Präparation und Charakterisierung von klonalen, neuralen Zelllinien, welche das EGFP-Tau-Fusions-Protein stabil exprimieren

Kaltwaßer, Bernd

Präparation und Charakterisierung von klonalen, neuralen Zelllinien, welche das EGFP-Tau-Fusions-Protein stabil exprimieren

Zusammenfassung

Inhaltsangabe:Einleitung:
Das Zytoskelett ist eine der wichtigsten Determinanten der neuronalen Zytoarchitektur. Wechselwirkungen zwischen dem neuronalen Membrankortex und den Filamenten des Zytoskeletts sind wahrscheinlich stark an der Entwicklung und Degeneration von Nervenzellen beteiligt.
Die Fusion von Proteinen mit Fluorophoren wie EGFP ist eine geeignete Methode, um die Verteilung dieser Proteine innerhalb der lebenden Zelle zu beobachten. Die Entwicklung von stabil transfizierten PC12-Zellen mit einem EGFP-Tau-Fusionskonstrukt ermöglicht es daher, die Expression und subzelluläre Verteilung von Tau in lebenden Zellen zu studieren.

Ziel des Projektes war es zunächst, klonale, also genetisch identische Zelllinien zu erhalten, welche konstitutiv das EGFP-Tau-Fusionsprotein überexprimieren. Dafür war es notwendig die Zellen durch Einzelzellverdünnnungsexperimente aus einem Gemisch unterschiedlicher Zelltypen zu isolieren. Die so erhaltenen Zellklone sollten durch protein-biochemische Methoden auf den Grad der Überexpression und das Vorhandensein vollständiger Fusionskonstrukte überprüft werden.
Immunfluoreszenzmikroskopische Beobachtungen der Ausgangskultur legten im Verlaufe des Projektes schließlich nahe, das Ziel des Projektes neu zu definieren. Nunmehr sollte der Nachweis geführt werden, ob Schwankungen in der Expression des EGFP-Tau-Fusionsproteins durch den Zellzyklus bedingt waren oder durch andere Faktoren beeinflusst wurden. Außerdem sollte überprüft werden, ob die Zellen der Ausgangskultur das Fusionskonstrukt funktionell korrekt und vollständig exprimieren. Weiterhin sollte untersucht werden, ob das EGFP-Tau-Fusionsprotein mit den Mikrotubuli assoziiert.

Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
Inhaltsverzeichnis6
Abkürzungsverzeichnis8
Einleitung11
1.Das Zytoskelett12
2.Die Mikrotubuli12
3.Das Protein Tau13
4.Neurodegenerative Erkrankungen15
5.Die PC12-Zelllinie17
6.Das Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)18
7.Fragestellung und Ziel der Arbeit19
Material und Methoden21
1.Materialen und Geräte21
1.1Chemikalien21
1.2Verwendete Zelllinien21
1.3Puffer, Medien, Lösungen22
1.3.1Zellkultur22
1.3.2Immunfluoreszenzmikroskopie24
1.3.3Biochemische Analysen27
1.4Antikörper und Chemikalien zur Färbung30
1.4.1Primäre Antikörper30
1.4.2Sekundäre Antikörper31
1.4.3Chemikalien zur […]

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

ID 8496

Kaltwaßer, Bernd: Präparation und Charakterisierung von klonalen, neuralen Zelllinien,

welche das EGFP-Tau-Fusions-Protein stabil exprimieren

Hamburg: Diplomica GmbH, 2004

Zugl.: Universität Osnabrück, Bachelorarbeit, 2004

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Diplomica GmbH

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Printed in Germany

Studium

2004

Akademischer Grad:

Bachelor of Science ,,Biologie der Zelle"

Studiengänge:

2001 -

,,Biologie" (Diplom)

2004 -

,,Biologie der Zelle" (Master of Science)

Berufliche Entwicklung

2001

Prüfung zum staatlich anerkannten Rettungssanitäter

2001

Arbeit als Rettungssanitäter beim DRK Kreisverband Lingen e.V.

2000 - 2001

Zivildienst als Rettungshelfer beim DRK Kreisverband Lingen

e.V. ( Abteilung Rettungsdienst )

Fort und Weiterbildung

2004

Sprachkurs ,,Schwedisch" an der VHS Osnabrück

2003

Schulung zum Zoopädagogen im Zoo Osnabrück

Kenntnisse und Fertigkeiten

Soziales

Ehrenamtliche Mitarbeit als Rettungssanitäter im Rettungsdienst

des Landkreises Emsland

Mitarbeit in den Einsatzgruppen Wasserrettung / Sanitätsdienst

der DLRG Ortsgruppe Lingen e.V.

Mitarbeit in der DPSG Lingen

Sport

Teilnahme am Hochschulsportprogramm der Universität

Osnabrück

Mitglied der DLRG Lingen

Sprachen

Englisch: Präsentationssicher in Wort und Schrift

Französisch: vertiefte Kenntnisse in Wort und Schrift

Schwedisch: Grundkenntnisse in Wort und Schrift

Interessenschwerpunkte

Neurobiologie Anfertigung der Abschlussarbeit zum B.Sc. ,,Biologie der Zelle"

Thema: ,,Charakterisierung und Präparation von klonalen,

neuralen Zelllinien, welche das EGFP-Tau Fusionsprotein stabil

exprimieren"

Genetik

Erwerb vertiefter Kenntnisse genetischer Arbeitsmethoden im

Verlaufe des Studiums

Der Durchbruch vollzieht sich in der zerebralen Zirkusmanege der Tetrapoden.

Hier wird von den letzten Triumphen der Sippe berichtet.

In den Synapsen des warmblütigen Wirbeltieres knallen die ersten

Champagnerkorken.

Postmoderne Primaten erhalten am Ende den großen Überblick.

Und verzweifeln nicht: Das Universum sieht sich selbst im Weitwinkel.

Jostein Gaarder

Sr. Johannis

Die vorliegende Arbeit hätte ohne die Unterstützung vieler Menschen nicht geschrieben werden

können. Daher gilt mein Dank zunächst Herrn Prof. Dr. Brandt, für die Überlassung eines ebenso

interessanten wie reizvollen Themas. Ihm und Frau Dr. Monika Hundelt möchte ich auch für die

Bereitschaft diese Arbeit zu prüfen danken.

Den Mitarbeitern der Abteilung Neurobiologie ist es gelungen eine Arbeitsatmosphäre zu schaffen,

die wesentlich zum Gelingen des Projektes beigetragen hat. Außerordentliche Hilfsbereitschaft und

jederzeitige Unterstützung sind nur zwei Punkte, für die ich diesen Menschen Dank schulde.

Besonderes hervorzuheben ist in diesem Zusammenhang die Bereitschaft Carina Weismanns, die

direkte Betreuung meines Projektes zu übernehmen.

Prof. Dr. Roland Brandt, Dr. Monika Hundelt, Carina Weissmann und Ursula Wempe gebührt

besonderer Dank und Respekt für die kritische Korrektur der vorliegenden Arbeit. Alle Fehler die sich

jetzt immer noch im Text befinden, liegen daher ausschließlich in meiner Verantwortung.

Zu erwähnen sind auch noch Jessica Koch und Ann-Theres Lüttkoff, die zeitgleich mit mir ihre

Bachelor-Arbeiten verfassten und mir oft hilfreich zur Seite standen.

Abschließend gilt noch ein besonderer Dank meinen Eltern und meiner Familie ohne deren

finanzielle und ideelle Unterstützung ein Studium der Biologie nicht durchzuführen wäre. Kathrin

Witzenberger möchte ich danken für all die Rücksichtnahme und Hilfe, die sie mir während des

Entstehens dieser Arbeit hat zuteil werden lassen. Durch sie ist die Strecke bis zum Mond nicht mehr

gar so weit.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ...6

Abkürzungsverzeichnis ...8

Einleitung ...11

1 Das

Zytoskelett ...12

2 Die

Mikrotubuli ...12

3 Das Protein Tau...13

4 Neurodegenerative

Erkrankungen...15

5 Die

PC12-Zelllinie ...17

6 Das ,,Enhanced Green Fluorescent Protein" (EGFP) ...18

7 Fragestellung und Ziel der Arbeit...19

Material und Methoden ...21

1 Materialen und Geräte ...21

1.1 Chemikalien ...21

1.2 Verwendete Zelllinien ...21

1.3 Puffer, Medien, Lösungen...22

1.3.1 Zellkultur... 22

1.3.2 Immunfluoreszenzmikroskopie... 24

1.3.3 Biochemische Analysen ... 27

1.4 Antikörper und Chemikalien zur Färbung ...30

1.4.1 Primäre

Antikörper ... 30

1.4.2 Sekundäre Antikörper... 31

1.4.3 Chemikalien

zur

Fluoreszenzfärbung... 31

1.5 Verbrauchswaren...31

1.5.1 Glaswaren ... 31

1.5.2 Plastikwaren ... 32

1.6 Geräte...32

1.7 Software...36

2 Methode ...37

2.1 Zellkultur ...37

2.1.1 Kultur

von PC-12 Zellen ... 37

2.1.2

Bechichtung von Zellkulturschalen mit Kollagen... 38

2.1.3 Auftauen

von Zellen ... 38

2.1.4 Zellzahlbestimmung

und

Vereinzelung von Zellen ... 39

Inhaltsverzeichnis

2.1.5 Synchronisation von Zellpopulationen mittels serumfreien Mediums ... 40

2.1.6 Zellsynchronisation

mittels Zugabe von Colchizin ... 41

2.2 Immunfluoreszenzmikroskopie ...41

2.2.1

Beschichtung von Deckgläschen mit Poly-L-Lysin ... 41

2.2.2

Standardfixierung von Zellen auf Deckgläschen... 42

2.2.3 Extraktionsfixierung

von Zellen auf Deckgläschen ... 42

2.2.4 Immunchemische

Färbung und Einbettung ... 43

2.2.5 Mikroskopische Auswertung ... 44

2.3 Protein-biochemische Untersuchungen...44

2.3.1 Präparation

von Zelllysaten... 44

2.3.2

Proteinbestimmung mittels der Bicinchoninsäure-Methode (,,BCA-Assay") ... 45

2.3.3 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ( ,,SDS-PAGE" )... 46

2.3.4 Proteintransfer durch Elektroblot (,,Westernblot") ... 47

2.3.5 Immundetektion ... 48

2.3.6 Entfernung

gebundener Antikörper von einer PVDF-Membran ... 49

Ergebnis ...50

1 Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Dauerkultur ...50

2 Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Subklonierungskulturen ...58

3 Ergebnis der Zellsynchronisationsversuche ...60

3.1 Zellsynchronisation mittels serumfreien Mediums ...61

3.2 Zellsynchronisation mittels Kolchizin ...64

4 Protein-biochemische Analyse der Dauerkultur ...66

Diskussion ...71

1 Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Dauerkultur ...71

2 Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Subklonierungskulturen ...73

3 Zellsynchronisationsversuche ...75

3.1 Zellsynchronisationsversuche mittels serumfreien Mediums...75

3.2

Zellsynchronisation mittels Kolchizin

... 76

4 Protein-biochemische

Untersuchungen...78

5 Zusammenfassung ...80

6 Ausblick ...81

Anhang ...84

1 Auszählungsergebnisse im Rahmen der Dauerkultur ...84

2 Auszählungsergebnisse im Rahmen der Subklonierungsexperimente ...90

3 Auszählungsergebnisse im Rahmen der Zellsynchronisation mit serumfreien Medium 92

4 Auszählungsergebnisse im Rahmen des Zellsynchronisation mit Kolchizin ...94

Literaturverzeichnis ...96

Abkürzungsverzeichnis

µg Mikrogramm

Arbeitsgemeinschaft

AMCA

Aminomethyl-Cumarin-Acetat

APS

Ammoniumperoxodisulfat

Amyloidprotein

BCA

Bicinchoninacid

Bicinchoninsäure

BSA

bovine serum albumin

Rinderserumalbumin

CDKs

Cycline-dependant Kinases

cyklin-abhängige Kinasen

C-terminal

carboxyterminal

Indocarbocyanin

days

Tage

DAPI

4',6-Diamidino-2-phenylindol

DMEM

Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium

DNA

Desoxyribonucleinacid

Desoxyribonukleinsäure

ECL

Enhanced Chemiluminescence

verstärkte Chemilumineszenz

EGF

Enhanced Green Fluorescent

verbessertes grün fluoreszierendes

EGFP

Enhanced Green Fluorescent Protein

verbessertes grün fluoreszierendes Protein

ELISA

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

et al.

et alii

und andere

Abkürzungsverzeichnis

GFP

grün fluoreszierendes Protein

ggf.

gegebenenfalls

Gly

Glycin

hours

Stunden

HRP

horse-raddish-peroxidase

Meerettichperoxidase

Immunofluoreszenz

kDa

Kilodalton

mAK

monoklonaler Antikörper

MAP

mikrotubuli-assoziiertes Protein

MAPs

mikrotubuli-assoziierte Proteine

Milliliter

Millimolar

mRFP

monomers rot fluoreszierndes Protein

NFTs

Neurofibrillary tangles

Neurofinbrilläre Bündel

NGF

Nerve Growth Factor

Nerven-Wachstumsfaktor

Nanometer

NP-40

Nonidet P-40

N-terminal

aminoterminal

PAGE

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

pAK

polyklonaler Antikörper

PBS

Phosphate buffered saline

Phosphat-gepufferte Salzlösung

polyclonal

polyklonal

PC12

Bezeichnung einer Zelllinie, welche aus

einem Phäochromocytom gewonnen wurde

PHFs

paired helical filaments

paarige helikale Filamente

PNS

peripheres Nervensystem

Abkürzungsverzeichnis

PVDF

Polyvinylidendifluorid

Serin

siehe

s.S.

siehe Seite

SDS

Sodium-Dodecyl-Sulfate

Natriumdodecylsulfat

Threonin

TBS

Tris-buffered saline

Tris-gepufferte Salzlösung

TEMED

N,N,N',N'-Tetramethylethylethylendiamin

Tyr

Tyrosin

ultraviolet

Wildtyp

z. B.

zum Beispiel

ZNS

zentrales Nervensystem

GFP

anti Green Fluorescent Protein

gegen grün fluoreszierendes Protein gerichtet

Einleitung

1. Das Zytoskelett

Ein Hauptmerkmal neuronaler Zellen ist ihre Organisation in ein somatodendritisches und

ein axonales Kompartiment. Das Zytoskelett ist maßgeblich an der Bildung dieser

morphologischen Besonderheit beteiligt. Seine Integrität ist nicht nur für die

Aufrechterhaltung der strukturellen Rahmenbedingungen der Zellpolarität, sondern auch für

das Überleben der gesamten Zelle von höchster Bedeutung (Übersichtsartikel: Brandt 2000).

Im Zytoskelett der Nervenzelle finden sich drei verschiedene fibrilläre Hauptkomponenten:

die Mikrotubuli, die Neurofilamente sowie die Mikrofilamente (Übersichtsartikel: Pollard

2003). Mikrotubuli werden in vivo aus 13 spezifisch angeordneten Protofilamenten gebildet,

welche wiederum aus mehreren linearen

- und

-Tubulinuntereinheiten bestehen. Sie sind

z.B am schnellen axonalen Transport beteiligt. Die Neurofilamente sind für Nervenzellen

spezifische, polymerisierte und äußerst stabile Strukturen, welche die Hauptstützelemente der

Zelle bilden. Ihre Monomere bestehen aus Proteinen unterschiedlicher Größe, die sich zu

helikalen Filamenten zusammensetzen. Mikrofilamente sind dynamische Strukturen, die aus

zwei helikal gewundenen Strängen aufgebaut sind, welche durch polare Aktinuntereinheiten

gebildet werden. Vor allem in Nähe der Zellmembran auftretend, dienen sie der Verankerung

von Proteinen, erlauben Zellbewegung und verleihen der Zelle Festigkeit (Übersichtsartikel:

Kandel et al. 2000).

2. Die Mikrotubuli

Mikrotubuli spielen eine Schlüsselrolle in der Ausbildung und Aufrechterhaltung von

Zellfortsätzen (Übersichtsartikel: Kinoshita et al. 2002) und sind während der Mitose

wesentlich an der Ausbildung des Spindelapparates beteiligt (Übersichtsartikel: Amos 2004).

Durch die polare Struktur der Tubulinheterodimere wird ein Plus- und ein Minusende des

Polymers gebildet, das sich in spezifischer Weise innerhalb der Zelle orientiert. Während am

Plusende, also in Richtung des

-Tubulinendes, Phasen von schneller Polymerisation und

Depolymerisation auftreten, ist in der Zelle das Minusende häufig am Centrosom verankert

Einleitung

(Doxsey 2002; Howard & Hyman 2003). Die hochdynamischen Mikrotubuli finden sich

sowohl in sich entwickelnden, als auch in reifen Axonen. Die höhere Stabilität in reifen

Axonen wird dabei durch so genannte mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) gewährleistet.

Das Vorkommen und die Verteilung von MAPs ist dabei innerhalb der verschiedenen

Kompartimente unterschiedlich. So kommt zum Beispiel das MAP Tau, welches an vielen

neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt ist, in der intakten Zelle hauptsächlich im Axon

vor (Kandel et al. 2000). Die MAPs erfüllen auch weitergehende Aufgaben. So verknüpfen

sie die Mikrotubuli zum Beispiel mit der Plasmamembran oder den Neurofilamenten.

3. Das Protein Tau

Das Protein Tau ist ein niedermolekulares mikrotubuli-assoziiertes Phosphoprotein,

welches 1975 auch im Menschen entdeckt wurde (Weingarten et al. 1975; Cleveland et al.

1977). Im zentralen Nervensystem (ZNS) lassen sich insgesamt sechs verschiedene

Tauisoformen nachweisen. Diese stammen alle vom gleichen Gen ab, dessen Sequenz auf

dem Locus 17q21 liegt. Sie werden durch alternatives Spleißen der Exons 2, 3 und 10

posttranslationell modifiziert. Eine detaillierte Übersicht der verschiedenen Isoformen findet

sich in Abbildung 1.1. Es ist eine hochmolekulare Isoform bekannt, welche nur im peripheren

Nervensystem (PNS) exprimiert wird.

Abbildung 1.1: Schematische Darstellung des humanen Tau-Gens und der sechs im ZNS

vorkommenden Tau-Isoformen. Human-Tau enthält insgesamt 16 Exons, das Exon 0, welches Teil

des Promotors ist, eingeschlossen. Die Exons E6 und E8 werden im humanen ZNS nicht transkribiert.

Das Exon E4a wird nur im PNS transkribiert und ist Bestandteil der hochmolekularen Tauisoform. Mit R1

bis R4 sind die Wiederholungssequenzen innerhalb der mikrotubulibindenden Domäne bezeichnet. Die

relativen Größen der Exons und Introns sind nicht maßstabsgerecht. Darstellung nach: Lee, Goedert,

Trojanowski 2001.

Einleitung

Das Molekulargewicht der niedermolekularen Isoformen liegt zwischen 50 und 70kDa,

jenes der hochmolekulare Isoform bei etwa 120kDa (Kosik et al. 1989, Goedert et al 1989,

Goedert et al. 1991; Andreadis et al. 1992). Im embryonalen Hirn ist nur die kürzeste Isoform

nachweisbar, während im adulten Hirn alle Isoformen zu finden sind (Lee et al. 2001) Für die

Funktion der Tauproteine sind unter anderem die mikrotubulibindende Domäne, die

prolinreiche sowie die carboxyterminale Region von Bedeutung. Ihre Position ist in

Abbildung 1.2 skizziert. In der C-terminalen Hälfte sind drei oder vier sich unvollständig

wiederholende Sequenzen mit einer Länge von 31 32 Aminosäuren nachweisbar (Lee et al.

1989).

Die zweite Sequenz (R2) wird dabei durch das Exon 10 codiert, welches nicht in allen

Isoformen vorhanden ist (Lee et al. 1989). Mit einer Zunahme der Anzahl der

Sequenzwiederholungen nimmt auch die Bindungsaffinität gegenüber Mikrotubuli zu (Butner

& Kirschner 1991; Goode & Feinstein 1994; Goode et al. 2000). Die prolinreiche Region ist

essentiell für eine de novo Assemblierung von Mikrotubuli. Die Bindung von Tau an

Mikrotubuli wird durch diese Region verstärkt (Brandt & Lee 1993; Gustke et al. 1994;

Goode et al. 1997). Sie enthält nicht nur eine weitere Bindestelle für Mikrotubuli, sondern

bietet auch mehrere Angriffspunkte für Kinasen (Trinczek et al. 1995).

Obwohl Tau auch in Astrozyten und Oligodendrozyten vorkommt, ist es doch

hauptsächlich in Neuronen zu finden (Couchie et al. 1985; Papasozomenos & Binder 1987;

LoPresti et al. 1995). Innerhalb der Neurone ist Tau im axonalen Kompartiment angereichert

(Binder et al. 1985; Brion et al. 1988).

Abbildung 1.2: Funktionelle Regionen der Primärstruktur des Tauproteins. Es ist möglich

bestimmte Eigenschaften des Proteins spezifischen Regionen zuzuordnen. Die Schemazeichnug

bezieht sich hier auf das humane Wildtyp-Tau mit 441 Aminosäuren. Die eingezeichneten Domänen

sind nicht maßstabsgerecht. Darstellung nach: Fath 2002.

Einleitung

Der Phosphorylierungsgrad von Tau ist abhängig von der Lage in der Zelle. Mit

zunehmender Nähe zum Soma nimmt der Phosphorylierungsgrad zu (Mandel & Baker 1996).

Auch Zellstress beeinflusst den Phosphorylierungszustand von Tau (Goedert et al. 1997;

Jenkins et al. 2000).

Der Phosphorylierungszustand des Tau beeinflusst dessen Eigenschaften. Eine erhöhte

Phosphorylierung von Tau kann zur Schwächung oder Verhinderung der Tau-Mikrotubuli-

Bindung, zu einer schlechteren Mikrotubuli-Assemblierung und zur Instabilität der

Mikrotubuli führen. (Lindwall & Cole 1984; Drechsel et al. 1986; Drubin & Kirschner 1986;

Hagestedt et al. 1989; Biernat et al. 1993; Brandt et al. 1994; Trinczek et al. 1995).

Ein weiterer Faktor, der den Phosphorylierungszustand von Tau beeinflusst, ist das Alter.

Fötale Tauproteine sind wesentlich stärker phosphoryliert, als adulte (Madhumalti et al.

1994). Daher lässt sich vermuten, dass die Funktionen von Tau während der Entwicklung der

Zelle nicht nur durch seine Isoform, sondern auch durch seinen Phosphorylierungszustand

reguliert werden.

Neuere Experimente mit Tau-Knock-out Mäusen liefern teils widersprüchliche Ergebnisse.

Sie lassen insgesamt allerdings vermuten, dass einige Funktionen von Tau, wie z. B sein

stabilisierender Einfluss auf Mikrotubuli, bei Fehlen von Tau durch eine Überexpression

anderer MAPs von diesen übernommen werden könnten. Auch wenn es Hinweise darauf gibt,

dass sich in vitro beobachtetete Eigenschaften von MAPs von den in vivo Funktionen

unterscheiden, so scheint MAP1B in diesem Zusammenhang eine Schlüsselrolle

zuzukommen. (Barlow et al. 1994; Harada et al. 1994; Dawson et al. 2001; Takei et al. 2001)

Es sind noch weitere Funktionen von Tau bekannt. So wurde zum Beispiel nachgewiesen,

dass die aminoterminale Domäne mit dem Membrankortex interagieren kann. (Brandt et al.

1995). Außerdem scheint Tau über Mittlerproteine mit dem Aktin-Zytoskelett interagieren zu

können (Cunningham et al. 1997). Zudem könnte Tau durch die Beeinflussung von

spezifischen Signalkaskaden die Form der Zelle verändern und auch an der Entwicklung und

Erhaltung der neuronalen Polarität beteiligt sein (Lee et al. 1998; Sontag et al.1999; Liao et al.

1998).

Einleitung

4 Neurodegenerative Erkrankungen

Eine Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen ist unter anderem durch

charakteristische Veränderungen am Protein Tau gekennzeichnet. Eine Übersicht findet sich

in der Tabelle 1.1.

Im weiteren Verlauf sollen einige typische Phänomene am Beispiel der

Erkrankung Morbus Alzheimer beschrieben werden.

Die so genannte Alzheimersche-Erkrankung wurde nach Alois Alzheimer (1864-1915),

welcher die Krankheit im Jahre 1906 erstmals wissenschaftlich beschrieben hat, benannt

(Alzheimer 1906). Das Krankheitsbild ist gekennzeichnet durch Störungen des Denk- und

Urteilsvermögens sowie Gedächtnis- und Orientierungsverluste, die die Bewältigung eines

normalen Alltagslebens immer weiter erschweren.

Histologische Veränderungen, die während der Alzheimer-Krankheit auftreten, sind vor

allem das Auftreten von extrazellulären Plaques, bestehend aus aggregierten Peptiden des

Amyloidproteins (A

), und von intrazellulären neurofibrillären Bündel (,,neurofibrillary

tangles" NFTs) aus paarigen helikalen Filamenten (,,paired helical filaments" PHFs), die

wiederum aus Tau aufgebaut sind.

Neurodegenerative Erkrankung, die mit der Bildung von Alzheimerfibrillen assoziiert ist:

Morbus Alzheimer (sporadische / familiäre Form)

Amyotrophe Lateralsklerose

Erkrankung mit argyrophilen Körperchen

Corticobasale Degeneration

Pugilistica Demenz

Diffuse Alzheimerfibrillen mit Kalzifizierung

Trisomie 21 / Down-Syndrom

Mit dem Chromosom 17 assoziierte frontotemporale Demenz mit Parkinson (FTDP-17)

Gerstmann-Straussler-Schenker-Krankheit

Hallervorden-Spatz-Krankheit

Creutzfeld-Jakob-Krankheit

Multiple Systematrophie

Niemann-Pick-Krankheit (Typ C)

Morbus Pick

Prion-Protein-Erkrankung

Progressive supranukleäre Blickparese

Subakute sklerotisierende Panencephalitis

Tabelle 1.1: Beispielhafte Aufzählung einiger neurodegenrativer Erkrankungen, die mit der

Bildung von neurofibrillären Bündeln (,,Alzheimer-Fibrillen") einhergehen.

Einleitung

Entnommen aus: Trojanowski & Lee 1999

Diese pathologischen Veränderungen sind zunächst im entorhinalen Kortex nachweisbar,

breiten sich aber im Verlaufe der Erkrankung auch auf den Hippokampus und den Isokortex

aus. Auffällig ist auch eine Verringerung der synaptischen Dichte, sowie ein Neuronenverlust

in bestimmten Hirnarealen (Braak et al. 1993).

Tau weist in NFTs ungewöhnliche posttranslationelle Veränderungen auf. Unter anderem

ist schon frühzeitig eine verstärkte Phosphorylierung nachweisbar (Buee et al. 2000).

Während Tau normalerweise einen Phosphatgehalt von rund 1,9mol Phosphat pro mol Protein

aufweist, beträgt dieser Wert im hyperphosphorylierten Tau das Drei- bis Vierfache

(Kennessey & Yen 1993). Hyperphosphoryliertes Tau ist im gesamten Neuron gleichmäßig

verteilt (Braak & Braak 1991). Die Phosphorylierung von Tau führt zu einer graduellen oder

totalen Abnahme der Mikrotubulibindefähigkeit und hat somit ebenfalls Auswirkungen auf

die Interaktionsfähigkeit mit der Membran, sowie mit anderen Proteinen. (Illenberger et al.

1998; Takahashi et al. 2003) Die verstärkte Phosphorylierung von Tau lässt sich nicht auf

eine einzelne Kinase zurückführen, vielmehr könnte sowohl eine Zunahme von

Kinaseaktivitäten als auch eine Abnahme von Phosphataseaktivitäten hierfür verantwortlich

sein (Trojanowski & Lee 1995). Dabei sind die Auswirkungen auf die Neubildung von

Mikrotubuli stärker als der Einfluss auf das Wachstum bestehender Mikrotubuli (Brandt et al.

1994; Léger et al. 1997; Maas et al. 2000; Eidenmüller et al. 2000).

Noch ist unbekannt, ob die Veränderungen von Tau in Tauopathien lediglich ein Teil des

Krankheitsverlaufs sind und somit nur einen unspezifischen Seiteneffekt darstellen, oder ob

sie für die Neurodegeneration ursächlich sind. Auch der genaue Mechanismus, wie Tau den

Krankheitsverlauf auslösen bzw. beeinflussen könnte, ist nicht bekannt. Eine Hypothese

(,,loss of function") besagt, dass Tau durch bestimmte Ereignisse, wie z.B. Mutationen,

Veränderungen des Phosphorylierungszustandes oder andere Ereignisse, nicht mehr in der

Lage ist an Mikrotubuli zu binden. Die Mikrotubuli werden durch das fehlende Tau nicht

länger stabilisiert und beginnen zu depolymerisieren. Dadurch kommt es zu Störungen im

axonalen Transport, was schließlich in einer Degeneration des Neurons mündet. Kernpunkt

dieser Theorie ist die Voraussetzung, dass Tau für die Stabilität der Mikrotubuli unverzichtbar

ist (Shahani & Brandt 2002). Dies ist auf Grund verschiedener experimenteller Evidenzen

aber sehr fraglich So konnte z. B. bei Tau-Knock-out-Mäusen beobachtet werden, dass sich

diese, trotz des fehlenden Taus normal entwickeln. Nur in kleineren Axonen war die

Einleitung

Mikrotubulistabilität verringert. Außerdem wurde nachgewiesen, das Tau in der Nähe des

distalen Axons angereichert wird. Hier sind die Mikrotubuli aber am dynamischsten. (Black et

al. 1996; Kempf et al. 1996; Mandell & Banker 1996; Harada et al. 1994).

Einen anderen Ansatz verfolgt die Hypothese, dass Tau nicht etwa seine Funktion verlöre,

sondern toxisch wirkt (,,toxic gain of function"). Möglicherweise wird dieser toxische Effekt

durch eine Störung des axonalen Transports bzw. anderer essentieller Funktionen vermittelt

oder aber direkt durch Veränderungen des Proteins Tau, wie z. B. Hyperphosphorylierung

verursacht. Auch wenn bisher nur wenige experimentelle Evidenzen über das

Aggregationsverhalten von hyperphosphoryliertem Tau vorliegen, gibt es doch Hinweise

darauf, dass die Konzentration von Tau in diesem Zusammmenhang ein kritischer Faktor ist.

Während eine fünf- bis zehnfach erhöhte Taukonzentration zu mehr Tauaggregaten führt, als

normal, so ist dies bei einer nur zweifach erhöhten Konzentration nicht der Fall. (Götz et al.

1995; Goedert et al. 1996; Brion et al. 1999; Ishihara et al. 1999; Schneider et al. 1999). Eine

Hyperphosphorylierung von Tau könnte zu einer Zunahme des Anteils von freiem Tau führen

(Brandt 2001). Denkbar wäre auch ein direkter toxischer Effekt durch die

Hyperphosphorylierung. Dem widerspricht allerdings die Beobachtung, dass sich die

Hyperphosphorylierung in bisherigen Experimenten eher neutral oder hemmend auf die Tau-

Aggregation auswirkte (Goedert et al. 1996, Schneider et al. 1999). Außerdem ließ sich bisher

auch kein Zusammenhang zwischen Bildung von NFTs einerseits und Phosphorylierung von

Tau andererseits erkennen. Unter Umständen wäre es daher möglich, dass der Körper durch

eine Aggregation des Giftstoffes Tau versucht dessen toxische Wirkung einzugrenzen.

Therapieansätze, die auf eine Verhinderung der Entstehung von NFTs zielen, würden dann

einen verstärkten Zelltod verursachen. (Brandt 2001).

5 Die PC12-Zelllinie

Bei der PC12-Zelllinie handelt es sich um Zellen, die aus einem Tumor des

Nebennierenmarks der Ratte isoliert wurden. Bei dem Phäochromocytom mutierten die

chromaffinen Zellen der Nebenniere. Die Zelllinie wurde 1976 erstmals beschrieben und

weist einen homogenen, nahezu diploiden Chromosomensatz mit insgesamt 40 Chromosomen

auf. Werden PC12-Zellen mit bestimmten Stoffen, wie zum Beispiel dem Wachstumsfaktor

,,Nerve Growth Factor" (NGF) behandelt, so zeigen sie Eigenschaften, wie sie für

sympathische Neurone typisch sind. Sie bilden neuritenähnliche Fortsätze und verhalten sich

Einleitung

postmitotisch. Wird das NGF wieder abgesetzt, so degenerieren die Zellfortsätze. PC12-

Zellen sind in der Lage die Neurotransmitter Adrenalin und Dopamin zu synthetisieren und zu

speichern (Greene & Tischler 1976).

6 Das ,,Enhanced Green Fluorescent Protein" (EGFP)

Beim Protein EGFP handelt es sich um eine Variante des grün fluoreszierenden Proteins

GFP. Das 238 Aminosäuren lange GFP verfügt über ein Molekulargewicht von 27kDa

(Shimomura 1979; Prasher et al. 1994). GFP stammt aus der biolumineszenten Qualle

Aequorea victoria

. Die Biolumineszenz der Qualle ist auf eine Interaktion zweier Proteine,

des Aequorin und des GFP zurückzuführen (Shimomura et al. 1962). Für die grüne

Lumineszenz ist Aequorin nicht essenziell, stattdessen kann gereinigtes GFP auch durch

Bestrahlung mit UV-Licht zur Fluoreszenz angeregt werden. Da GFP auch ohne weitere

Kofaktoren oder Substrate fluoresziert, kann es auch zur Visualisierung in artfremden Zellen

genutzt werden (Chalfie et al. 1994).

Im Jahre 1996 gelang es, die rekombinante Struktur des Wildtyp-GFPs zu charakterisieren.

Die zylinderförmige Anordnug von elf außen liegenden

-Faltblättern (,,

-sheets") und einer

innen liegenden

-Helix wird von kurzen helikalen Segmenten an den Enden des Zylinders

geschützt. Diese zylinderförmige Struktur des GFP, wie sie in Abbildung 1.3 dargestellt ist,

wurde als ,,

-can Faltblattstruktur" bezeichnet. Sie schützt einerseits das Chromophor vor

äußeren Einflüssen wie Enzymen oder biochemischen Änderungen in der Wirtszelle,

andererseits schützt sie die Wirtszelle vor schädigenden Interaktionen, die vom Chromophor

ausgehen könnten (Yang et al. 1996).

EGFP ist durch die Mutation S65T charakterisiert. Die Mutation verursacht nicht nur eine

um den Faktor dreißig erhöhte Lumineszenz, sondern führt zusätzlich zu einem einzelnen

Anregungsoptimum bei einer Wellenlänge um 488nm (Heim et al. 1995).

Einleitung

Abbildung 1.3:

-can-Struktur des GFP. A: zweidimensionale Struktur des GFP. Als blaue Pfeile

dargestellt sind die

-Faltblätter, rot dargestellt sind einzelne Komponenten des Fluorophores. B: ein

dreidimensionales Faltungsschema des GFP. Die außen liegenden

-Faltblätter sind grün, das innen

liegende fluorophore Element rot dargestellt. Quelle: Palm 2002.

7 Fragestellung und Ziel der Arbeit

Das Zytoskelett ist eine der wichtigsten Determinanten der neuronalen Zytoarchitektur.

Wechselwirkungen zwischen dem neuronalen Membrankortex und den Filamenten des

Zytoskeletts sind wahrscheinlich stark an der Entwicklung und Degeneration von

Nervenzellen beteiligt.

Die Fusion von Proteinen mit Fluorophoren wie EGFP ist eine geeignete Methode, um die

Verteilung dieser Proteine innerhalb der lebenden Zelle zu beobachten. Die Entwicklung von

stabil transfizierten PC12-Zellen mit einem EGFP-Tau-Fusionskonstrukt ermöglicht es daher,

die Expression und subzelluläre Verteilung von Tau in lebenden Zellen zu studieren.

Ziel des Projektes war es zunächst, klonale, also genetisch identische Zelllinien zu

erhalten, welche konstitutiv das EGFP-Tau-Fusionsprotein überexprimieren. Dafür war es

notwendig die Zellen durch Einzelzellverdünnnungsexperimente aus einem Gemisch

unterschiedlicher Zelltypen zu isolieren. Die so erhaltenen Zellklone sollten durch protein-

biochemische Methoden auf den Grad der Überexpression und das Vorhandensein

vollständiger Fusionskonstrukte überprüft werden.

A B

Einleitung

Immunfluoreszenzmikroskopische Beobachtungen der Ausgangskultur legten im Verlaufe

des Projektes schließlich nahe, das Ziel des Projektes neu zu definieren. Nunmehr sollte der

Nachweis geführt werden, ob Schwankungen in der Expression des EGFP-Tau-

Fusionsproteins durch den Zellzyklus bedingt waren oder durch andere Faktoren beeinflusst

wurden. Außerdem sollte überprüft werden, ob die Zellen der Ausgangskultur das

Fusionskonstrukt funktionell korrekt und vollständig exprimieren. Weiterhin sollte untersucht

werden, ob das EGFP-Tau-Fusionsprotein mit den Mikrotubuli assoziiert.

Material und Methoden

1 Materialien und Geräte

1.1 Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien wurden, soweit nicht anders vermerkt, von den Firmen

Merck KGaA (Darmstadt), Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe), Sigma-Aldrich

Laborchemikalien GmbH (Seelze); Mallinckrodt Baker Deutschland, Griesheim oder Riedel-

de Haen (ein Geschäftsbereich der Honeywell Seelze GmbH, Seelze) bezogen. Die im

Rahmen der Zellkultur verwendeten Produkte stammten von der Invitrogen GmbH

(Karlsruhe). Die Herstellung von Reinstwasser wurde durch das Milli Q System (Millipore

GmbH, Schwalbach) gewährleistet. Flüssiger Stickstoff wurde von der Firma Air Liquide

GmbH (Düsseldorf) bezogen.

1.2 Verwendete Zelllinien

PC12 Zelllinie mit folgenden Konstrukten:

PC12-Zellklon ,,IVC4":

PC12-Zelllinie mit EGFP-human-wt-Tau441

Fusionsprotein stabil transfiziert.

Hergestellt von Carina Weissmann, AG R. Brandt

PC12-Zellklon ,,ID2":

PC12-Zelllinie mit EGFP- human-wt-Tau441

Fusionsprotein stabil transfiziert.

Hergestellt von Carina Weissmann, AG R. Brandt

PC12-Zellklon ,,IIC6":

PC12-Zelllinie mit EGFP- human-wt-Tau441

Fusionsprotein stabil transfiziert.

Hergestellt von Carina Weissmann, AG R. Brandt

Material und Methoden

PC12-Zellklon "IVD2":

PC12-Zelllinie mit EGFP- human-wt-Tau441

Fusionsprotein stabil transfiziert.

Hergestellt von Carina Weissmann, AG R. Brandt

1.3 Puffer, Medien, Lösungen

1.3.1 Zellkultur

a) Medien

Die Lagerung der zubereiteten Medien erfolgte bei 4°C. Folgende Einzelkomponenten

wurden bei 20°C gelagert: fetales Kälberserum (PAA Laboratories GmbH, Cölbe),

Pferdeserum (Biochrom AG, Berlin), Glutamin (PAA, Sigma), Penicillin- /

Streptomycinlösung (Invitrogen, PAA).

DMEM (Sigma) wurde bei einer Temperatur von 4°C gelagert.

Fetales Kälberserum und Pferdeserum wurden vor der Zubereitung des Mediums zunächst

für eine Stunde bei 56°C hitzeinaktiviert. Vor Gebrauch wurden die Medien im Wasserbad

auf 37°C erwärmt.

DMEM ,,all inclusive":

DMEM, mit:

Fetalem Kälberserum 10% (v/v)

Pferdeserum

5% (v/v)

Glutamin-Lösung (0,2M) 1% (v/v)

Penicillin- /Streptomycin-

lösung (100x;

10.000U Penicillin,

10mg/ml Streptomycin) 1% (v/v)

DMEM "serumfree":

DMEM, mit:

Glutamin-Lösung (0,2M) 1% (v/v)

Penicillin- /Streptomycin-

Lösung (100x) 1% (v/v)

Material und Methoden

DMEM "pure":

Reines Dulbeccos Modifiziertes Eagle

Medium High Glucose

b) Sonstige Lösungen

Fungizone

/ Amphotericin B Lösung:

250 UG/ml (Invitrogen)

Geneticin Selektionsmarker- bzw.

G418-Stammlösung:

Reinstwasser, mit

Geneticin,

aktives G418-Sulfat

(Invitrogen)

50 mg/ml

Kollagenlösung:

Reinstwasser, mit

Essigsäure, 99-100%

(Baker)

20mM

Kollagen-Stocklösung

aus einer Präparation

von Mausschwänzen,

0,2mg/ml

0,5% (v/v)

Phosphatgepufferte Salzlösung

(,,Phosphate Buffered Saline / PBS")

Zehnfach konzentrierte Stocklösung.

Reinstwasser mit

Natriumchlorid 80g/l

Kaliumchlorid 2g/l

KH2PO4 2g/l

Na2HPO4 · 2H2O

14,4g/l

Trypanblau-Lösung

Reinstwasser, mit

Trypanblau (Sigma)

0,4%

Trypsin-Lösung

Details

Seiten
Erscheinungsform: Originalausgabe
Erscheinungsjahr: 2004
ISBN (eBook): 9783832484965
ISBN (Paperback): 9783838684963
Dateigröße: 2.7 MB
Sprache: Deutsch
Institution / Hochschule: Universität Osnabrück – Biologie / Chemie
Note: 1,5
Schlagworte: alzheimer erkrankungen mikrotubuli protein pc-12 zellinie neurodegeneration
Produktsicherheit: Diplom.de

Autor

Bernd Kaltwaßer (Autor:in)

Präparation und Charakterisierung von klonalen, neuralen Zelllinien, welche das EGFP-Tau-Fusions-Protein stabil exprimieren

Zusammenfassung

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Autor

Bernd Kaltwaßer (Autor:in)