Interaktionsanalyse von Brix, einem Protein von Xenopus laevis, das in der Ribosomenbiogenese involviert ist
©2001
Diplomarbeit
92 Seiten
Zusammenfassung
Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
In dieser Arbeit wird ein Protein behandelt, dessen cDNA aus Xenopus laevis kloniert wurde und den Namen Brix trägt. Diese cDNA codiert für ein potentielles Polypeptid mit 339 Aminosäuren (Genbank Accession: AF319877). In den Genomen von Mensch, C.elegans, Hefe und Arabidopsis thaliana existieren hoch homologe ORFs.
Das Brix Protein lokalisiert im Nukleolus und den Cajal Bodies und interagiert mit 5S, 5,8S und 28S rRNA. In Saccharomyces cerevisiae codiert YOL077c (bzw. BRXl) für das Brix Homolog. YOL077c ist essentiell für das Wachstum der Zellen und lokalisiert ebenfalls im Nucleolus. Eine Expressionsverminderung von Brx1p inhibiert die Synthese der 60S ribosomalen Untereinheit und die Prozessierung der 35S prä- rRNA.
Ziel dieser Arbeit war es, Interaktionspartner von Brix mit Hilfe des Yeast Two- Hybrid Systems zu finden. Die Art dieser Interaktionspartner liefert Hinweise auf die zellulären Abläufe, in denen Brix involviert ist.
5 bekannte Proteine konnten als Two- Hybrid- Interaktionspartner identifiziert werden.
Alle Two- Hybrid- Interaktionspartner unterstützen die bisher experimentell gewonnenen Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Brix in der Ribosomenbiogenese und weisen auf eine Beteiligung von Brix sowohl in prä- rRNA Reifung und Ribosomenzusammenbau, als auch in Splicing und Modifikationen anderer RNAs hin.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.Einleitung3
2.Aufgabenstellung15
3.Material17
3.1Bakterienstämme17
3.2Hefestämme17
3.3Vektoren18
3.3.1Two- Hybrid- Vektoren18
3.3.2Matchmaker cDNA- Bank für Two- Hybrid- Screen19
3.3.3Reporterplasmid p8op-lacZ20
3.4Oligonucleotide für PCR und Sequenzierreaktionen21
3.5Chemikalien und Enzyme21
4.MEDIEN22
4.1Hefemedien22
4.1.1Medien generell22
4.1.2Medien für Two-Hybrid-Screen24
4.2Bakterienmedien25
5.METHODEN27
5.1Herstellung chemisch kompetenter E. coli27
5.2DNA- Präparationsmethoden28
5.2.1Plasmidisolierung aus E. coli: (Miniprep)28
5.2.2Plasmidisolierung aus Saccharomyces cerevisiae durch Sphäroplastierung30
5.3Polymerasekettenreaktion (PCR)31
5.4Klonierungsmethoden32
5.4.1Restriktionen32
5.4.2DNA-Gelelektrophorese33
5.4.3Elution von DNA aus Agarosegelstücken33
5.4.4Ligationen34
5.5Transformationsmethoden34
5.5.1Transformation von E. coli34
5.5.2Transformation von Saccharomyces cerevisiae35
5.6DNA- Sequenzierung36
5.7Two- Hybrid- Analyse37
5.7.1LexA- Two- Hybrid Transformation37
5.7.1.1Einfrieren der vermehrten […]
In dieser Arbeit wird ein Protein behandelt, dessen cDNA aus Xenopus laevis kloniert wurde und den Namen Brix trägt. Diese cDNA codiert für ein potentielles Polypeptid mit 339 Aminosäuren (Genbank Accession: AF319877). In den Genomen von Mensch, C.elegans, Hefe und Arabidopsis thaliana existieren hoch homologe ORFs.
Das Brix Protein lokalisiert im Nukleolus und den Cajal Bodies und interagiert mit 5S, 5,8S und 28S rRNA. In Saccharomyces cerevisiae codiert YOL077c (bzw. BRXl) für das Brix Homolog. YOL077c ist essentiell für das Wachstum der Zellen und lokalisiert ebenfalls im Nucleolus. Eine Expressionsverminderung von Brx1p inhibiert die Synthese der 60S ribosomalen Untereinheit und die Prozessierung der 35S prä- rRNA.
Ziel dieser Arbeit war es, Interaktionspartner von Brix mit Hilfe des Yeast Two- Hybrid Systems zu finden. Die Art dieser Interaktionspartner liefert Hinweise auf die zellulären Abläufe, in denen Brix involviert ist.
5 bekannte Proteine konnten als Two- Hybrid- Interaktionspartner identifiziert werden.
Alle Two- Hybrid- Interaktionspartner unterstützen die bisher experimentell gewonnenen Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Brix in der Ribosomenbiogenese und weisen auf eine Beteiligung von Brix sowohl in prä- rRNA Reifung und Ribosomenzusammenbau, als auch in Splicing und Modifikationen anderer RNAs hin.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.Einleitung3
2.Aufgabenstellung15
3.Material17
3.1Bakterienstämme17
3.2Hefestämme17
3.3Vektoren18
3.3.1Two- Hybrid- Vektoren18
3.3.2Matchmaker cDNA- Bank für Two- Hybrid- Screen19
3.3.3Reporterplasmid p8op-lacZ20
3.4Oligonucleotide für PCR und Sequenzierreaktionen21
3.5Chemikalien und Enzyme21
4.MEDIEN22
4.1Hefemedien22
4.1.1Medien generell22
4.1.2Medien für Two-Hybrid-Screen24
4.2Bakterienmedien25
5.METHODEN27
5.1Herstellung chemisch kompetenter E. coli27
5.2DNA- Präparationsmethoden28
5.2.1Plasmidisolierung aus E. coli: (Miniprep)28
5.2.2Plasmidisolierung aus Saccharomyces cerevisiae durch Sphäroplastierung30
5.3Polymerasekettenreaktion (PCR)31
5.4Klonierungsmethoden32
5.4.1Restriktionen32
5.4.2DNA-Gelelektrophorese33
5.4.3Elution von DNA aus Agarosegelstücken33
5.4.4Ligationen34
5.5Transformationsmethoden34
5.5.1Transformation von E. coli34
5.5.2Transformation von Saccharomyces cerevisiae35
5.6DNA- Sequenzierung36
5.7Two- Hybrid- Analyse37
5.7.1LexA- Two- Hybrid Transformation37
5.7.1.1Einfrieren der vermehrten […]
Leseprobe
Inhaltsverzeichnis
ID 8448
Brunauer, Georg: Interaktionsanalyse von Brix, einem Protein von Xenopus laevis, das in
der Ribosomenbiogenese involviert ist
Hamburg: Diplomica GmbH, 2004
Zugl.: Paris-Lodron-Universität Salzburg, Diplomarbeit, 2001
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Diplomica GmbH
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Printed in Germany
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ... 3
2 Aufgabenstellung... 15
3 Material ... 17
3.1 Bakterienstämme ... 17
3.2 Hefestämme:... 17
3.3 Vektoren: ... 18
3.3.1
Two- Hybrid- Vektoren... 18
3.3.2
Matchmaker cDNA- Bank für Two- Hybrid- Screen :... 19
3.3.3 Reporterplasmid
p8op-lacZ:... 20
3.4
Oligonucleotide für PCR und Sequenzierreaktionen: ... 21
3.5
Chemikalien und Enzyme: ... 21
4 MEDIEN: ... 22
4.1 Hefemedien: ... 22
4.1.1 Medien
generell:... 22
4.1.2 Medien
für
Two-Hybrid-Screen:... 24
4.2 Bakterienmedien:... 25
5 METHODEN: ... 27
5.1 Herstellung
chemisch
kompetenter
E. coli:... 27
5.2 DNA-
Präparationsmethoden: ... 28
5.2.1 Plasmidisolierung
aus
E. coli: (Miniprep)... 28
5.2.2 Plasmidisolierung
aus
Saccharomyces cerevisiae durch Sphäroplastierung: ... 30
5.3 Polymerasekettenreaktion
(PCR): ... 31
5.4 Klonierungsmethoden ... 32
5.4.1 Restriktionen: ... 32
5.4.2 DNA-Gelelektrophorese:... 33
5.4.3
Elution von DNA aus Agarosegelstücken:... 33
5.4.4 Ligationen:... 34
5.5 Transformationsmethoden:... 34
5.5.1 Transformation
von
E. coli:... 34
5.5.2
Transformation von Saccharomyces cerevisiae: ... 35
5.6 DNA-
Sequenzierung: ... 36
5.7
Two- Hybrid- Analyse: ... 37
5.7.1
LexA- Two- Hybrid Transformation:... 37
5.7.1.1 Einfrieren der vermehrten Transformanten:... 41
5.7.2
Screening der Library Cotransformanten auf Two- Hybrid Interaktionen: ... 42
5.7.3
Eliminierung falsch- positiver Klone: ... 44
5.7.3.1 Screen
nach
Reporteraktivierung
ohne Galaktoseinduktion des Prey: ... 44
5.7.3.2 Plasmidverlusttest:... 45
5.8
Rescue positiver Library- Plasmide via Transformation in E. coli KC8: ... 45
5.9
Retransformation in den Reporterstamm: ... 46
5.10 Sequenzierung und Charakterisierung der Insertsequenz: ... 46
6
ERGEBNISSE UND DISKUSSION: ... 47
6.1 Klonierung
von
BRIX: ... 47
6.2 Überprüfung der Hintergrundaktivierung durch die LexA-Brix-Fusion im
Reporterstamm, EGY 48[p8op-LacZ]:... 48
6.3 Two-Hybrid-Analyse: ... 49
6.3.1
Prinzip und Schema der Methode: ... 49
6.3.2
Screen nach Interaktionen zwischen Bait und Prey: ... 56
6.3.3
Verifikation der Interaktionen:... 58
6.3.3.1 Reporteraktivierung ohne Galaktoseinduktion des Prey:... 58
6.3.3.2 Plasmidverlusttest:... 58
6.4 Rescue
des
Library-Plasmids: ... 59
6.5
Retransformation der Plasmide in den Reporterstamm:... 59
6.6
Bestimmung der Interaktionspartner durch Sequenzierung und Datenbankabgleich: .. 59
6.7 Diskussion
der
Two-Hybrid Interaktionspartner:... 61
7 ZUSAMMENFASSUNG:... 70
8 SUMMARY: ... 71
9 LITERATUR:... 72
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis:
Figure 1: trans-wirkende Faktoren und Ablauf der prä-rRNA Reifung...Seite 13
Figure 2: nucleolar proteins implicated in pre-rRNA processing and ribosome
assembly...14
Figure 3: Matchmaker LexA Two-Hybrid Plasmide; pB42AD und pLexA...18
Figure 4: LacZ-Reporterplasmid; pSH18-34...20
Figure 5: Sequenz der in pEG202 einligierten BRIX-cDNA...47
Figure 6: Schema des Two-Hybrid-Systems...50
Figure 7: Schema der bridge-Protein Wirkung...51
Tabelle 1: Falsch-positive Two-Hybrid Interaktionspartner...52
Einleitung
Die Ribosomenbiogenese:
Die Ribosomenbiogenese ist eine der bedeutendsten Zellaktivitäten und sie findet
bei Eukaryoten hauptsächlich (aber nicht exklusiv) im Nukleolus statt. Hier wird die
rDNA als rRNA-Vorläufer transkribiert und diese wird dann kovalenten
Modifikationen und Prozessierungen unterzogen. Die Reifung der prä-rRNA ist eng
verbunden mit einer koordinierten Anlagerung von ribosomalen Proteinen (r-
Proteinen). Diese Prozesse sind von vielen unterschiedlichen cis-wirkenden
Elementen abhängig und von einer großen Zahl an nicht ribosomalen trans-
wirkenden Faktoren.
Im folgenden wird der Aufbau und die genaue Funktion des Nukleolus beschreiben
und anschließend ein Überblick gegeben über die prä-rRNA Reifung. Die folgenden
Beschreibungen beziehen sich vor allem auf Hefe (Saccharomyces cerevisiae), weil
hier am meisten bekannt ist und ausführliche Literatur darüber existiert. Viele
experimentelle Nachweise zeigen aber, dass der grundsätzliche Ablauf in allen
Eukaryoten gleich ist:
Der Nukleolus:
Der Nukleolus stellt ein eigenes Kompartiment im Kern dar und ist von allen
intranukleären Domänen am besten charakterisiert. Kompartimente ermöglichen in
der Zelle erst die Existenz sehr komplexer und vielschichtiger Reaktionen und
deren gleichzeitigen Ablauf. Ein Kompartiment kann durch seine Abgrenzung zum
Rest der Zelle vollkommen andere Bedingungen in seinem Inneren aufweisen als in
seiner Umgebung. Außerdem können durch diese räumliche Begrenzung
Reaktionspartner und deren Substrate in unmittelbare Nähe zueinander gebracht
werden und von eventuell störenden Einflüssen von außen ferngehalten werden;
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1
ohne Kompartimentierung wären also die meisten zellulären Abläufe bei weitem
nicht so effizient und würden sich sogar gegenseitig behindern.
Unter allen Kompartimenten hat der Nukleolus jedoch eine Sonderstellung, denn er
besitzt keine eigene Membran oder eine andere Form der Grenze zum umgebenden
Nukleoplasma;
Der Nukleolus weist morphologisch betrachtet drei verschiedene Komponenten auf:
Das fibrilläre Zentrum, die dichte fibrilläre Komponente und die granuläre
Komponente.
Das fibrilläre Zentrum beherbergt viele hundert Kopien der rRNA-codierenden
Gene, die in Tandemanordnungen am Chromosom angeordnet sind. Diese
Anordnungen werden Nucleolar-Organizing Regions (NORs) genannt. Die neuen
rRNA-Transkripte bewegen sich von der DNA weg, tauchen dann in der dichten
fibrillären Komponente wieder auf und später in der granulären Komponente. Die
ersten post-transkriptionellen Prozessierungsreaktionen finden in der dichten
fibrillären Komponente statt, die späten in der granulären Komponente (Scheer &
Hock, 1999). Nach der Herstellung der reifen rRNAs und deren Assembly mit den
r-Proteinen werden die prä-ribosomalen Partikel durch die Kernporen in das
Cytoplasma gebracht. Dieser Transport ist energieaufwendig und benötigt eine
eigene Transportmaschinerie (Moy & Silver, 1999; Hurt et al., 1999).
In Hefe bleibt der Nukleolus während der Mitose intakt und wird letztendlich
entlang der Mitosespindel in den letzten Stufen der Teilung separiert. In vielzelligen
Organismen dagegen lösen sich die Nukleoli während der Mitose auf, wobei die
granuläre Komponente zuerst verschwindet, gefolgt von der dichten fibrillären
Komponente. Danach werden die NORs an den Chromosomen sichtbar. Am Ende
der Mitose löst die Transkriptionsinitiation der RNA-Polymerase I die Rekrutierung
sogenannter ,,prä-nucleolar bodies" (PNBs) zu den NORs aus, um einen kompletten
Nukleolus zu bilden (Scheer & Weisenberger, 1994).
Abgesehen von Unterschieden in Größe und Proteinzusammensetzung werden
Ribosomen in allen Organismen auf die gleiche Art zusammengestellt.
Bis jetzt wurden in Prokaryoten keine Nukleoli oder vergleichbare Strukturen
gefunden. Das könnte daran liegen, dass die rRNA-Gene bei Prokaryoten nur in
sehr niedriger Kopienzahl vorkommen und keine Tandem-Anordnung besitzen. Es
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2
könnte also sein, dass Nukleoli aufgrund der engen rRNA-Gen Anordnung
entstanden sind.
Tatsächlich existiert ein Hefestamm mit einer Deletion der chromosomalen rDNA-
Repeats. Werden Plasmide mit einem einzigen rRNA-Gen in den Stamm
eingebracht, wird diese rDNA transkribiert und Ribosomen werden auch korrekt
erzeugt, sodass die Zellen dennoch wachsen können. (Nierras et al., 1997; und
Oakes et al., 1998) Diese Zellen besitzen keine normalen Nukleoli, enthalten jedoch
überall im Kern verteilt kleine punktförmige Strukturen, die möglicherweise Mini-
Nukleoli darstellen (Trumtel et al., in press).
Die Bildung von Nukleoli in Eukaryoten scheint nicht abhängig von der Tandem-
Anordnung der rDNA Repeats zu sein. Derzeit wird angenommen, dass das
nukleoläre Kompartiment eine Folge der gleichzeitigen Anwesenheit bzw. engen
Verbindung zwischen Transkription der rRNA und der Rekrutierung von
Prozessierungsfaktoren an die rRNA Vorläufer ist (Mélèse & Xue, 1995; und
Scheer & Hock, 1999).
Dadurch kann erklärt werden, wie das nukleoläre Targeting erfolgt. Durch das
Fehlen einer konkreten Abgrenzung zum Kernplasma können alle löslichen Stoffe
und Proteine in den Nukleolus gelangen; es bleiben aber nur die Proteine im
Nukleolus, die an die rDNA, deren Transkripte oder bereits existierende
Proteinkomplexe innerhalb des Nukleolus binden (Shaw & Jordan, 1995; und
Jacobson et al., 1995).
Die wesentlichen Faktoren im Nukleolus sind:
Erstens die RNA-Polymerase I und deren Hilfsfaktoren. In Säugern sind diese
Hilfsfaktoren der Upstream Binding Factor (UBF) und der Promotor Selectivity
Factor 1 (SL1). SL1 ist ein Analog zu TFIID und TFIIIB, welche in die
Transkription durch RNA-Polymerase II und III involviert sind. UBF bindet direkt
an den rDNA-Promotor, wogegen der Komplex mit SL1 nicht direkt mit der DNA
in Kontakt steht. Ein weiterer wichtiger Faktor, der mit der RNA-Polymerase I
Transkriptionsmaschinerie kolokalisiert ist, ist die Topoisomerase I. Deren genaue
Rolle in der rRNA Transkription ist noch nicht klar (Rose et al., 1988; Vogelauer &
Camilloni, 1999).
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3
Die Synthese von Ribosomen ist in Eukaryoten ein auf mehreren Ebenen sehr genau
regulierter Prozess. Eine der Regulationsebenen ist die Transkription der rDNA
selbst. Die Transkriptionsrate im Nukleolus kann stark verändert werden; es hat sich
gezeigt, dass nur ein kleiner Teil der Polymerase I aus Gesamtzellextrakten zu einer
Transkriptionsinitiation an rDNA Promotoren fähig ist (Milkereit & Tschochner,
1998). Auch Phosphorylierung von UBF und SL1 hat einen Einfluss auf die
Regulation der rRNA-Synthese (Heix et al., 1998; Tuan et al., 1999; Voit et al.,
1999).
Weitere wichtige Faktoren im Nukleolus sind solche, die an der Prozessierung der prä-
rRNA beteiligt sind und ribosomale Proteine, die mit diesen Zwischenstufen bis hin
zur fertigen rRNA Komplexe bilden. Viele dieser Proteine binden direkt an die RNA,
während die externen (ETS) und internen (ITS) Spacer Sequenzen entfernt werden
und die RNA Nukleotide extensiv modifiziert werden. Die Anlagerung der r-Proteine
an die RNAs geht einher mit deren Reifung. Daher muss dieser Prozess sehr
koordiniert und in bestimmter Reihenfolge ablaufen, denn der Zusammenbau zu den
fertigen ribosomalen Untereinheiten involviert die Bindungen zwischen der prä-rRNA,
70 bis 80 r-Proteinen und der 5S rRNA. Eine gemeinsame Eigenschaft der nukleolären
Proteine, die direkt an dieser Reifung beteiligt sind, ist ein ,,RNA recognition motif"
(RRM), mit dem sie entweder an die rRNAs oder an die snoRNAs binden. Die
snoRNAs sind für manche Spaltungen in der prä-rRNA (mit-) verantwortlich und
lenken auch die Modifikationen an der prä-rRNA (Maxwell & Fournier, 1995;
Tollervey & Kiss, 1997; Smith & Steitz, 1997). Einige der Sequenzmotive sind bereits
identifiziert worden, die eine Lokalisierung bzw. das Verbleiben von Proteinen im
Nukleolus bedingen (Olson et al., 2000).
Neue Untersuchungen haben gezeigt, dass im Nukleolus zusätzlich zum
Ribosomen-Assembly noch andere Reaktionen stattfinden, die involviert sind in die
Reifung der von RNA-Polymerase III transkribierten kleinen RNAs; Diese RNAs
sind die 5S rRNA, RNase P RNA, SRP RNA und U6 snRNA (Pederson & Politz,
2000), jedoch wird unter anderem die 5S rRNA von Genen codiert, die bei den
meisten Organismen außerhalb des Nukleolus liegen (Hadjioloy, 1985). Die 5S
rRNA wird von einem unbekannten Mechanismus in den Nukleolus gebracht, wo
sie in die ribosomalen Partikel vermutlich zu einem späten Zeitpunkt der prä-rRNA
Reifung eingebaut wird (Dechampesme et al., 1999). Auch die tRNAs werden von
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4
Genen außerhalb des Nukleolus codiert, aber manche tRNAs werden dann für eine
Prozessierung am 5´ Ende in den Nukleolus transportiert. Dieser
Transportmechanismus ist ebenfalls unbekannt (Wolin & Matera, 1999). Der
Nukleolus hat nicht nur eine Bedeutung für die Ribosomenbiogenese, sondern hat
unter anderem auch Einfluss auf den Zellzyklus und die Zellalterung (Kamijo et al.,
1997). Auch ein Teil der Telomerase RNA lokalisiert in den Nukleoli, wenn sie in
Xenopus laevis Oozyten injiziert wird (Narayanan et al, 1999); es wurde auch
vermutet, dass das Telomerase RNP zumindest teilweise im Nukleolus
zusammengestellt wird.
Coiled Bodies (CB):
Ursprünglich wurden die CBs Nucleolar Accessory Bodies genannt. Das sollte
ausdrücken, dass CB und der Nukleolus irgendwie in Verbindung stehen. Manche
Studien zeigen, dass intakte CBs für die Funktion des Nukleolus nicht wichtig sind
(Almeida et al., 1998). Andere Arbeiten zeigen hingegen, dass CBs und der
Nukleolus sich in gewisser Weise beeinflussen (Matera, 1999). In einem neueren
Modell wird postuliert, dass verschiedene Komplexe, wie etwa die RNA-
Polymerase I Transkriptionsmachinerie, sich zuerst in den CBs formieren oder
zusammengebaut werden und schließlich in den Nukleolus transportiert werden. Es
wurde gezeigt, dass bestimmte snoRNAs in CBs und Nukleoli lokalisieren und dass
ein sogenanntes C/D-Motiv in der RNA enthalten sein muss, wenn ein Transport
vom CB in den Nukleolus erfolgen soll (Narayanan et al., 1999).
Die CBs sind wahrscheinlich eine Einrichtung der Zelle, um den Nukleolus zu
entlasten, indem wichtige Komplexe schon vor ihrem Einsatz zusammengestellt
werden und dann schon sozusagen ,,betriebsbereit" in den Nukleolus geliefert
werden.
Prä-rRNA Synthese und Ribosomen Assembly:
Die Schritte der prä-rRNA Synthese und Prozessierung sind relativ gut bekannt,
wenn auch nicht bei allen Schritten aufgeklärt ist, welche Enzyme beteiligt sind.
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5
Die Koordination und Regulation der Anlagerung von r-Proteinen während der prä-
rRNA-Reifung an die RNA wird allerdings kaum verstanden.
Die Reifung des neu entstandenen RNA-Polymerase I Transkripts (= Vorstufe der
35S prä-rRNA) bis zur Entstehung der reifen rRNAs läuft folgendermaßen ab:
In Saccharomyces cerevisiae besteht die 60S Untereinheit aus 46 r-Proteinen und
drei verschiedenen rRNAs (5S; 5,8S; 25S). Die 40S Untereinheit enthält 32 r-
Proteine und die 18S rRNA. Drei (18S; 25S; 5,8S;) dieser insgesamt vier rRNAs
werden in Form eines einzigen großen Vorläufers von der RNA-Polymerase I
transkribiert. Der Vorläufer für die vierte rRNA (5S rRNA) wird unabhängig vom
Vorläufer für die großen rRNAs durch die RNA-Polymerase III transkribiert. Für
die 5S rRNA ist der Weg vom Vorläufer bis zur fertigen rRNA und zum Einbau in
das prä-ribosomale Partikel kurz und verläuft schneller und unabhängig von der
Reifung der anderen drei rRNAs (Raué & Planta, 1991): Das 5´-Ende der reifen 5S
rRNA stimmt mit dem des ursprünglichen Transkripts überein, wogegen das 3´-
Ende um 7-13 Basen kürzer ist als das des Vorläufers und aus diesem erst erzeugt
werden muss (Piper et al., 1983).
Das primäre Polymerase I-Transkript wird sofort an seinem 3´-Ende prozessiert,
wobei etwa 200 Basen entfernt werden (Fig. 1A). Bekannt ist, dass der Faktor Rnt1p
und wahrscheinlich RNA82 direkt bei diesem Verdau mitwirken (Kempers-Veenstra
et al., 1986; van der Sande et al., 1989; Veldman et al., 1980). Viele Basen der reifen
rRNAs sind kovalent modifiziert. Bei diesen Modifikationen (Bachellerie & Cavaillé,
1998; Ofengand & Fournier, 1998) handelt es sich um etwa 45 Isomerisierungen von
Uridin zu Pseudouridin () durch eine Basenrotation, um Methylierungen an etwa 10
Basen und um Methylierungen an der 2´-Hydroxyl Gruppe von 55 Ribosezuckern.
Diese Modifizierungen geschehen vor allem direkt nach der Transkription und noch
vor der Entstehung der 35S rRNA.
Die 35S prä-rRNA ist der größte detektierbare Vorläufer. Er enthält die Sequenzen
der 18S, 25S und 5,8S rRNAs; die rRNA-Sequenzen sind auf diesem Vorläufer
durch zwei ,,internal transcribed spacer" (ITS1 und 2) voneinander getrennt und
flankiert von zwei ,,external transcribed spacer" (5´-ETS und 3´-ETS).
Die Reifung der 35S prä-rRNA benötigt sehr viele trans-wirkende Faktoren und
läuft über 10 Prozessierungsstellen ab (Fig. 1B).
Einleitung
Seite
6
Die Prozessierung und die Modifikationen werden nicht an der ,,nackten" RNA
vorgenommen, sondern diese Veränderungen der RNA und das Assembly mit den
r-Proteinen zu präribosomalen Partikeln gehen im Nukleolus Hand in Hand
(Trapman et al., 1975). Die präribosomalen Partikel enthalten viele Proteine, die
nicht Bestandteil reifer Ribosomen sind und wahrscheinlich mit trans-wirkenden
Faktoren gleichzusetzen sind. Diese Proteine sind großteils in die rRNA-Reifung
und den Zusammenbau der ribosomalen Untereinheiten involviert.
Die trans-wirkenden Faktoren stimmen die einzelnen Schritte der prä-rRNA-
Reifung aufeinander ab und ermöglichen den geregelten Ablauf der Bindung von r-
Proteinen an die RNA.
Der Begriff der trans-wirkenden Faktoren umfasst zahlreiche Proteine und Enzyme,
wozu auch snoRNAs (zentrale Komponenten der snoRNPs), zahlreiche Endo- und
Exonukleasen, RNA- Helikasen und rRNA modifizierende Enzyme zählen
(Tollervey, D., 1996). Eine ausführliche Liste von trans-wirkenden Faktoren und
deren Phänotypen sind im WWW unter
http://www.expasy.ch/linder/proteins.html
nachzusehen:
Bis heute konnten mehr als 60 verschiedene Proteine identifiziert werden, die in
irgendeiner Weise an der Ribosomenbiogenese beteiligt sind (Figure 2).
Die meisten dieser Proteine können in verschiedene Klassen gruppiert werden
bezüglich ihrer vermuteten bzw. bestätigten enzymatischen Funktion und/oder ihrer
funktionellen Interaktion mit snoRNAs oder anderen Proteinen. Diese Klassen
enthalten Komponenten der snoRNPs, rRNA modifizierende Enzyme, Endo-und
Exonukleasen, Proteine mit RNA-Helikase Eigenschaften. Zu diesen Proteinen
gehören aber auch Faktoren, die wichtige RNA-Protein und Protein-Protein
Interaktionen ermöglichen.
Viele der trans-wirkenden Faktoren sind in Form von snoRNPs wirksam und stabil
mit snoRNAs assoziiert. In Hefe existieren etwa 100 verschiedene snoRNAs
(Samarsky & Fournier, 1999), die je nach ihrer Sequenz und Funktion in drei
verschiedene Gruppen eingeteilt werden können: Die meisten snoRNAs gehören zu
der H/ACA-box und der C/D-box Familie, wogegen die RNA in dem Ribozym
RNase MRP eine eigene Klasse bildet. Weitere Informationen können in der ,,Eddy
Einleitung
Seite
7
Lab snoRNA Database" nachgelesen werden
(
http://rna.wustl.edu/snoRNAdb/Sc/Sc-snos-bysno.html
).
H/ACA-box snoRNP:
Die zentrale Komponente dieser RNP stellt je ein Mitglied der H/ACA-box RNA
Familie dar. Mitglieder dieser RNA Familie weisen typische Sequenzmerkmale auf:
Ein ACA Triplett genau 3 Nukleotide vom 3´Ende der RNA auf und eine
sogenannte H-box, die sich zwischen zwei strukturell ähnlichen, funktionellen
Domänen befindet. Beide dieser Sequenzen sind notwendig für die Funktion.
Von wenigen H/ACA snoRNAs ist bekannt, dass sie direkt in der rRNA-
Prozessierung involviert sind. Die meisten der H/ACA snoRNAs sind an der
Pseudouridinylierung beteiligt (Tollervey, D. & Kiss, T. 1997).
In Hefe befinden sich meisten der 45 Pseudouridine auf der Sequenz der reifen
rRNAs. Diese Isomerisierung benötigt RNPs dieser Kategorie. Die snoRNA führt
dabei durch Basenpaarung mit einer komplementären Stelle der rRNA das RNP zu
der Stelle, wo das Uridin isomerisiert werden soll (Ganot et al., 1997). Das ist
jedoch nicht die einzige Funktion der H/ACA-snoRNPs. Die snR30 snoRNA ist ein
Vertreter dieser Gruppe von snoRNAs und wird für die Prozessierungsschritte an
den Stellen A
1
und A
2
der prä-rRNA benötigt (Fig. 1B).
Die Core-Protein Komponenten dieser H/ACA-RNPs konnten mittels
biochemischer Verfahren identifiziert werden. Alle H/ACA-snoRNPs besitzen die
gleichen Core-Proteine: Cbf5p, Gar1p, Nhp2p und Nop10 (Henras et al., 1998).
Cbf5p dürfte dabei wahrscheinlich die Rolle der -Synthase in jedem snoRNP
einnehmen, denn es besitzt starke Ähnlichkeit mit einer Familie mutmaßlicher -
Synthasen und bei einer Verminderung der Expression des Proteins wird die
Pseudouridinbildung blockiert und noch wichtiger die Menge an H/ACA-snoRNPs
wird in gleichem Maß vermindert (Lafontaine et al., 1998); mit dieser
Verminderung an Cbf5p wird auch die Prozessierung an den Stellen A
0
(snR10), A
1
und A
2
(snR30) inhibiert, da auch die H/ACA snoRNPs, die dabei mitwirken
betroffen sind. In weiterer Folge führt dieser Umstand auch zu einer leicht
reduzierten Menge an reifer 25S rRNA, zu einer Akkumulation an 27SB und 7S
prä-rRNA und zu einer aberranten Form der 5,8S rRNA.
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Auch die Verminderung von Nhp2p und Nop10p resultiert in einer Reduktion von
H/ACA-snoRNPs, hat jedoch nicht den gleichen Phänotyp wie die von Cbf5p
(Henras et al., 1998). Cbf5p wirkt sich vor allem auf die Prozessierung der rRNAs
für die 60S Untereinheit aus. Nhp2p und Nop10p greifen unter anderem in die 18S
rRNA Reifung ein und wirken sich damit auf die Biogenese der 40S ribosomalen
Untereinheit aber auch auf A
1
und A
2
-Spaltung und die Pseudouridinylierung aus.
Es wird vermutet, dass dieser Umstand durch Interaktionen mit anderen trans-
wirkenden Faktoren zustande kommt (Cadwell et al., 1997). Ohne eines dieser drei
Core Proteine (Cbf5p, Nhp2p und Nop10p) können keine H/ACA-snoRNPs
gebildet werden und der Grund dafür ist wahrscheinlich, dass ohne die Bindung
dieser Proteine an die snoRNAs diese RNAs dann durch die Exonukleasen Xrn1p
und Rat1p oder andere Nukleasen abgebaut werden (Petfalski et al., 1998).
Gar1p ist das vierte der H/ACA-snoRNP Core Proteine. Es besitzt zwei
Glycin/Arginin-reiche Domänen (GAR), die es in ähnlicher Form auch bei anderen
nukleolären Proteinen gibt. Man glaubt, dass die GAR Domäne Protein-RNA
Interaktionen vermitteln kann, es könnte also der ,,Anker" sein, der das snoRNP an
der rRNA hält (Girard et al., 1992). Die Verminderung an Gar1p wirkt sich jedoch
nicht auf den steady-state Level der snoRNAs aus und seine Deletion ist nicht
lethal, allerdings beeinflusst es wieder die Spaltung an A
1
und A
2
und es ist auch an
den -Bildungen der rRNA beteiligt. Neben diesen Proteinen sind auch bestimmte
RNA-Helikasen Bestandteile von H/ACA snoRNPs, darunter Sen1p und Sbp1p.
C/D-box snoRNP:
Diese RNPs enthalten RNAs der C/D-box snoRNA Familie. Die C/D snoRNAs
enthalten zwei Sets von evolutionär konservierten kurzen Consensus Sequenzen, die
C- (AUGAUGA) und die D- (CUGA) Box, sowie die Boxen C´ (UGAUGA) und
D` (CUGA), wobei C´ und D´ nicht immer vorhanden sind (Cavaille, J. et al. 1996).
In Hefe werden 55 Methylierungen der Ribosezucker (am 2´-OH) und 10
Basenmethylierungen vorgenommen. Die Ribosemethylierungen werden von diesen
RNPs in Analogie zu den Pseudouridinylierungen der H/ACA snoRNPs
durchgeführt. Den meisten dieser Ribose-Methylierungen konnte bis jetzt schon
jeweils eine bestimmte guide C/D snoRNA zugewiesen werden und jede dieser
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RNAs hat sich als nicht essentiell für die Zelle herausgestellt (Lowe & Eddy, 1999).
Dagegen sind die U3 und U14 C/D snoRNPs unverzichtbar; U3 scheint nur für die
Spaltungen an A
0
-A
2
mitverantwortlich zu sein, während U14 an den Stellen A
i
und
A
2
mitwirkt und bei einer Methylierung in der 18S rRNA involviert ist (Tollervey
& Kiss, 1997).
Bis jetzt konnten 3 Proteine als das wahrscheinliche Core dieser RNPs identifiziert
werden: Nop1p, Nop56p und Nop58p.
Eine Methylase konnte aber noch nicht als Core Protein identifiziert werden. Es
wurden jedoch bereits Proteine gefunden, die als RNA-Methyltransferasen in Frage
kommen. Auch Nop1p kommt als Methylase in Frage, jedoch ist das noch nicht
bestätigt. Mutationen in den Core Proteinen oder eine Deletion eines dieser drei
Proteine haben zwar Auswirkungen auf die Methylierung und das Prozessieren an
A
0
und A
2
, sind aber nicht lethal (Gautier et al., 1997).
Von Nop1p existiert eine Mutation (nop1-3), welche die Methylierung zwar
dramatisch beeinflusst, jedoch ohne große Effekte auf das rRNA Prozessieren. Dies
zeigt, dass rRNA Modifizierung und rRNA Prozessierung unabhängig voneinander
sind (Tollervey et al., 1993). Auch eine zweite aufschlussreiche Mutation von
Nop1p liegt vor; diese betrifft wiederum nur das Assembly der 60S Untereinheit,
zeigt jedoch keinen veränderten Prozessierungs- oder Methylierungsphänotyp.
Verminderung von Nop58p führt zu einer Verminderung und falschen Lokalisation
von Nop1p und resultiert in einer Instabilität aller C/D snoRNAs. Spaltungen an A
0
und A
2
werden inhibiert und damit erfolgt eine Reduktion der Menge an 40S
gegenüber 60S. Die Methylierung ist allerdings nicht betroffen (Lafontaine &
Tollervey, 1999). Es existiert eine Mutation, nop56-2, die zur Akkumulation des
27SB prä-rRNA und in Folge zu einer verlangsamten Erzeugung der 25S rRNA
führt: Diese Mutation wirkt hauptsächlich auf die Entstehung 60S Untereinheit.
Im Gegensatz zur Ribosemethylierung ist über die Basenmethylierung wenig
bekannt. Die Methylierung der Basen selbst scheint keine snoRNAs zu benötigen.
Als einzige Methylierung dieser Art wurde die evolutionär konservierte
Dimethylierung von zwei benachbarten Adenosinen am 3´Ende der 18S rRNA
gezeigt. Für diese Methylierung ist das essentielle Protein Dim1p verantwortlich
und dieses Protein wird auch gebraucht für die Prozessierung an A
1
und A
2
(diese
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zwei Spaltungen generieren die 20S prä-rRNA) (Lafontaine et al., 1995). Wichtig
bei dieser Doppelfunktion ist, dass die Methylierungsfunktion nicht direkt mit der
Beteiligung an der Prozessierung zusammenhängt. Eine dim1-2 temperatursensitive
Mutation inhibiert trotz permissiver Temperatur stark die Dimethylierung, hat aber
kaum einen Einfluss auf die Prozessierung; erst bei restriktiver Temperatur wirkt
sich der Defekt auf die Prozessierung aus. Der Stamm mit dieser Mutation zeigt bei
permissiver Temperatur normales Wachstum, obwohl nahezu keine Dimethylierung
auftritt. Damit wurde gezeigt, dass die Dimethylierung per se nicht für die Zelle
notwendig ist (Lafontaine et al., 1998). Zellextrakte des gleichen Stammes sind
inkompetent für in vitro Translation, was vermuten lässt, dass diese Dimethylierung
wahrscheinlich notwendig ist unter nicht optimalen Bedingungen und in vivo
möglicherweise nur zum ,,finetuning" dient, indem dadurch etwa das Ribosom
stabiler wird.
Generell wird von allen Modifikationen (Methylierung; Pseudouridinbildung)
angenommen, dass sie zur Stabilisierung der Ribosomen beitragen und den
Zusammenbau effizienter machen.
Endo- und Exo-RNasen:
Viele verschiedene Nukleasen werden während des Prozessierens der RNA
gebraucht. Die wesentlichen Schritte und die wichtigsten der beteiligten Enzyme in
der rRNA-Reifung sind in Fig. 1 dargestellt. Viele der bis jetzt bekannten Faktoren
und deren Funktion sind in Fig. 2 aufgeführt.
Der erste Reifungsschritt am neuen RNA-Polymerase I Transkript ist eine
endonukleolytische Spaltung am 3´ETS, was zum 35S Vorläufer führt; Es folgen -
Bildungen und Ribosemethylierungen mittels der H/ACA- und C/D- Box snoRNAs
und möglicherweise auch einige Basenmethylierungen.
Mit Hilfe von U3 snoRNP wird an A
0
gespalten und so der 33S Vorläufer generiert.
Die 33S prä-rRNA wird an A
1
unter Beteiligung mehrerer RNA-Helikasen zur 32S
prä-rRNA gespalten. Verantwortlich für diese Spaltungen sind abermals einige
RNPs (U3 und U14 = C/D-box; snR10 und snR30 = H/ACA-box) und die
Prozessierung an dieser Stelle wird auch beeinflusst von Dim1p und dem
Kontrollprotein Rrp5p. Rrp5p ist wichtig für diesen Schritt, der in weiterer Folge
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zum Vorläufer für die 18S rRNA führt, spielt aber auch ein wichtige Rolle in den
Prozessierungsschritten, die zu den rRNAs für die 60S Untereinheit führen.
Eine Spaltung an A
2
erzeugt den 20S Vorläufer für die 18S rRNA und den 27S-
Vorläufer für die 5,8S und 25S rRNA. An diesem Schritt nehmen im wesentlichen
die gleichen Faktoren wie in der Spaltung zuvor teil.
Die 20S RNA wird nun dimethyliert und mit der 43S prä-Untereinheit in das
Cytoplasma exportiert, wo die RNA weiter zur reifen 18S rRNA prozessiert wird.
Die 27S RNA wird im Nukleolus weiterbearbeitet, aber in zwei alternativen
Pathways:
85% der RNA werden an der Stelle A
3
durch die RNase MRP (assistiert von Rrp5p
und der Helikase Dbp3p) gespalten.
15% der 27S RNA werden zur 27S B
L
RNA verarbeitet, indem ein unbekannter
Faktor endonukleolytisch an B
L
schneidet.
Beide 27S RNAs werden nun wieder in gleicher Weise behandelt: Es folgen 2
Spaltungen an C
1
und C
2
, wodurch die reife 25S rRNA entsteht und im nächsten
Schritt werden beide der 7S rRNA-Arten in 3´-> 5´-Richtung von einem sehr
komplexen Exosom weiter verkürzt; das Ergebnis ist die 5,8S rRNA.
RNA-Helikasen:
Besondere Bedeutung in der rRNA-Reifung besitzen die RNA-Helikasen, die auch
die größte Klasse der trans-wirkenden Faktoren darstellen. Die meisten dieser
Helikasen gehören zur sogenannten DEAD-Box oder verwandten Familien und
besitzen evolutionär gut konservierte Sequenzmotive.
RNA-Helikasen sind an allen RNA metabolischen Prozessen beteiligt inklusive
Splicing, Translationsinitiation, RNA Abbau und Ribosomenbiogenese. Einige von
ihnen besitzen RNA abhängige ATPase Aktivitäten, die oft nur von bestimmten
RNA-Substraten stimuliert werden und wirken dann als RNA-Struktur Modulatoren
(de la Cruz et al., 1999). Die Wirkungsweisen dieser Enzyme können vielfältig sein:
In der Ribosomenbiogenese könnte eine Entwindungsfunktion
rRNA:snoRNA Bindungen ermöglichen oder diese wieder voneinander
dissoziieren lassen;
Sie können Nukleasen das Substrat zugänglich machen;
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Sie können als RNA Chaperone wirken und so das Assembly von Proteinen
mit der rRNA ermöglichen.
Bis jetzt konnten etwa 16 mögliche RNA Helikasen direkt der Ribosomen
Biogenese in Saccharomyces cerevisiae zugeordnet werden. Eine detaillierte Liste
von Helikasen und deren Eigenschaften existiert unter der Internetadresse:
http://www.expasy.org/linder/RNA_helicases.html
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Figure 1:
trans-wirkende Faktoren und Ablauf der prä-rRNA Reifung;
(entnommen
aus Kressler, D. et al. 1999):
Die Farben richten sich je nach Klasse des trans-wirkenden Faktors: -
Blau
, Exo- und
Endonukleasen; -
Rot
, mögliche ATP- abhängige RNA- Helikasen; -
Grün
, Komponenten
involviert in RNA Modifikation; - Schwarz, andere;
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Figure 2:
NUCLEOLAR PROTEINS IMPLICATED IN PRE-rRNA PROCESSING AND RIBOSOME
ASSEMBLY
(entnommen aus: Olson, Mark O.J., Dundr, M., Szebeni, A.; The nucleolus
an old
factory with unexpexted capabilities; Trends in CELL BIOLOGY; Vol.10; May 2000)
:
Ribonucleases
Endonucleases B23 [1] , RNase P [2] , RNase MRP [2] , PR1 [3] , Rnt1p [4]
Exonucleases Mtr3p [5] , Rat1p [4] , Rrp40p [5] , Rrp41p [5] , Rrp42p [5] , Rrp43p [5] , Rrp44p/Dis3p [5] ,
Rrp45p [5] , Rrp46p [5] , Rrp6p [5] ,
Rrp4p [5] , Xrn1p [4]
Proteins implicated in pre-rRNA processing
Fibrillarin [4] , Gar2 [6] , Gar1p [4] , Imp3p [7] , Imp4p [7] , Mpp10p [8] , Nip7p [9] , Nop1p [10] , Nop2p [11] ,
Nop4p (Nop77p) [12] , Nop5p [13] ,
Nop8p [14] , Nop56p [15] , Nop58p [15] , nucleolin/Nsr1p [16,17] , p120 [18] , Rrp5p [19] , snR10 [20] , Sof1p
[21]
Helicases
Dbp3p [22] , Dbp4p [22] , Dbp6p [22] , Dbp7p [22] , Dbp8p [22] , Dbp9p [22] , Dbp10p [22] , Dob1p [22] , Drs1p
[22] , Fa/1p [22] , Mak5p [22] , Rrp3p [22] ,
RHII/Gu [23] , Rok1p [22] , Sbp4p [22] , Sen1p [4]
Molecular chaperones
B23 [24] , Hsp70 [25] , Hsp72 [26] , Hsp32 [27]
snoRNP proteins of undefined function
65kDa [4] , 68 kDa protein [4] , hU3-55k [28] , Nhp2p [4] , Nop10p [4] , p17 nhp2 (Ref. 29), p68 [30] , snR42
[31] , snR30 [31]
rRNA-modifying enzymes and associated proteins
Cbf5p [32] , human dyskerin [4] , NAP57 [33] , Nop60Bp [34] , Nopp140 [33] , TreacherCollins protein [35]
Details
- Seiten
- Erscheinungsform
- Originalausgabe
- Erscheinungsjahr
- 2001
- ISBN (eBook)
- 9783832484484
- ISBN (Paperback)
- 9783838684482
- DOI
- 10.3239/9783832484484
- Dateigröße
- 1.1 MB
- Sprache
- Deutsch
- Institution / Hochschule
- Universität Salzburg – Naturwissenschaften
- Erscheinungsdatum
- 2004 (November)
- Note
- 1,0
- Schlagworte
- ribosamenassembly nukleolus cajal bodies two-hybrid-analyse
- Produktsicherheit
- Diplom.de
