (Gleichung 4.1. sowie 4.2.):

Gleichung 4.1.

1000

Gleichung 4.2.

= Individuen pro Liter Seewasser

N = Individuen pro Milliliter in der aufkonzentrierten Probe

KF = Faktor der Aufkonzentration der Probe = V

Probe

/ V

Konzentrat

Z =

gezählte Individuen (auf 50 Rasterquadrate bezogen)

F =

Grundfläche der Utermöhl-Zählkammer = 506,71 mm

A =

Flächeninhalt der gezählten Rasterquadrate (bei 400x Vergrößerung) = 5,28125 mm

V =

eingesetztes Probevolumen = 5 ml

Für die grafische Auswertung in Kapitel 5.1. erfolgte allerdings lediglich die Angabe von Zellen pro

mL, da hierbei eine Hochrechnung der Ergebnisse auf Zellen pro Liter nicht notwendig war.

4.1.5. Ernte der Kulturlösungen von

N. spumigena

Durch zwei Filtrationsschritte erfolgte die Trennung der Biomassen von den Nährmedien. Zuerst

erfolgte eine erste Separation der fädigen Cyanobakterien von dem Nährmedium unter

Verwendung eines Planktonnetzes (Fa. H

YDRO

-B

IOS

, Kiel)

mit einer Maschenweite von zehn

Mikrometer. Im Folgenden wurden die Proben in einer Unterdruckfiltrationskammer über einen

Glasfaser Mikrofilter (Whatman No 1822047, D 47 mm) von der restlichen Biomasse befreit. Die

abgefilterte Biomasse wurde nach Abzentrifugation des Restmediums für die Frischgewichts-

bestimmung gewogen. Anschließend wurden die Biomassen gefriergetrocknet (Gefriertrock-

nungsanlageLyovac GT2, Finn Aqua, Santasalo-Sohlberg GmbH) und bei 18 °C aufbewahrt,

während die Nährlösungen aufgeteilt, im Rotationsverdampfer bei 40

C und einem Druck von

ca. 70 mbar eingeengt, gefriergetrocknet, gewogen und schließlich bis zur weiteren

Aufarbeitung bei 18 °C gelagert wurden. In Kapitel 9.4. befindet sich eine Übersicht der jeweils

in den unterschiedlichen Extraktionen eingesetzten Nährlösungsvolumina. Die im weiteren

Material und Methoden

_________________________________________________________________________________

Verlauf bearbeiteten Proben sowie deren genauen Bezeichnungen sind in Tabelle 4.5.

aufgeführt.

Probe

Versuch bzw. Ansätze

Probe N0

Beprobung der Standardkultur (Ansatz IV; 80 µE m

-2

-1

;

T = 18

C) zum Zeitpunkt t = 0 h

Probe N1

Lag-Phase

Probe N2

Beginn der exponentiellen Wachstumsphase

Probe N3

Ende der exponentiellen Wachstumsphase

Probe N4

Stationäre Phase

Probe N5

Absterbe Phase

Probe NI

Gesamtprobe: T = 30

C; 80 µE s

-1

-2

Probe NII

Gesamtprobe: T = 4

C; 30 µE s

-1

-2

Probe NIII

Gesamtprobe: T = 18

C; 30 µE s

-1

-2

Probe NIV

Planktonmischprobe: Banter See

Tabelle 4.5. Übersicht der Proben.

4.1.6. Aufarbeitung der Nährlösungen

4.1.6.1. Extraktion mit Methanol (nach FRANZ & KÖHLER 1992)

Vor Beginn der Extraktion wurden alle benötigten Utensilien jeweils dreimal mit n-Hexan und

Dichlormethan (DCM) gespült. Der getrocknete Rückstand aus je ca. 250 bzw. 500 mL (vgl.

Kapitel 9.4.) Nährlösung wurde nach dem Zerreiben in einer Reibschale in ein 200 mL

Becherglas gegeben, mit 70 mL Methanol 96 % versetzt und mittels Magnetkern und

Magnetrührer durchmischt. Anschließend wurde die Suspension 10 min lang gerührt, danach

bei 5000 x g 10 min lang abzentrifugiert (Heraeus Labofuge GL) und der Überstand in einen

250 mL Erlenmeyerkolben abdekantiert. Der Rückstand wurde noch zweimal mit jeweils 70 mL

Methanol 96 % 10 min im Ultraschallbad extrahiert. Die Lösungen wurden jeweils in

entsprechende Rundkolben filtriert (Glasfaser Mikrofilter Fa. Whatman, D 47 mm) und bei 40

am Rotationsverdampfer auf ca. 1 mL eingeengt. Anschließend in Präparategläschen überführt

und in einem evakuierten Exsiccator getrocknet. Tabelle 4.6. gibt eine Übersicht der durch

Anwendung dieser Methode gewonnen Extrakte.

Details

Seiten
Erscheinungsform: Originalausgabe
Jahr: 2006
ISBN (eBook): 9783832495770
ISBN (Paperback): 9783838695778
DOI: 10.3239/9783832495770
Dateigröße: 1.7 MB
Sprache: Deutsch
Institution / Hochschule: Fachhochschule Oldenburg/Ostfriesland/Wilhelmshaven; Standort Wilhelmshaven – Technik, Abteilung Naturwissenschaftliche Technik
Erscheinungsdatum: 2006 (Mai)
Note: 1,5
Schlagworte: sc/ms algenkultivierung dünnschichtchromatographie säulenchromatographie bioassay

Autor

Bettina Scholz (Autor:in)

Screening und Identifizierung allelopathischer Substanzen aus Nährlösungen der Cyanobakterie Nodularia spumigena

Zusammenfassung

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

Details

Autor

Bettina Scholz (Autor:in)