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Bestimmung von androgenen und antiandrogenen Substanzen in wässrigen Umweltproben mit biologischen und chemischen Methoden

Diplomarbeit 1999 99 Seiten

Chemie - Analytische Chemie

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

Vorwort

Abkürzungsverzeichnis

Zusammenfassung

1 Einleitung

2 Theoretischer Teil
2.1 Substanzen mit hormonartiger Wirkung
2.1.1 Androgene Substanzen
2.1.2 Antiandrogene Substanzen
2.1.3 Östrogene und Gestagene
2.2 Weitere Substanzen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden
2.2.1 Triphenylmethanderivate
2.2.2 a-Hexylzimtaldehyd
2.2.3 Tris(2-chlorethyl)-phosphat (TCEP)
2.2.4 Cortisol (Hydrocortison)
2.2.5 b-Sitosterol
2.3 Untersuchung auf (anti-)androgene Substanzen
2.3.1 Probenvorbereitung
2.3.2 Biologisches Screening
2.3.3 Chemische Spurenanalytik

3 Experimenteller Teil
3.1 Aufgabenstellung
3.2 Herstellung der verwendeten Lösungen
3.3 Biologische Analytik
3.3.1 Verschiedene allgemeine Methoden
3.3.2 Übertragung der Methode von Szelei et al. auf die hiesigen Laborbedingungen
3.3.3 Bestimmung der Abweichung innerhalb einer Zellkulturplatte
3.3.4 Übertragung auf 96-Well-Zellkulturplatten
3.3.5 Vergleich von Zellkulturplatten verschiedener Hersteller
3.3.6 Vergleich verschiedener Detektionsmethoden
3.3.7 Optimierung der Zellzahl und des Gehaltes an FBS im Kulturmedium
3.3.8 Vergleich zwischen Transferrin und Holo-Transferrin
3.3.9 Einfluss der Inkubationsdauer
3.3.10 Abweichung der Methode
3.3.11 Einfluss von Lösungsmitteln
3.3.12 Test verschiedener bekannter Antiandrogene
3.3.13 Konzentrations-Wirkungs-Kurve von Bicalutamid
3.3.14 Probenvorbereitung für wässrige Umweltproben
3.3.15 Zusammenfassung der Methode
3.3.16 Untersuchung von Einzelsubstanzen
3.3.17 Untersuchung von Umweltproben
3.4 Chemische Analytik
3.4.1 Entwicklung der GC/MS-Methode
3.4.2 Linearität
3.4.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze
3.4.4 Probenvorbereitung für Umweltproben
3.4.5 Wiederfindung
3.4.6 Zusammenfassung der Methode
3.4.7 Untersuchung von Umweltproben

4 Diskussion

5 Anhang
5.1 Massenspektren und Chromatogramme
5.1.1 5a-Androstane-3a,17b-diol
5.1.2 Androsteron
5.1.3 Etiocholan-3a-ol-17-on
5.1.4 Epiandrosteron
5.1.5 5a-Dihydrotestosteron
5.1.6 Testosteron
5.1.7 4-Androsten-3,17-dion
5.1.8 Methyltestosteron
5.1.9 b-Sitosterol
5.2 Verwendete Materialien
5.2.1 Geräte
5.2.2 Chemikalien
5.2.3 Verbrauchsmaterialien

6 Literaturverzeichnis

7 Lebenslauf

Vorwort

Die vorliegende Diplomarbeit wurde in der Zeit vom 15. März 1999 bis zum 15. September 1999 am Institut für Organische Chemie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Arbeitskreis Prof. Hagenmaier, durchgeführt.

Ermöglicht wurde das Anfertigen dieser Arbeit durch Herrn Prof. Hanspaul Hagenmaier, dem mein ganz besonderer Dank gebührt. Er hat mir dieses überaus interessante Thema zur Verfügung gestellt.

Zudem möchte ich mich besonders bei Herrn Dr. Wolfgang Körner für die sehr gute Betreuung der Diplomarbeit, die gute Zusammenarbeit und dafür, dass er sich immer viel Zeit für mich genommen hat, bedanken.

Des Weiteren gebührt ein besonderer Dank Herrn Dr. Kurt Grillenberger, der die Aufgabe des Referenten für die Diplomarbeit übernommen hat. Er brachte viel Interesse für das Themengebiet auf und hat seitens der Fachhochschule für ein unkompliziertes Gelingen der Arbeit gesorgt.

Einen großen Dank hat überdies Herr Dr. Winfried Schuller verdient, der mir immer mit zahlreichen fachlichen Ratschlägen zur Seite stand und stets für aufheiternde Momente sorgte, sowie Ulrike Bolz, die mich bei der chemischen Analytik sehr unterstützt hat.

Allen Mitarbeitern der ersten Etage des Medizinisch-Naturwissenschaftlichen Forschungszentrums möchte ich ebenfalls danken. Sie haben sehr zu einer angenehmen und heiteren Arbeitsatmosphäre und damit auch zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Abschließend danke ich allen Freunden, die mich beim Anfertigen der Diplomarbeit, wahrscheinlich oft ohne es zu wissen, unterstützt haben.

Ich hoffe, dass ich auch weiterhin viel Zeit mit all den netten Leuten verbringen kann, die ich während meiner Zeit in Tübingen kennen gelernt habe.

Hiermit versichere ich, dass diese Diplomarbeit von mir selbstständig und ohne unerlaubte fremde Hilfe durchgeführt wurde.

Tübingen, den 15. September 1999

Stefan Spathelf

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zusammenfassung

Zur Untersuchung von Substanzen und wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial wurde eine biologische Methode unter Verwendung von MCF-7 AR-1 Brustkrebszellen etabliert. Sie ist weitgehend spezifisch und unterliegt nur geringen Einflüssen durch Östrogene, Gestagene und Cortisol. Mit diesem Verfahren wurden die wichtigsten Testosteronmetabolite und verschiedene Substanzen, die bereits in wässrigen Umweltproben gefunden wurden, untersucht. Die Testosteronmetabolite zeigten alle eine gewisse, unterschiedlich ausgeprägte androgene Wirkung. Daneben konnte drei Triphenylmethanderivaten eine antiandrogene Wirkung nachgewiesen werden. Bei den anderen Einzelsubstanzen war keine eindeutige Wirkung feststellbar. Anschließend wurden verschiedene Wasserproben von Flüssen und Kläranlagen untersucht. Sämtliche Proben zeigten mehr oder weniger ausgeprägte androgene oder antiandrogene Effekte oder eine Kombination aus beiden. Eine Systematik war dabei nicht erkennbar.

Daraufhin wurde eine Methode zur chemischen Bestimmung von b-Sitosterol, Testosteron und dessen Metaboliten in obigen Proben entwickelt. Sie beruht auf einer Festphasenextraktion, anschließender Derivatisierung der Steroide zu den Trimethylsilylderivaten und Bestimmung mittels GC/MS. Die Methode eignete sich allerdings nicht zur Untersuchung der stärker verschmutzten Proben. In den auswertbaren Wasserproben konnten die Substanzen Androsteron, 5a-Androstane-3a,17b-diol, 5a-Dihydrotestosteron und b-Sitosterol detektiert werden. Die Konzentrationen der Testosteronmetabolite lagen jeweils bei etwa 300 ng/l (» 1×10-9 mol/l). Die Nachweisgrenzen in den Umweltproben lagen zwischen 5,9 und 34,6 ng/l (20–119 pmol/l).

1 Einleitung

In den letzten Jahren häufen sich Berichte über eine Zunahme von endokrinen Störungen bei Mensch und Tier, die unter anderem auf Substanzen natürlichen und synthetischen Ursprungs mit hormoneller Wirkung zurückgeführt werden. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um Störungen der Geschlechtsdifferenzierung und Reproduktion bei verschiedenen Tieren. Außerdem wird angenommen, dass in diesen Substanzen eine Ursache für die in den letzten Jahrzehnten beobachtete deutliche Zunahme hormonabhängiger Krebserkrankungen in den Industrieländern liegt. Auch über eine durch diese Substanzen ausgelöste Abnahme der Spermienzahl beim Menschen wird spekuliert.

Die Forschung beschränkt sich derzeit weitgehend auf Substanzen mit östrogener Aktivität. So wurden in der Umwelt zahlreiche Substanzen gefunden, die ein östrogenes Potenzial aufweisen und aus unterschiedlichsten Quellen stammen. Dabei handelt es sich um von Mensch und Tier ausgeschiedene natürliche und synthetische Östrogene, Pflanzeninhaltsstoffe sowie Industriechemikalien.

Es ist zu erwarten, dass in der Umwelt nicht nur Östrogene, sondern auch andere endokrin wirksame Substanzen eine relevante Rolle spielen. So wurden in den letzten Jahren einige nichtsteroidale Umweltchemikalien mit antiandrogener Wirkung entdeckt.

Deshalb wird in der vorliegenden Diplomarbeit eine Methode zur In-vitro-Untersuchung von wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial etabliert. Als Basis für diesen Zellkulturtest dient die humane Brustkrebszelllinie MCF-7 AR-1. Mit Hilfe dieser Methode werden verschiedene Einzelsubstanzen und Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial hin untersucht.

Zur Spezifizierung und Quantifizierung von natürlichen Androgenen und deren wichtigsten Metaboliten in wässrigen Umweltproben wird ein Verfahren mittels GC/MS nach vorheriger Silylierung entwickelt und angewandt. [1, 2]

2 Theoretischer Teil

2.1 Substanzen mit hormonartiger Wirkung

2.1.1 Androgene Substanzen

Die einzige Verbindungsklasse mit androgenartiger Wirkung, die man bisher in der Umwelt nachgewiesen hat, sind die Tributylzinnverbindungen. Vom menschlichen und tierischen Organismus werden zahlreiche Androgene produziert, die über die Exkremente in die Umwelt gelangen. Sie wurden allerdings bisher noch nicht in Umweltproben detektiert. Auf die Wichtigsten wird im Folgenden eingegangen.

2.1.1.1 Tributylzinnverbindungen

Tributylzinnverbindungen werden vor allem als Biozide in Unterwasseranstrichen von Schiffen verwendet. Durch Auslaugen der Anstriche gelangen sie in Gewässer. Es besteht bereits ein Verbot dieser Substanzgruppe für Schiffe mit einer Gesamtlänge unter 25 Metern.

Bei zahlreichen Untersuchungen von Binnengewässern auf Tributylzinnverbindungen wurden diese in nahezu allen Proben gefunden.

Tributylzinn ist die einzige nicht-steroidale Substanz mit nachgewiesenem androgenen Potenzial. Neben zahlreichen toxischen Wirkungen induziert es bei weiblichen Vorderkiemer­schnecken die Ausbildung von männlichen Geschlechtsorganen.

Tributylzinn wirkt allerdings nicht wie andere androgene Verbindungen durch Bindung an den Androgenrezeptor. Es wird vermutet, dass Tributylzinn die Cytochrom-P450-abhängige Aromatase hemmt, die dafür verantwortlich ist, dass sich Testosteron zu 17b-Östradiol umsetzt, wodurch sekundär der Testosteronspiegel erhöht wird. [1]

2.1.1.2 Testosteron und Metabolite

Testosteron wird vor allem in den männlichen Keimdrüsen gebildet und stellt das wichtigste Androgen im menschlichen Körper dar. Männer produzieren etwa 7 mg und Frauen etwa 0,3 mg am Tag. Es bewirkt die Ausbildung der sekundären Geschlechtsmerkmale des Mannes und männlicher Tiere. Es fördert die Entwicklung der Muskulatur, des Knochenbaus, der roten Blutkörperchen und das Wachstum von Körperhaaren, Kehlkopf, Stimmbändern, Penis, Prostata und Samenblase. Testosteron ist unerlässlich für die Funktion der akzessorischen Geschlechtsdrüsen, für die Spermatogenese, für die Aufrechterhaltung von Potenz und Libido und auch der Aktivität, Aggressivität und Leistungsfähigkeit.

Der Abbau erfolgt auf dem folgenden Weg:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Metabolismus von Testosteron im menschlichen Körper

Die eigentlich wirksame Form von Testosteron ist das 5a-Dihydrotestosteron. Es wird in der Prostata durch Reduktion von Testosteron gebildet. Beim Abbau des Testosterons entsteht vor allem Androsteron und 5a-Androstan-3a,17b-diol. Daneben entstehen aber auch die Isomere Etiocholan-3a-ol-17-on und Epiandrosteron. Sämtliche Endprodukte des Testosteronabbaus kommen im menschlichen Urin vor. Des Weiteren konnte Androsteron im Urin von Stieren und trächtigen Kühen und Epiandrosteron im Urin von trächtigen Stuten nachgewiesen werden. [4, 6, 7]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 2: Strukturformel von Etiocholan-3a-ol-17-on

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 3: Strukturformel von Epiandrosteron

Die androgene Aktivität wird in internationalen Einheiten (IU) angegeben, wobei 1 IU der Aktivität von 100 µg Androsteron entspricht.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Androgene Aktivität verschiedener Steroide [31]

2.1.1.3 Methyltestosteron

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 4: Strukturformel von Methyltestosteron

Methyltestosteron ist ein synthetisches Androgen. Da Testosteron in der Leber rasch metabolisiert wird, ist es bei oraler Gabe nur wenig wirksam. Durch Methylierung in 17a-Stellung wird die Oxidation zum inaktiven Keton vermieden. Somit wird durch diese Methylierung ein oral wirksames Androgen erhalten. [7]

2.1.1.4 Methyltrienolon (R 1881)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 5: Strukturformel von R 1881

Bei R 1881 handelt es ich um ein synthetisches Androgen. Es besitzt gegenüber natürlichen Androgenen den Vorteil, dass es nur schwer in inaktive Metabolite umgewandelt wird. Deshalb ist es für die Dauer von Experimenten stabil und wird oft als Standardsubstanz bei In-vivo- und In-vitro-Studien eingesetzt. [3, 17]

2.1.2 Antiandrogene Substanzen

In der Umwelt wurden bereits mehrere Substanzen gefunden, denen man durch Tierversuche verschiedene antiandrogene Wirkungen nachweisen konnte. Außerdem werden verschiedene Antiandrogene synthetisiert, von denen drei (Bicalutamid, Cyproteronacetat und Flutamid) in der Medizin Verwendung finden.

2.1.2.1 Umweltrelevante Antiandrogene

Linuron

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 6: Strukturformel von Linuron

Linuron wird vor allem als selektives systemisches Herbizid gegen Unkräuter im Sojabohnen- und Kartoffelanbau eingesetzt. Es findet sich in vielen Fließgewässern.

Bei einer Gabe von Linuron an Ratten konnte eine Gewichtsreduktion der akzessorischen Geschlechtsorgane beobachtet werden. [1]

Vinclozolin und Metabolite

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7: Abbau von Vinclozolin

Vinclozolin ist ein selektives Kontaktfungizid. Es wird hauptsächlich zur Bekämpfung von Graufäule im Wein-, Gemüse-, Hopfen-, Erdbeer- und Zierpflanzenanbau eingesetzt.

An männlichen Ratten wurde unter Vinclozolingabe die Geschlechtsentwicklung in antiandrogener Art beeinflusst. Die Metabolite M1 und M2 zeigten unter gleichen Bedingungen eine wesentlich stärkere antiandrogene Wirkung als Vinclozolin. Daher wird vermutet, dass die Wirkung von Vinclozolin eventuell ausschließlich von den Metaboliten verursacht wird.

Vinclozolin konnte bei zahlreichen Gewässeruntersuchungen in nur einer Probe nachgewiesen werden. Über das Vorkommen der Abbauprodukte M1 und M2, die wasserlöslicher und stabiler als Vinclozolin sind, liegen bisher keine Untersuchungen vor. [1]

DDT und Metabolite

Das Insektizid p,p'-DDT wurde früher weltweit in großen Mengen verwendet. Auch heute noch wird es vor allem in tropischen Ländern zur Malariabekämpfung eingesetzt. Es tritt mittlerweile ubiquitär auf.

In mehreren unabhängigen Tierversuchen wurde p,p'-DDE, dem Hauptmetabolit von DDT, eine starke antiandrogene Wirkung nachgewiesen. Eine Rezeptorbindungsstudie zeigte, dass auch o,p'-DDT, p,p'-DDT und p,p'-DDD eine Androgenbindung inhibieren. Die Wirkung ist allerdings um etwa den Faktor 10 schwächer als die von p,p'-DDE. [1, 4]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 8: Strukturformel von p, p'-DDE

2.1.2.2 Klinisch relevante Antiandrogene

Antiandrogene werden in der Medizin beim Mann bei zu früh einsetzender Pubertät (Pubertas praecox), bei Prostatakarzinom und zur Dämpfung des Sexualtriebes sowie bei Androgenisierungserscheinungen der Frau eingesetzt. Sie wirken durch kompetitive Bindung an den Androgenrezeptor.

Der neueste antiandrogene Wirkstoff, der als Medikament zugelassen wurde, ist Bicalutamid (Handelsname: Casodex).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 9: Strukturformel von Bicalutamid

Seine Affinität zum Androgenrezeptor ist etwa viermal höher als von Hydroxyflutamid. Hydroxyflutamid ist der aktive Metabolit des Wirkstoffs Flutamid (Handelsname: Fugerel).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 10: Strukturformel von Flutamid

Eine vergleichende Studie zwischen Bicalutamid und Flutamid an 813 Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakarzinom kam zu dem Ergebnis, dass Bicalutamid wesentlich besser verträglich ist. Die Wirkung der beiden Medikamente war vergleichbar, wobei die Dosis bei täglich 50 mg Bicalutamid beziehungsweise 750 mg Flutamid lag.

Als drittes Medikament befindet sich Cyproteronacetat (Handelsname: Androcur) im Handel. [8, 9]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 11: Strukturformel von Cyproteron

2.1.3 Östrogene und Gestagene

2.1.3.1 17b-Östradiol

17b-Östradiol wird vor allem in den Follikeln des Eierstocks gebildet. Es ist das am stärksten wirksame menschliche Östrogen und steuert im Wesentlichen zusammen mit anderen Hormonen den Menstruationszyklus. [4, 8]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 12: Strukturformel von 17b-Östradiol

2.1.3.2 17a-Ethinylöstradiol

17a-Ethinylöstradiol ist ein oral wirksames, synthetisches Östrogen, das eine wesentlich größere Aktivität als 17b-Östradiol besitzt. Es wird deshalb in der Medizin bei verschiedensten Indikationen eingesetzt. [8]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 13: Strukturformel von 17a-Ethinylöstradiol

2.1.3.3 Progesteron

Progesteron ist das wichtigste Gestagen. Es wird hauptsächlich im Gelbkörper gebildet und beeinflusst zusammen mit den Östrogenen den Menstruationszyklus, wobei es gegenüber den Östrogenen teils antagonistisch, teils synergistisch wirkt. Während der Schwangerschaft findet die Produktion hauptsächlich in der Plazenta statt und dient dann vor allem der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft. [4, 8]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 14: Strukturformel von Progesteron

2.2 Weitere Substanzen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden

2.2.1 Triphenylmethanderivate

Über die Wirkung der Triphenylmethanderivate und deren Vorkommen in der Umwelt ist bisher nur wenig bekannt.

Tris(4-chlorphenyl)methanol (TCPM) / Tris(4-chlorphenyl)methan (TCPME)

TCPM ist wahrscheinlich ein Abbauprodukt von TCPME, das ein Nebenprodukt bei der Herstellung von DDT ist. Beide wurden in verschiedensten marinen Umweltproben in Konzentrationen von bis zu mehreren ppm gefunden. [28]

Triphenylmethanol (TPM)

Triphenylmethanol findet bei zahlreichen chemischen Synthesen Verwendung und ist Grundkörper der Triarylmethan-Farbstoffe. [4]

2.2.2 a-Hexylzimtaldehyd

a-Hexylzimtaldehyd wurde in mehreren süddeutschen Kläranlagenabläufen in Konzentrationen von etwa 10 µg/l (» 1,18 × 10-7 mol/l) nachgewiesen. Über seine Wirkung und sonstige Verbreitung in der Umwelt liegen bisher keine Daten vor. [26]

2.2.3 Tris(2-chlorethyl)-phosphat (TCEP)

Bei TCEP handelt es sich um ein Flammschutzmittel, dass kürzlich in Kläranlagenabläufen identifiziert wurde. Es tritt vermutlich ubiquitär auf, wobei für Deutschland noch keine Untersuchungen vorliegen. Die Produktion in Deutschland liegt bei 4000–5000 Tonnen pro Jahr. Bei Tierversuchen an Ratten konnte TCEP karnzerogene und neurotoxische Wirkung nachgewiesen werden. Für die Wirkung am Menschen liegen noch keine gesicherten Daten vor. Jedoch wurde 1998 ein Antrag zum Verbot auf EU-Ebene in verbrauchsnahen Produkten gestellt. [29]

2.2.4 Cortisol (Hydrocortison)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 15: Strukturformel von Cortisol

Cortisol ist ein kataboles Hormon, welches in der Nebennierenrinde gebildet wird. In der Medizin wird es vor allem bei entzündlichen Erkrankungen, als Antiallergikum und als Antirheumatikum eingesetzt. [8]

2.2.5 b-Sitosterol

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 16: Strukturformel von b-Sitosterol

b-Sitosterol ist das am meisten verbreitete pflanzliche Sterin. Es kommt in zahlreichen Pflanzen vor und ist ein wichtiger Rohstoff zur Herstellung von Steroiden wie Corticoiden, Östrogenen und anderen Sexualhormonen sowie von Kontrazeptiva. Da b-Sitosterol mit Cholester­in einen Komplex bildet, der die Darmwand nicht passieren kann, wird es als Lipidsenker zur Prophylaxe von Arteriosklerose und Hyperlipidämie sowie gegen Prostatabeschwerden eingesetzt. [4]

2.3 Untersuchung auf (anti-)androgene Substanzen

Zum Nachweis, ob eine Substanz beziehungsweise eine Umweltprobe eine androgen- oder antiandrogenartige Wirkung besitzt, bieten sich verschiedene biologische Verfahren an, wobei jeweils die Substanzen an einen Androgenrezeptor binden, welcher eine spezifische Wirkung induziert. Diese wird wiederum gemessen. Hiermit kann allerdings nicht festgestellt werden, welche speziellen Substanzen eines Stoffgemisches die Wirkung verursachen. Um dies herauszufinden und die Substanzen zu quantifizieren, müssen chemische Analysenmethoden eingesetzt werden.

Für die Untersuchung auf endokrine Effekte sind In-vivo-Verfahren prinzipiell am besten geeignet. Die dadurch gewonnenen Ergebnisse lassen sich am ehesten auf andere Lebewesen übertragen, da sie nicht nur von der androgenen Wirkung abhängen, sondern auch die verschiedenen pharmakokinetischen Einflüsse durch Aufnahme, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung beinhalten. Da Tierversuche aus ethischen Gründen minimiert werden sollten und hohen Kosten unterliegen, wird versucht, die Untersuchungen anhand von In-vitro-Tests durchzuführen. Dafür wurden, insbesondere zum Nachweis von östrogener Wirkung, verschiedene Testverfahren entwickelt. In-vitro-Testverfahren erlauben allerdings nur bedingt Aussagen über die Wirkung auf das endokrine System eines Lebewesens, da sie lediglich die Wirkung auf die für den Test verwendeten Zellen zeigen, woraus nur bedingt Rückschlüsse auf den Gesamtorganismus gezogen werden können.

Ein In-vitro-Test zur Untersuchung von Substanzen auf ihr androgenes Potenzial wurde von Szelei et al. [3] entwickelt.

Zum chemischen Nachweis von Steroiden wurden bereits verschiedene Methoden mittels GC/MS publiziert, wobei die Steroide zuvor meist silyliert werden, um ihren Siedepunkt herabzusetzen. Die Detektion mittels Massenspektroskopie bietet eine hohe Selektivität, die auf Grund der Vielfalt ähnlich gebauter Steroide benötigt wird.

Zusätzlich wird eine Methode benötigt, mit der die Steroide aus den wässrigen Umweltproben angereichert und gereinigt werden können. Hierzu bietet sich die Festphasenextraktion an, mittels derer bereits zahlreiche Methoden etabliert wurden.

2.3.1 Probenvorbereitung

Die Untersuchung von wässrigen Umweltproben auf Steroide erfordert eine Aufkonzentrierung und Reinigung der Proben, für die eine Festphasenextraktion am besten geeignet ist. Bei stark verschmutzten Proben kann man daran vor einer chemischen Analytik noch eine Reinigung mittels Säulenchromatografie anschließen. Es werden in der Literatur zahlreiche Methoden vorgestellt, von denen hier jeweils eine exemplarisch dargestellt wird.

Festphasenextraktion

Zur Festphasenextraktion von phenolischen Substanzen wurde von Bolz et al. [23] eine Methode entwickelt, die folgendermaßen durchgeführt wird:

Ein Liter der wässrigen Probe wird mit 5 ml Methanol versetzt und mit Natriumchlorid auf einen Salzgehalt von etwa 5 g/l eingestellt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes mit konzentrierter Schwefelsäure auf etwa 2–3 wird eine Festphasenextraktion durchgeführt, wofür Fertigkartuschen mit 200 mg ENV+ als Sorbens verwendet werden. Um grobe Verschmutzungen zurückzuhalten, wird das Sorbens mit silanisierter Glaswolle abgedeckt. Vor der Extraktion wird jede Säule mit 6 ml Aceton, 10 ml Methanol und 6 ml demineralisiertem Wasser, das zuvor mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt wurde, konditioniert. Die Extraktion erfolgt mit einer Fließgeschwindigkeit von 10–15 ml/min.

Nach der Extraktion wird jede Kartusche mit 6 ml demineralisiertem Wasser (pH = 2) gewaschen, im Stickstoffstrom getrocknet und zweimal mit je 2,5 ml Ethylacetat eluiert.

Säulenchromatografie

Ebenfalls von Bolz [30] wurde eine Methode für steroidale Östrogene entwickelt, die eine zusätzliche Reinigung von Proben erlaubt.

Eine Pasteurpipette wird mit silanisierter Glaswolle abgedichtet und mit 1 g desaktiviertem Kieselgel gefüllt. Zur Desaktivierung versetzt man das Kieselgel mit 1,5 % Wasser und erhitzt es eine Stunde im Trockenschrank auf 75 °C. Die Kieselgelsäule wird mit 10 ml einer Mischung aus n-Heptan, Ethylacetat und Methanol im Verhältnis 6:2:2 konditioniert. Nach dem quantitativen Aufgeben der Probe eluiert man mit 5 ml selbiger Mischung.

2.3.2 Biologisches Screening

2.3.2.1 Der A-Screen Assay nach Szelei et al.

Der Test von Szelei et al. [3] beruht darauf, dass das Wachstum der verwendeten Brustkrebszellen MCF-7 AR-1 (siehe Kapitel 2.3.2.3) durch Androgene gehemmt wird. Sie fanden außerdem eine Möglichkeit, durch Verwendung eines serumfreien Mediums den Einfluss anderer Hormone auf das Zellwachstum zu minimieren. Es wird von Progesteron und 17b-Östradiol nicht beeinflusst und eine inhibierende Wirkung von Hydrocortison konnte erst bei hohen Konzentrationen (1×10-7 mol/l) festgestellt werden. Ein Einfluss auf das Wachstum durch die Antiandrogene Bicalutamid und Hydroxyflutamid wurde ebenfalls nicht festgestellt. Somit können gemessene Wirkungen weitgehend spezifisch auf androgene Substanzen zurückgeführt werden.

Die Methode wird folgendermaßen durchgeführt:

Die Zellen werden in 75 cm2 Kulturflaschen in Dulbecco´s MEM (DMEM) mit 5 % FBS kultiviert. Mittels Trypsin werden sie vom Boden der Kulturflaschen abgelöst und 40 000–50 000 Zellen/Well in 12 Well Zellkulturplatten (Costar) gegeben. Als Medium dient dazu wiederum DMEM mit 5 % FBS verwendet. Nach 24 Stunden wird das Medium entfernt, einmal mit phenolrotfreiem DMEM ohne FBS gespült und Experimentalmedium zugegeben. Als Experimentalmedium wird phenolrotfreies DMEM ohne FBS verwendet, das mit Insulin und Transferrin versetzt ist. In dieser Lösung werden zuvor außerdem die zu testenden Substanzen gelöst. Nach weiteren fünf Tagen werden die Zellen trypsiniert und mit einem Zellzähler gezählt. [3]

2.3.2.2 Die MCF-7 Zelllinie

Die MCF-7 Zelllinie wurde ursprünglich von Soule et al. [11] etabliert. Sie stammt von einem metastasierenden Adenokarzinom der Brust einer 69-jährigen hellhäutigen Patientin. Die Zellen wurden im Jahre 1970 entnommen, nachdem die Patientin längere Zeit mit einer Radiotherapie und Hormonen behandelt wurde. Bei der MCF-7 Zelllinie handelt es sich um eine stabile, gut erforschte Zelllinie, die in vielen Labors eingesetzt wird. Sie wächst adhärent und ist allgemein als östrogensensitiv anerkannt. Seit der Entnahme haben sich mehrere Zellstöcke mit verschiedenen Eigenschaften und verschiedener Östrogensensitivität gebildet. Die Zelle enthält etwa 100 pmol/g Protein Östrogenrezeptoren und 40 pmol/g Protein Androgenrezep­toren. [2, 11, 12, 13]

2.3.2.3 Die MCF-7 AR-1 Zelllinie

Zu Herstellung der MCF-7 AR-1 Zelllinie wurde MCF-7 Zellen das Gen des humanen Androgenrezeptors transfiziert. Dadurch wurde erreicht, dass der Androgenrezeptor verstärkt expremiert wird. Die entstandenen Zellen sind stabil und enthalten etwa 92 pmol/g Protein Androgenrezeptoren im Gegensatz zu 40 pmol/g Protein bei den MCF-7 Zellen. Dadurch werden die Zellen empfindlicher gegenüber dem Einfluss von Androgenen, durch die eine Inhibierung des Wachstums bewirkt wird. [3]

2.3.2.4 Der Androgenrezeptor

Sämtliche Steroidhormonrezeptoren besitzen die gleiche Grundstruktur (siehe Abbildung 17).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 17: Allgemeine Struktur eines Steroidhormonrezeptors a: N-terminales Ende b: DNA-Bindungsdomäne c: Ligandenbindungsdomäne.

Der menschliche Androgenrezeptor besteht aus 910 bis 919 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 110 bis 114 kDa. Die unterschiedliche Anzahl von Aminosäuren resultiert aus einer unterschiedlichen Menge von L-Glutamin im N-terminalen Ende.

Er ist in der Kernmembran lokalisiert. Bei Aktivierung bindet er mit seiner DNA-Bindungsdomäne an bestimmte DNA-Sequenzen und löst dadurch die Transkription von Genen aus. [27]

2.3.2.5 Transferrin

Transferrin ist in menschlichem und tierischem Serum enthalten. Es handelt sich dabei um ein in seiner Zusammensetzung tierartspezifisches Glykoprotein. Seine biologische Funktion besteht in der Eisenübertragung in die Zelle. Es kann dazu zwei Eisen(III)-Ionen reversibel binden. Eisengesättigtes Transferrin (Holo-Transferrin) wird durch Endozytose in die Zellen aufgenommen und gibt dort das Eisen ab. Dieses eisenfreie Transferrin (Apo-Transferrin) gelangt durch Exozytose wieder in die extrazelluläre Flüssigkeit.

Transferrin wird zum Wachstum von Zellen in serumfreien Medien neben Insulin benötigt. [22, 4]

2.3.2.6 Detektionsmethoden

Um am Ende eines Versuches die Zellzahl zu bestimmen, bestehen verschiedene Möglichkeiten. Die Zellzählung mittels eines Zellzählers, wie er von Szelei et al. [3] verwendet wurde, ist relativ aufwändig und die apparative Einrichtung hierfür ist im hiesigen Labor nicht vorhanden. Als Alternativen existieren verschiedene Farbreaktionen, wobei die Extinktion der dabei erhaltenen Lösungen fotometrisch bestimmt wird. Die verbreitetsten Verfahren sind im Folgenden näher erläutert.

Alamar Blue

Alamar Blue ist ein Redoxindikator, der in die Zellen aufgenommen und dort durch FMNH2, FADH2, NADH, NADPH und die Cytochrome reduziert wird. Dadurch wechselt er seine Farbe von blau nach rot. Außerdem ermöglicht er eine Fluoreszenzdetektion, da die reduzierte Form im Gegensatz zur oxidierten fluoresziert. Der Farbstoff ist weitgehend ungiftig und die Durchführung benötigt etwa 4,5 Stunden. [14]

Elisa mittels 5-Brom-2´-desoxy-uridin (BrdU)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 18: Strukturformel von BrdU

Die Zellen werden mit BrdU versetzt, das sich im Laufe mehrerer Stunden in neu gebildete DNA einlagert. Daraufhin werden die Zellen fixiert und mit einer Nuclease-Lösung versetzt, wodurch die DNA teilweise gespalten und das BrdU wieder freigesetzt wird. Nun gibt man einen peroxidasemarkierten Antikörper zu, der sich an das BrdU bindet. Ein daraufhin zugesetztes Peroxidase-Substrat wird unter Katalyse der Peroxidase zersetzt. Das dabei entstehende grüne Produkt wird fotometrisch bestimmt. Die gesamte Bestimmung dauert etwa 7–8 Stunden. [15]

MTT

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 19: Strukturformel von MTT

Die Funktion des MTT-Assays beruht darauf, dass das gelbe Tetrazoliumsalz 3-(4,5-Di-methyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) nach der Aufnahme in die Zellen durch die mitochondriale Succinat-Dehydrogenase zum blauen und unlöslichen MTT-Formazan reduziert wird. Dieses kann fotometrisch bestimmt werden. Der Zeitaufwand für das Verfahren beträgt etwa 2,5 Stunden. [2, 14]

Sulforhodamin B

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 20: Strukturformel von Sulforhodamin B

Sulforhodamin B geht mit anionischen Resten von Makromolekülen der Zelle elektrostatische Bindungen ein. Der gebundene Farbstoff wird daraufhin mit Trispufferlösung wieder aus der Zelle gelöst und fotometrisch bestimmt. Man benötigt für die gesamte Bestimmung etwa drei Stunden. [20]

2.3.2.7 Statistik

Relative Extinktion

Unter der relativen Extinktion wird die Extinktion einer Probe im Verhältnis zur Extinktion der hormonfreien Kontrolle verstanden. Sie ermöglicht eine Aussage über die Stärke einer Inhibierung oder Stimulation der Zellproliferation durch eine Testsubstanz.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Gleichung 1: Berechnung der relativen Extinktion

Relativer antiandrogener Effekt

Um die Stärke einer antiandrogenen Wirkung darzustellen, wird der relative antiandrogene Effekt (RAAE) berechnet. Dieser ergibt sich aus folgender Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Gleichung 2: Berechnung des RAAE

Der relative antiandrogene Effekt gibt an, wie viel Prozent einer androgenen Wirkung durch ein Antiandrogen aufgehoben werden.

Berechnung der Standardabweichung

Um eine Aussage über die Abweichung mehrerer Einzelmessungen voneinander zu machen, wird die Standardabweichung berechnet. Sie ist ein Maß dafür, wie stark die Einzelwerte um den Mittelwert streuen. Die Berechnung erfolgt nach folgender Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Gleichung 3: Formel zur Berechnung der Standardabweichung

Die Standardabweichung wird in den Abbildungen grafisch dargestellt.

Unter der prozentualen Standardabweichung wird die prozentuale Höhe der Standardabweichung vom Mittelwert verstanden.

In den biologischen Versuchen werden folgende Standardabweichungen angegeben:

SAR: Relative Standardabweichung innerhalb einer Viererreihe mit gleicher Konzentration der Testsubstanz. Wurde der Versuch mehrmals wiederholt, ist der Mittelwert aus den Versuchen angegeben.

SAV: Relative Standardabweichung zwischen mehreren unabhängigen Versuchen mit gleicher Konzentration der Testsubstanz.

EC50

Unter der EC50 wird die Konzentration verstanden, bei der eine Substanz 50 % ihrer maximalen Wirkung entfaltet. Dies erlaubt eine Aussage darüber, wie wirksam eine Substanz ist. Berechnet wird sie, indem experimentell mehrere Punkte einer Konzentrations-Wirkungs-Kurve ermittelt werden. Über eine Regression wird nun der Kurvenverlauf berechnet. Die Konzentration, bei der sich der Wendepunkt der Kurve befindet, entspricht der EC50.

2.3.3 Chemische Spurenanalytik

Zum Nachweis von Androgenen und Metaboliten in Blut und Urin wurde von Hagenmaier [24] eine Methode publiziert, die hier als Ausgangspunkt dient. Sie führt die Trennung von Testosteron und verschiedener Metaboliten mittels Gaschromatografie nach vorheriger Trimethylsilylierung und die Detektion unter Verwendung der Massenspektroskopie durch.

2.3.3.1 Derivatisierung

Da der Siedepunkt von Steroiden für eine direkte gaschromatografische Analyse zu hoch ist, müssen diese zuvor derivatisiert werden. Die dazu am häufigsten eingesetzte Methode ist die Trialkylsilylierung, bei der ein aktivierter Wasserstoff durch eine Trialkylsilylgruppe (meist Trimethylsilyl) ersetzt wird. Dadurch wird das Molekül flüchtiger, unpolarer und thermisch stabiler. Die Reaktion von Hydroxylgruppen erfolgt nach folgender Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Gleichung 4: Allgemeine Gleichung zur Silylierung von Hydroxylgruppen

Die Derivatisierung von Ketogruppen erfolgt bei den Steroiden nach Umlagerung über eine Keto-Enol-Tautomerie, durch die wiederum eine Hydroxylgruppe entsteht. [18]

Zur Derivatisierung stehen eine Reihe von Methoden mit unterschiedlichen Derivatisierungsreagenzien zur Verfügung. Es befinden sich außerdem fertige Mischungen von Derivatisierungsreagenzien im Handel. Zwei Methoden werden im Folgenden näher dargestellt. [18]

MSTFA / TMSI

Von Hagenmaier [24] wird zur Derivatisierung von Steroiden ein Gemisch aus N-Methyl-N-Trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) und N-Trimethylsilylimidazol (TMSI) im Volumenverhältnis 100:2 verwendet. Die Derivatisierung verläuft in der Hitze nach Gleichung 4. Für X gelten folgende Reste:

MSTFA:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

TMSI:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Sylon BTZ

Sylon BTZ ist ein fertiges Substanzgemisch, das von der Firma Supelco zur Trimethylsilylierung von verschiedensten Substanzen angeboten wird. Es besteht aus den drei Chemikalien N,O-bis(trimethylsilyl)acetamid (BSA), Trimethylchlorsilan (TMCS) und N-Trimethylsilyl­imidazol (TMSI) im Volumenverhältnis 3:2:3, wobei TMCS als Katalysator wirkt. Die Silylierung erfolgt ebenfalls in der Hitze nach Gleichung 4, in der für X folgende Reste eingesetzt werden müssen:

BSA:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

TMCS:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

TMSI:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.3.3.2 Gaschromatografie / Massenspektroskopie

Die Gaschromatografie wird von Hagenmeier [24] nach folgenden Parametern durchgeführt:

Säulentyp: DB-XLB

Säulenlänge: 30 m

Innendurchmesser: 0,25 mm

Filmdi>Detektortemperatur: 280 °C

Temperaturprogramm:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In der Massenspektroskopie bestehen die Möglichkeiten des Scan- oder des SIM-Modus. Im Scan-Modus werden sämtliche Ionen innerhalb eines bestimmten Massenbereiches kontinuierlich detektiert. Dies hat allerdings den Nachteil, dass die Nachweisgrenze relativ schlecht ist. Deshalb wird er meist nur für die Entwicklung einer Methode eingesetzt. Danach wird der SIM-Modus gewählt, bei dem lediglich die charakteristischen Massen der untersuchten Verbindungen aufgezeichnet werden. Die Nachweisgrenze liegt hier um den Faktor 10–100 niedriger als beim Scan-Modus.

3 Experimenteller Teil

3.1 Aufgabenstellung

Von J. Szelei et al. [3] wurde ein In-vitro-Test zur Untersuchung von Einzelsubstanzen auf androgen- und antiandrogenartige Wirkung entwickelt. Dieser soll verbessert und auf die hiesigen Laborbedingungen optimiert werden. Nach einer Erweiterung des Einsatzgebietes auf das Screening von wässrigen Umweltproben sollen verschiedene Einzelsubstanzen und Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial hin untersucht werden.

Um herauszufinden, welche speziellen Substanzen einen androgenen Effekt in den Umweltproben bewirken, soll eine GC/MS-Methode zur Spezifizierung und Quantifizierung von natürlichen Androgenen und deren wichtigster Metabolite entwickelt werden.

3.2 Herstellung der verwendeten Lösungen

HEPES-Pufferlösung

5,96 g 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure (HEPES) werden in 25 ml demineralisiertem Wasser gelöst (= 1 mol/l). Diese Lösung wird mit Natronlauge (10 mol/l) auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt und mit einer 0,2 µm Einwegfiltereinheit sterilfiltriert.

Transferrin-Lösung

30 mg Transferrin werden in 15 ml Dulbecco´s MEM ohne Phenolrot gelöst und auf 0,2 µm sterilfiltriert.

Kulturmedium

500 ml Dulbecco´s MEM mit Phenolrot werden versetzt mit

- 5 ml MEM Nichtessentielle Aminosäuren-Lösung (100X)

- 25 ml Fötales Rinderserum (FBS)

- 5 ml Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100X)

Experimentalmedium

500 ml Dulbecco´s MEM ohne Phenolrot werden versetzt mit

- 200 mM L-Glutamin

- 5 ml Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100X)

- 5 ml HEPES-Pufferlösung

- 5 ml MEM Nichtessentielle Aminosäuren-Lösung (100X)

197,1 ml dieser Lösung werden unmittelbar vor Gebrauch mit 2,5 ml Transferrin-Lösung und 0,4 ml Insulin-Lösung (50 µg/ml, verdünnt mit Dulbecco´s MEM ohne Phenolrot) versetzt. Zusätzlich werden in diesem Experimentalmedium je nach Bedarf die verschiedenen Testsubstanzen gelöst.

Herstellung von CDFBS (Charcoal Dextrane Fetal Bovine Serum)

Die im Serum enthaltenen Steroidhormone wurden nach der Methode von Stanley et al. [25] entfernt.

Das Serum wird im Kühlschrank aufgetaut, mit Salzsäure (4 N) auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellt und anschließend 30 Minuten bei einer Temperatur von 0 °C gerührt. Dazu werden 5 % einer Dextran-Aktivkohle-Suspension hinzugefügt, die aus 10 % Aktivkohle und 0,05 % Dextran in Wasser besteht. Der pH-Wert wird daraufhin eventuell nochmals nachgestellt. Danach wird etwa 15 Stunden bei 4 °C gerührt. Nach dem Abzentrifugieren wird der Überstand mit Natronlauge (4 N) auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellt und auf 0,2 µm sterilfiltriert.

Detektionsmedium

500 ml Dulbecco´s MEM ohne Phenolrot werden versetzt mit

- 200 mM L-Glutamin

- 5 ml Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100X)

- 5 ml HEPES-Pufferlösung

- 5 ml MEM Nichtessentielle Aminosäuren-Lösung (100X)

- 25 ml CDFBS

Einfriermedium I

6 ml FBS werden mit 4 ml Kulturmedium versetzt.

Einfriermedium II

2,5 ml DMSO werden mit 7,5 ml Kulturmedium versetzt.

Trispufferlösung

0,6055 g Trispuffer werden in 500 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wird anschließend mit Natronlauge (1 M) auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt.

Sulforhodamin B-Lösung

0,4 g Sulforhodamin B werden in 100 ml Essigsäure (1 %) gelöst.

Wasser (pH = 2)

Demineralisiertes Wasser wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt.

3.3 Biologische Analytik

3.3.1 Verschiedene allgemeine Methoden

Im Folgenden wird die Vorgehensweise für die wichtigsten, bei Zellkulturarbeiten üblichen Arbeitsschritte erläutert.

Kultivierung der Zellen

Da es sich bei den MCF-7 Zellen um adhärente Zellen handelt, haften diese am Gefäßboden. Um sie in kleinen Mengen zu kultivieren, sind deshalb Zellkulturflaschen mit einer Grundfläche von 75 cm2 am besten geeignet.

Das Kulturmedium wird alle 3–4 Tage gewechselt. Dazu wird das verbrauchte Medium abgesaugt und etwa 15 ml des neuen Mediums mit Hilfe einer Messpipette zugegeben.

Bei zu dichtem Wachstum der Zellen werden diese trypsiniert (siehe unten) und ein Teil der Zellen mit 15 ml Medium in eine Kulturflasche gegeben.

Trypsinierung

Um die Zellen vom Boden der Kulturflasche abzulösen und zu suspendieren, wird das Kulturmedium abgesaugt, zum Spülen 2 ml einer auf 37 °C vorgewärmten Trypsin/EDTA-Lösung in die Kulturflasche gegeben, dieses ebenfalls abgesaugt und wiederum 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung zugegeben. Dies wird für etwa 5 Minuten bei 37 °C inkubiert, wobei sich die Zellen vom Boden ablösen. Man versetzt die entstandene Suspension mit 10 ml Kulturmedium und zentrifugiert mit 200 ´ g für etwa 2 Minuten. Nach dem Abgießen des Überstandes werden die Zellen mit 5 ml Kulturmedium versetzt und zum Vereinzeln der Zellen mit einer 5 ml-Spritze über eine Kanüle dreimal aufgenommen und wieder ausgespritzt. Um in der Suspension die Zellzahl zu bestimmen, verdünnt man einen Teil davon und zählt ihn in einer Neubauerzählkammer aus.

Einfrieren der Zellen

Um Zellen über einen längeren Zeitraum aufzubewahren, werden sie eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Dazu trypsiniert man die Zellen in einer Kulturflasche. Nach dem Resuspendieren mit Kulturmedium werden sie gezählt und erneut zentrifugiert. Die Zellen werden nun auf Eis gelegt, gekühltes Einfriermedium I zugegeben und resuspendiert. Danach wird unter Schütteln die gleiche Menge gekühltes Einfriermedium II tropfenweise hinzugegeben. Die Volumina bemisst man dabei so, dass eine Konzentration von etwa 5×106 Zellen/ml entsteht. Nach fünfminütiger Lagerung auf Eis werden die Zellen zuerst einen Tag bei –20 °C, anschließend drei Tage bei –80 °C gelagert und dann in flüssigen Stickstoff gegeben.

Auftauen der Zellen

Nach der Entnahme der Zellen aus dem Stickstofftank versetzt man sie mit 2 ml Kulturmedium. Sie werden bei Raumtemperatur aufgetaut und nach dem Schmelzen sofort mit weiteren 10 ml Kulturmedium vermischt und zentrifugiert. Nach erneutem Suspendieren in etwa 15 ml Kulturmedium werden die Zellen in eine Kulturflasche gegeben und kultiviert. Der erste Mediumwechsel erfolgt nach 24 Stunden.

3.3.2 Übertragung der Methode von Szelei et al. auf die hiesigen Laborbedingungen

Zunächst sollte versucht werden, die Methode nach Szelei [3] auf die hiesigen Laborbedingungen zu übertragen. Dazu wurde die Methode erst wie folgt durchgeführt und daraufhin die einzelnen Teilschritte optimiert. Die Experimente wurden jeweils mehrmals durchgeführt und als Ergebnis der Mittelwert und die prozentuale Standardabweichung angegeben.

Ausbringen der Zellen

Nach dem Trypsinieren der Zellen wird die Zellsuspension mit Kulturmedium auf eine Konzentration von 60 000 Zellen/ml verdünnt. In jedes Well werden mit einer Multipette 0,5 ml der Zellsuspension in Falcon 24-Well-Platten gegeben. Daraufhin werden die Platten 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Ursprünglich sollte die Inkubation nur über 24 Stunden erfol­gen. Bei der mikroskopischen Betrachtung der Zellen nach dieser Zeit sahen diese allerdings noch nicht ausreichend am Untergrund angehaftet aus. Deshalb wurde weitere 24 Stunden inkubiert.

Substanzzugabe

Zur Substanzzugabe wird das Kulturmedium mit einer Pasteurpipette abgesaugt, mit 0,5 ml DMEM zum Spülen versetzt, dieses wiederum abgesaugt und mittels einer Multipette mit je 1 ml Experimentalmedium versetzt. Als Testsubstanz wird das synthetische Androgen Methyltrienolon R 1881 in Konzentrationen von 1×10-12 bis 1×10-8 mol/l verwendet, wobei in jeweils eine Viererreihe die gleiche Konzentration gegeben wird. Als Bezugs- und Kontrolllösung findet Experimentalmedium ohne Testsubstanz Verwendung. Daraufhin wird weitere 96 Stunden inkubiert.

Detektion

Zur Detektion wird die Farbreaktion mit MTT (siehe Kapitel 2.3.2.6) gewählt. Hierzu schüttet man das Medium ab und setzt mit einer Multipette jedem Well 0,2 ml MTT-Lösung (c = 2 mg/ml in Detektionsmedium) zu. Nach zwei Stunden Inkubation bei 37 °C wird die MTT-Lösung abgeschüttet und 500 µl DMSO zugegeben, wobei der in den Zellen gebundene Farbstoff in Lösung geht. Die Bestimmung der Konzentration des Formazans erfolgt fotometrisch mit einem Mikroplatten-Fotometer, wofür die Lösungen in 96-Well-Platten überführt werden müssen (100 µl/Well). Als Messwellenlänge dient 550 nm und als Referenzwellenlänge 630 nm.

Bereits dieser erste Versuch ergab gute Ergebnisse:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 2: Ergebnisse des ersten Versuchs mit R 1881 (n = 2)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 21: Konzentrations-Wirkungs-Kurve für R 1881 (n = 2)

Die Standardabweichung innerhalb einer Viererreihe lag bei durchschnittlich 9,6 % und die Standardabweichung der relativen Proliferationen zwischen den Versuchen bei 9,2 %. Diese Abweichungen sind für eine biologische Analytik bereits akzeptabel und auch die Konzentrations-Wirkungs-Kurve entspricht den Erwartungen.

Unter dem Mikroskop war erkennbar, dass bei der Substanzzugabe ein großer Teil der Zellen mit abgesaugt wurde. Deshalb wurde die Stärke der Absaugung verringert. Dadurch konnte dieses Problem zwar nicht vollständig beseitigt, jedoch minimiert werden. An der Stelle, an der die Pasteurpipette zum Absaugen eingeführt wird, befindet sich nach wie vor ein Bereich, an dem sämtliche Zellen abgesaugt werden. Da dieser Bereich aber nur klein im Vergleich zur Größe der Wells ist, sollte dies keinen Einfluss auf das Ergebnis haben.

3.3.3 Bestimmung der Abweichung innerhalb einer Zellkulturplatte

Um die Höhe der Abweichung des Verfahrens bis zur Substanzzugabe zu bestimmen, wurde eine Platte nach dem Spülen nicht mit Experimentalmedium versetzt, sondern direkt mittels MTT detektiert. Dabei fiel auf, dass die Stärke des Vakuums gewissen Schwankungen unterlag. Die gemessene Extinktion deckte sich mit dem subjektiven Eindruck der Vakuumstärke: Je stärker das Vakuum, desto geringer war die Extinktion und damit die Anzahl der im Well befindlichen Zellen. Die Standardabweichung zwischen den 24 Wells betrug in diesem Versuch 9,0 %.

Deshalb wurde die Vakuumanlage umgebaut. Im Einzelnen waren dies die Verwendung dickwandigerer Schläuche, die Verminderung der Saugstrecken und die Beseitigung von Leckagen. Dadurch konnte erreicht werden, dass die Intensität der Absaugung weitgehend konstant blieb. Dies spiegelte sich auch in dem Ergebnis eines erneuten Versuches wider. Die prozentuale Standardabweichung betrug nun bei zwei unabhängigen Versuchen je 4,9 %.

3.3.4 Übertragung auf 96-Well-Zellkulturplatten

Die Durchführung der Bestimmung in 96-Well-Zellkulturplatten bringt den Vorteil mit sich, dass je Platte 12 Substanzen in einer Achtfachbestimmung im Gegensatz zu 6 Substanzen in einer Vierfachbestimmung bei 24-Well-Platten untersucht werden können. Daraus ergibt sich ein geringerer Material- und Chemikalienverbrauch. Außerdem ist die Durchführung schneller, da zur Fotometrie nicht von 24- in 96-Well-Platten umpipettiert werden muss.

Es wurde deshalb versucht, die Bestimmung auf 96-Well-Platten zu übertragen. Dafür standen 96-Well-Platten von Sarstedt und Falcon zur Verfügung. Die Bestimmung wurde ebenso wie in den 24-Well-Platten durchgeführt, mit dem Unterschied, dass je Well 5000 Zellen in 200 µl Medium ausgebracht wurden.

Wie bei den 24-Well-Platten wurden in dem Bereich, in dem die Pasteurpipette zur Absaugung eingeführt wurde, die Zellen mit abgesaugt. Bei den 96-Well-Platten erstreckte sich dieser Bereich aber nahezu über den gesamten Boden der Wells. Somit waren für eine sinnvolle Auswertung zu wenige Zellen vorhanden.

Um dies zu verbessern wurde versucht, das Medium mit einer 4-Kanalpipette abzusaugen. Dadurch konnte erreicht werden, dass nur ein geringerer Teil der Zellen abgesaugt wird. Allerdings unterlag nun die Stärke der Absaugung, je nachdem wie schnell die Pipette bedient wurde, einer großen Schwankung. Dies war auch unter dem Mikroskop an der Größe des zellfreien Bereiches erkennbar. Deshalb wurde auf eine weitere Auswertung des Versuches verzichtet.

Da das Labor über keine andere reproduzierbare Möglichkeit zur schonenden Absaugung verfügt, wurden die Versuche zur Übertragung auf 96-Well-Platten an dieser Stelle abgebrochen. Eine Möglichkeit dazu wäre eventuell die Verwendung einer Mehrkanalpipette bei der die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsaufnahme regulierbar ist.

3.3.5 Vergleich von Zellkulturplatten verschiedener Hersteller

Zur Feststellung des am besten geeigneten Plattentyps wurde die Bestimmung mit einer R 1881-Verdünnungsreihe je zweimal in 24-Well-Zellkulturplatten von Sarstedt, Costar und Falcon durchgeführt.

Bereits nach der Substanzzugabe wurde bei den Platten von Sarstedt mikroskopisch festgestellt, dass sich die Zellen vom Untergrund abgelöst haben. Deshalb wurde auf eine weitere Durchführung der Bestimmung verzichtet.

Auch bei den Platten der Firma Costar konnte bei der Detektion mittels MTT festgestellt werden, dass sich die Zellen teilweise vom Untergrund abgelöst haben. Deshalb wurde auch diese Bestimmung nicht weiter durchgeführt.

Lediglich bei den Falcon-Platten konnte weder bei der Substanzzugabe noch bei der Auswertung mittels MTT eine Ablösung der Zellen beobachtet werden. Die Zellen zeigten unter dem Mikroskop keinerlei Anomalitäten. Aus diesem Grund werden für die weiteren Bestimmungen nach wie vor Zellkulturplatten von Falcon verwendet.

3.3.6 Vergleich verschiedener Detektionsmethoden

Für die Bestimmung der Zellzahl am Ende eines Versuches stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung (siehe Kapitel 2.3.2.6). Da der Einsatz eines Zellzählers, wie er von Szelei et al. [3] verwendet wird, relativ aufwändig und außerdem im Labor nicht vorhanden ist, wird die Detektion anhand einer Farbreaktion vorgezogen.

Hierzu wurden vier verschiedene Methoden näher betrachtet, wobei der Zeitaufwand für die Detektion mittels BrdU-Elisa mit 7–8 Stunden sehr hoch ist. Darum wurde auf eine genauere Erprobung dieses Detektionsverfahrens verzichtet.

Um die verschiedenen Verfahren vergleichen zu können, wurden in mehrere Platten je Reihe unterschiedliche Zellzahlen (20 000–120 000 Zellen/Well) ausgesät. Nach zwei Tagen wurde das Kulturmedium abgesaugt, zum Spülen jedes Well mit 0,5 ml Experimentalmedium versetzt und die Platten mit verschiedenen Detektionsmethoden ausgewertet. Die Versuche wurden jeweils zweimal durchgeführt.

Sulforhodamin B

Das Experimentalmedium wird abgeschüttet und in jedes Well 0,5 ml kaltes PBS gegeben, das wiederum abgeschüttet wird. Anschließend versetzt man jedes Well mit 200 µl Trichlor­essigsäure (10 %). Nach einer 30-minütigen Inkubation im Kühlschrank werden die Platten unter fließendem Wasser gewaschen und im Trockenschrank bei 40 °C getrocknet. Die trockenen Platten werden nun mit 250 µl/Well Sulforhodamin B-Lösung (0,4 %) versetzt und nach 10 Minuten mit Essigsäure (1 %) gewaschen, bis die abfließende Essigsäure farblos ist. Nach erneutem Trocknen im Trockenschrank gibt man in jedes Well mit 500 µl Trispufferlösung. Der Farbstoff löst sich nach kurzer Zeit aus den Zellen heraus und kann nach dem Umpipettieren in eine 96-Well-Platte im Mikroplattenfotometer vermessen werden. Als Messwellenlänge dient 550 nm und als Referenzwellenlänge 630 nm.

Nach dem Spülen mit Essigsäure konnte man erkennen, dass sich in einigen Wells die Zellen auf einer größeren Fläche abgelöst hatten. Dies machte eine sinnvolle Auswertung unmöglich. Deshalb wurde der Versuch an dieser Stelle abgebrochen.

Alamar Blue

Die Durchführung erfolgte nach zwei verschieden Versuchsvorschriften:

1. Das Experimentalmedium wird abgeschüttet und in jedes Well 300 µl Alamar Blue gegeben, das zuvor mit Detektionsmedium 1:10 verdünnt wurde. Daraufhin wird 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Detektion erfolgt bei einer Messwellenlänge von 550 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm in einem Mikroplatten-Fotometer, wozu wiederum die Lösungen in 96-Well-Platten umpipettiert werden müssen.

Beim Umpipettieren trat das Problem auf, dass die Lösungen stark schäumten. Um dies zu vermeiden, wurde mit einer Multipette in jedes Well 30 µl Isopropanol gegeben.

2. 50 µl der Alamar Blue-Lösung werden direkt in jedes Well gegeben, ohne dass zuvor das Experimentalmedium abgeschüttet wird. Anschließend wird 4 Stunden inkubiert. Auf Grund der Erfahrungen aus dem letzten Versuch werden je Well 50 µl Isopropanol zugegeben und wiederum je 100 µl in 96-Well-Platten pipettiert. Die Detektion erfolgt ebenfalls bei einer Messwellenlänge von 550 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 3: Detektion mittels Alamar Blue (n = 2)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 22: Detektion mittels Alamar Blue (n = 2)

Die mittlere Standardabweichung zwischen den Wells einer Reihe betrug nach Methode I 4,9 % und nach Methode II 6,0 %. Die mittlere Standardabweichung zwischen den einzelnen Versuchen lag bei 0,5 % beziehungsweise 2,8 %. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven verlaufen relativ flach, aber weitgehend linear.

MTT

Die Durchführung der Detektion mit MTT erfolgte wie bereits in Kapitel 3.3.2 beschrieben. Es wurde zusätzlich versucht, Detektionsmedium mit 10 % CDFBS zu verwenden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 4: Detektion mittels MTT (n = 2)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 23: Detektion mittels MTT (n = 2)

Die mittlere Standardabweichung zwischen den Wells einer Reihe betrug mit 5 % CDFBS 3,1 % und mit 10 % CDFBS 3,5 %. Die mittlere Standardabweichung zwischen den einzelnen Versuchen lag bei 1,3 % beziehungsweise 3,4 %. Die Linearität der Konzentrations-Wirkungs-Kurven ist etwas besser als bei den Versuchen mit Alamar Blue. Außerdem verlaufen sie mit MTT wesentlich steiler. Die Variation des CDFBS-Gehaltes bei der MTT-Detektion hatte keinen entscheidenden Einfluss auf das Ergebnis. Die Standardabweichungen waren mit 5 % CDFBS etwas geringer, wobei die Gerade etwas flacher verläuft.

Aus der größeren Steilheit der Geraden bei der MTT-Detektion resultiert eine größere Messgenauigkeit. Auch die Standardabweichungen waren bei der MTT-Detektion meist geringer. Deshalb wird von einer Detektion mittels Alamar Blue Abstand genommen. Da bei der MTT-Detektion die Standardabweichung mit 5 % CDFBS geringer ist, wird weiterhin mit dieser Methode detektiert.

3.3.7 Optimierung der Zellzahl und des Gehaltes an FBS im Kulturmedium

Um herauszufinden, wie viele Zellen für ein optimales Ergebnis ausgesät werden müssen und welcher FBS-Gehalt im Kulturmedium optimal ist, wurden mehrere Platten mit R 1881-Verdünnungsreihen getestet. Dabei wurde die Anzahl der ausgesäten Zellen zwischen 5 000 und 30 000 je Well variiert, wofür Kulturmedium mit 5 und 10 % FBS verwendet wurde.

Die Zellen wuchsen im Kulturmedium mit 10 % FBS wesentlich schneller, was dazu führte, dass am Ende der Versuche mit 25 000 und 30 000 Zellen/Well ein Teil der Zellen bereits abgestorben war. Aus diesem Grund wurde auf eine Auswertung verzichtet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 5: Bestimmung der optimalen eingesetzten Zellzahl und des optimalen Gehaltes an FBS im Kultur­medium (n = 2)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 24: Bestimmung der optimalen eingesetzten Zellzahl bei 5 % FBS im Kulturmedium. Das Ergebnis der Messung bei 5000 Zellen /Well, c (R 1881) = 1×10-9 mol/l ist vermutlich auf einen Pipettierfehler zurückzuführen. (n = 2)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 25: Bestimmung der optimalen eingesetzten Zellzahl bei 10 % FBS im Kulturmedium (n = 2)

[...]

Details

Seiten
99
Erscheinungsform
Originalausgabe
Jahr
1999
ISBN (eBook)
9783832489816
ISBN (Buch)
9783838689814
Dateigröße
1.8 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v224140
Institution / Hochschule
Naturwissenschaftlich-Technische Akademie Isny im Allgäu – Chemie
Note
1,1
Schlagworte
mcf-7 ar-1 umwelt

Autor

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Titel: Bestimmung von androgenen und antiandrogenen Substanzen in wässrigen Umweltproben mit biologischen und chemischen Methoden