Charakterisierung des Bakterienisolates C1 aus Cystodytes dellechiajei

Lehmann, Christian

Charakterisierung des Bakterienisolates C1 aus Cystodytes dellechiajei

Zusammenfassung

Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
In dieser Arbeit wurde der aus der marinen Ascidie Cystodytes dellechiajei isolierte Mikroorganismus C1 hinsichtlich Morphologie, Stoffwechsel und Produktion biologisch aktiver Substanzen (Antibiotika, Autoinduktoren), sowie seiner symbiotischen Beziehung zu C. dellechiajei näher charakterisiert. Hierbei sind vor allem eine große Variabilität in der Zellmorphologie (Kokken; lange, schlanke Stäbchen; verzweigte und vibroide Zellen) und die Fähigkeit, verschiedene Polymere als einzige Kohlenstoffquellen zu nutzen, hervorzuheben.
Des Weiteren wurde durch 16S rDNA und gyrB-Sequenzanalysen eine phylogenetische Einordnung vorgenommen und mit Hilfe des ARB Software-Pakets (Ludwig und Strunk, 2002) ein Stammbaum erstellt. So konnte C1 zweifelsfrei dem Genus Microbulbifer (Gonzalez et al., 1997) zugeordnet werden.
Untersuchungen, die darauf abzielten, eine spezifische Assoziation des Bakteriums mit der Ascidie nachzuweisen, wurden erfolgreich mittels Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierungen (FISH) durchgeführt. Während C1 aus C. dellechiajei beliebig oft reisoliert werden konnte, ließ sich der Mikroorganismus im umgebenden Meerwasser nicht nachweisen. Abgesehen davon stellt C1 den Experimenten zufolge den Großteil der mikrobiellen Gesamtpopulation innerhalb des Ascidien-Gewebes.
Mit marinen Makroorganismen vergesellschaftete Prokaryoten wurden oftmals als Produzenten biologisch aktiver Metabolite identifiziert, womit sich sessile Meeresbewohner beispielsweise gegen Fressfeinde oder Besiedelung durch Epibionten erwehren. Der biotechnologische und bio-medizinische Nutzen solcher nicht selten chemisch unbekannter Substanzen für den Menschen liegt auf der Hand. So wird weltweit an der Entwicklung von Antibiotika mit völlig neuartigen Leitstrukturen gearbeitet und es befinden sich eine Reihe vielversprechender Medikamente im Bereich der Onkologie in klinischen Testphasen, um nur zwei Beispiele zu nennen.
Für den in dieser Arbeit behandelten Mikroorganismus wurde die Produktion biologisch aktiver Stoffe nachgewiesen. Die Substanz konnte einer Stoffklasse zugeordnet werden. Weiterführende Experimenete auf bakterizide oder bakteriostatische Wirkung wurden in dieser Diplomarbeit durchgeführt
In der Einleitung der Arbeit wird ein Überblick über Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft der marinen Naturstoffforschung und deren Notwendigkeit in der modernen Biotechnologie gegeben. Mit vielen Beispielen und Literaturverweisen wird auf […]

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

ID 7946

Lehmann, Christian: Charakterisierung des Bakterienisolates C1 aus Cystodytes

dellechiajei

Hamburg: Diplomica GmbH, 2004

Zugl.: Universität Regensburg, Universität, Diplomarbeit, 2004

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Diplomica GmbH

http://www.diplom.de, Hamburg 2004

Printed in Germany

NHALTSVERZEICHNIS

NHALTSVERZEICHNIS

I. E

INLEITUNG

... 1

Auf der Suche nach Naturstoffen ... 1

Die Ozeane eine blaue Schatzkammer?... 4

Marine Biotechnologie Probleme, Ausblicke und Hoffnungen... 8

Charakterisierung des Bakterienisolates C1 ... 10

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

... 11

Bezugsquellen... 11

1.1

Chemikalien... 11

1.2 Enzyme und Reaktionskits ... 13

1.3

Geräte... 14

1.4 Verbrauchsmaterial und Sonstiges... 15

Organismen ... 16

3. Nährmedien und Kulturbedingungen... 17

3.1

Kulturbedingungen ... 17

3.2 Zusammensetzung der Medien ... 17

3.2.1 Allgemeine Lösungen... 17

3.2.2 Marine Broth 2216 (MB) ... 18

3.2.3 Minimalmedien für C1 ... 19

3.2.4 Polymermedien für C1 ... 20

3.2.5 Medien mit verschiedenen Kohlenstoff-Zusätzen... 20

3.2.6

M88-4d/5-Kulturmedium ... 21

3.2.7

Luria-Bertani

(LB)-Medium ... 21

3.2.8 Biolog Universal Growth (BUG)-Agar ... 21

3.2.9

Todd-Hewitt-Broth ... 22

3.2.10

M9-Medium ... 22

3.3 Herstellung der Medien ... 23

4. Gewinnung von Reinkulturen ... 23

4.1

Ausstrichverfahren ... 23

4.2

Verdünnungsreihen... 24

4.3 Zellvereinzelung mit der Laserpinzette ... 24

5. Herstellung von Dauerkulturen ... 25

5.1

Glycerinkulturen... 25

5.2

Roti-Store-Kryokulturen ... 25

5.3 Lagerung über Flüssigstickstoff... 25

Sterilisation ... 26

Mikroskopie ... 26

7.1

Phasenkontrastmikroskopie... 26

7.2

Fluoreszenzmikroskopie... 26

7.3

Rasterelektronenmikroskopie ... 27

Wachstumsbestimmung... 28

NHALTSVERZEICHNIS

8.1

Thoma-Zählkammer... 28

8.2 Optische Dichte ... 28

8.3

Lebendkeimzahlbestimmung... 29

DNA-Isolierung ... 29

9.1 Isolierung von Gesamt-DNA ... 29

9.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ... 30

9.3

Gelelektrophorese ... 30

10. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)... 32

10.1

Standard-PCR-Ansatz ... 32

10.2 16S rDNA-Amplifikation... 32

10.3

gyrB-Teilamplifikation ... 33

10.4 Reinigung von PCR-Produkten ... 34

11. Klonierung von PCR-Produkten ... 34

11.1

Ligation... 35

11.2

Elektroporation ... 35

11.3

Blau-Weiss-Screening ... 35

11.4 Restriktionsverdau und Gelelektrophorese ... 36

12. Phylogenetische Analyse von C1 ... 36

12.1 Sequenzierung von 16S rDNA und gyrB ... 36

12.2 Online-Alignment mit FASTA3 ... 38

12.3 Stammbaumerstellung mit ARB... 38

13.

Stoffwechselphysiologische

Untersuchungen ... 39

13.1 Verwertung verschiedener Polymerstoffe ... 39

13.2 Verwertung verschiedener Kohlenstoff-Quellen ... 39

13.2.1

Mikrotiterplatten (BIOLOG-System) ... 39

13.2.2

Flüssigkultur-Ansätze... 40

13.3 Sensitivität gegenüber Antibiotika... 40

13.4

Katalasenachweis... 41

13.5

Gram-Färbung ... 41

14. Produktion biologisch aktiver Substanzen... 42

14.1 Gewinnung des Überstandes stationärer C1-Kulturen... 42

14.2 Antibiotische Aktivität im C1-Überstand... 42

14.2.1

Schicht-Methode... 42

14.2.2

Plättchen-Methode ... 43

14.2.3

Stanz-Methode... 43

14.3 Bildung von Autoinduktoren... 43

15. Verarbeitung von Cystodytes dellechiajei-Lebendproben... 44

15.1 Gewinnung von Mazeraten und Überständen... 44

15.2 Herstellung von Kryoschnitten... 44

15.3

Konservierung ... 45

16. Färbungen mit Fluoreszenzfarbstoffen ... 45

16.1

DAPI-Färbungen... 45

16.2 Lebend-Tot-Färbungen mit BacLightTM... 46

NHALTSVERZEICHNIS

III

16.3 Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) ... 46

16.3.1

Vorbereitung der Objektträger ... 46

16.3.2 Puffer und Lösungen ... 47

16.3.3

Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide... 49

16.3.4 Bestimmung der Hybridisierungsbedingungen ... 50

16.3.5 Fixierung der Zellen... 51

16.3.6

Hybridisierung ... 51

17. Computerprogramme, Textverarbeitung und Internetresourcen ... 52

III. E

RGEBNISSE

... 54

1. Das Isolat C1 aus Cystodytes dellechiajei (Della Valle, 1877)... 54

2. Untersuchungen zur Morphologie ... 56

2.1

Zellmorphologie... 56

2.1.1

Phasenkontrastmikroskopie ... 56

2.1.2

Rasterelektronenmikroskopie... 58

2.2

Koloniemorphologie... 59

3. Entwicklung eines Minimalmediums... 61

4. Stoffwechselphysiologische Untersuchungen ... 63

4.1 Polymerverwertung und Nachweis von Exoenzymen ... 63

4.2

Kohlenstoff-Verwertung ... 64

4.2.1

BIOLOG-Mikrotiterplatten ... 64

4.2.2

Flüssigkultur-Ansätze... 66

4.3 Sensitivität gegenüber Antibiotika... 66

4.4

Katalasetest ... 67

4.5

Gram-Färbung ... 67

5. Produktion biologisch aktiver Substanzen... 67

5.1 Antibiotische Wirksamkeit des Überstandes... 67

5.2 Bildung von Autoinduktoren... 68

6. Phylogenetische Analyse ... 70

6.1 16S rDNA-Analyse ... 70

6.2

gyrB-Analyse ... 71

7. Phylogenetic Staining... 73

7.1 Staining von Reinkulturen... 73

7.2 Staining von Mischkulturen ... 74

7.3 Staining von Mazeraten ... 76

7.4 Staining von Isolaten aus C. dellechiajei... 77

7.5 Staining von Kryoschnitten ... 78

8. Weitere qualitative und quantitative Untersuchungen ... 80

8.1 C1-Nachweis außerhalb C. dellechiajei... 80

8.2

,,C1-Dominanz"... 80

8.3 16S rDNA-Sequenzierung eines Isolates aus C. dellechiajei... 81

NHALTSVERZEICHNIS

IV. D

ISKUSSION

... 83

Morphologie ... 83

Stoffwechsel ... 85

3. Biologisch aktive Substanzen ... 87

4. Phylogenetische Analyse ... 88

4.1 16S rDNA-Sequenzvergleich... 88

4.2

gyrB-Sequenzvergleich ... 90

5. C1 und C. dellechiajei... 91

6. Vorschlag zur Beschreibung einer neuen Art... 95

V. Z

USAMMENFASSUNG

... 96

VI. A

BKÜRZUNGSVERZEICHNIS

... 97

VII. L

ITERATURVERZEICHNIS

... 100

VIII. A

NHANG

... 108

Sequenz der 16S rDNA des Isolates C1 ... 108

gyrB-Teilsequenz des Isolates C1 ... 109

Alternativer Stammbaum: Neighbor-Joining mit Bacterial Filter ... 110

Alternativer Stammbaum: Maximum-Parsimony ohne Filter... 111

16S rRNA-Sekundärstruktur von E. coli... 112

BBILDUNGSVERZEICHNIS

BBILDUNGSVERZEICHNIS

III/1: Beschaffung der Tierproben... 54

III/2: Cystodytes dellechiajei... 55

III/3: verschiedene Wachstumsphasen von C1... 57

III/4: Lebend-Tot-Färbung mit

BacLightTM... 58

III/5: REM: C1 exponentielles Wachstum... 58

III/6: REM: C1 stationäre Phase ... 59

III/7: unterschiedliche Koloniemorphologien von C1 ... 60

III/8: Wachstumskurven... 62

III/9: C-Verwertung auf BIOLOG-Mikrotiterplatten ... 65

III/10: Überstandhemmtest... 68

III/11: Bildung von Autoinduktoren ... 69

III/12: Phylogenet. Stammbaum: Neighbor Joining o. Filter ... 71

III/13: FISH: C1-Reinkultur... 74

III/14: FISH: C1-E. coli-Mischkultur... 75

III/15: FISH: C1-CJ11049-Mischkultur... 75

III/16: FISH: C. dellechiajei-Mazerat... 76

III/17: FISH: Isolat MW3 aus Meerwasser ... 78

III/18: FISH+DAPI: Kryoschnitte v. C. dellechiajei... 79

III/19: C1 16S rDNA-Sequenzvariationen... 82

VIII: Phylogenet. Stammbaum: Neighbor Joining mit Bac. Filter ... 110

VIII: Phylogenet. Stammbaum: Max. Parsimony ohne Filter ... 111

VIII: 16S rRNA-Sekundärstruktur von E. coli... 112

I. E

INLEITUNG

I. E

INLEITUNG

Auf der Suche nach Naturstoffen

Schon immer hat sich der Mensch auf die Natur verlassen, um seine Bedürfnisse in

Sachen Nahrung, Transport, Unterkunft, Kleidung und nicht zuletzt Arzneien zu

befriedigen und dadurch sein Leid bei Erkrankungen und Verletzungen mit natür-

lichen Heilmitteln zu lindern. Tausende Jahre wurde das Wissen über die Heilkraft

bestimmter Pflanzen oder Mineralien überliefert und durch Beobachten und Experi-

mentieren ausgeweitet. Diese Erkenntnisse stellten allerdings nur ein Erfahrungsgut

dar, ohne jemals kritisch überprüft zu werden. Viel später erst wurde versucht, auch

den theoretischen Hintergrund einer Arzneimitteltherapie zu bedenken und somit

gezielt nach Wirkstoffen zu suchen die Pharmakologie war geboren. So forderte

Theoprastus Bombastus von Hohenheim, genannt Paracelsus (1493-1541 n. Chr.), als

erster die Kenntnis der aktiven Substanz in einem verordneten Mittel und wehrte

sich damit gegen die unsinnigen, ja tödlichen Stoffgemische mittelalterlicher

Medizin, die auf den antiken Lehren von Hippokrates (460-370 v. Chr.) und Galen

(129-200 n. Chr.) beruhten (Lüllmann & Mohr, 1990).

Die Arbeiten von Louis Pasteur (1822-1895; siehe Krasner, 1995) und Robert Koch

(1843-1910) forcierten die Bemühungen auf der Suche nach antimikrobiellen Sub-

stanzen und führten schließlich zur Entwicklung des ersten wirksamen Chemo-

therapeutikums durch Paul Ehrlich (1854-1915). Das Präparat ,,606" (,,Salvarsan",

Dioxydiamidoarsenobenzol) verschaffte ab 1907 tausenden mit Treponema pallidum

infizierten Menschen Linderung, wenn auch nicht ohne Nebenwirkungen. Neben

Syphillis konnte fortan auch das von Rickettsien verursachte Rückfallfieber kuriert

werden (Quelle: http://www.m-ww.de).

I. E

INLEITUNG

Diese Behandlungsmethode wurde erst in den Jahren nach 1940 verdrängt, als der

schottische Mediziner und Bakteriologe Alexander Fleming (1881-1955) durch Zufall

1928 eine der bedeutendsten Entdeckungen der modernen Wirkstoffforschung

machte: als erster hatte er die antibiotische Effektivität eines Schimmelpilzes gegen-

über Mikroorgansimen beobachtet. Eine Verunreinigung in seinen Zuchtschalen

ein Pilz der Gattung Penicillium hemmte das Wachstum von Staphylokokken. Nach

dieser Entdeckung war klar, dass die Zukunft der Suche nach Wirkstoffen in der

Natur selbst lag. Zum ersten Mal in der Geschichte fahndete man jetzt systematisch

nach Naturstoffen, die als Bakterizide, Insektizide, Fungizide und Herbizide Nutzen

fanden. Anfänglich handelte es sich dabei vor allem um antibiotisch wirksame Stoffe,

die hauptsächlich aus Boden-Mikroorganismen isoliert wurden, wie etwa Amino-

glycoside, Rifamycine, Polyene, Tetracycline und Makrolide aus Streptomyceten und

Proteine bzw. Peptide aus verschiedenen Bacillus-Arten.

Jedoch meist schon kurz nach Einführung eines neuen Antibiotikums traten

Resistenzen auf (z. B. Glazer & Nikaido, 1995). Um diesem Verlauf entgegenzu-

wirken, musste man neue, bisher unbekannte Wirkstoffe gewinnen, was zeitweise

gelang (Gibbons, 1992). Völlig neue Leitstrukturen sind freilich seit über 20 Jahren

nicht mehr gefunden worden (Wirth, pers. Mitteilung) und mehr als 90 % aller ,,neu"

entdeckten aktiven Kulturen produzieren schon bekannte Substanzen (Fenical, 1993).

Durch die Entwicklung halbsynthetischer Derivate unwirksam gewordener Anti-

biotika blieben viele multiresistente Keime unter Kontrolle. Momentan jedoch stellen

uns Erreger nosokomialer Infektionen vor immer größere Probleme. Vollresistente

Staphylococcus aureus- und Enterococcus faecalis-Stämme können selbst mit Vanco-

mycin, einem der letzten, bis vor kurzem noch effektiven Medikamente, nicht mehr

behandelt werden (Gottlieb, 2003 bzw. Ben et al., 1996). Hoffnung gibt hier das so-

genannte Ascochital, ein Antibiotikum aus dem marinen Ascomycet Kirschsteinothelia

maritima (Kusnick et al., 2002), gegen das bislang noch keine resistenten Staphylo-

kokken-Stämme aufgetreten sind (Dorn, 2003; siehe auch Sonderausgabe Trends in

Microbiology, 1994, 2(10):341-425: Drug resistance: the new apocalypse).

I. E

INLEITUNG

Vielversprechend scheint auch eine kürzlich beschriebene, neue antimikrobielle

Stoffklasse zu sein. Dabei handelt es sich um ein Quinolonderivat, das Pathogene wie

Haemophilus influenzae, Moraxiella catarrhalis und Streptococcus pneumoniae ohne

toxische Nebeneffekte auf menschliche Körperzellen zuverlässig abtötet (Dandliker

et al., 2003).

Dieses Beispiel macht deutlich, wie wichtig die Suche nach völlig neuen Substanzen

und Wirkmechanismen ist und auch zukünftig bleiben wird, denn Antibiotika-

resistenzen werden, nicht zuletzt wegen unsachgemäßer Anwendung, auch weiter-

hin um sich greifen. So hält Dr. D. Pirages, Direktor des Harrison Centers an der

Universität Maryland, Infektionskrankheiten gar für ,,die potentiell größte Bedro-

hung der Menschheit in der Zeit nach dem Kalten Krieg" (Pirages, 1995).

Eine schier endlos sprudelnde Quelle neuer, unbekannter Moleküle stellt die belebte

Natur dar, weithinausgehend über die heutigen Möglichkeiten der chemischen

Synthese. Die Produzenten stammen aus allen Domänen Bacteria, Archaea und

Eukarya, hier wiederum Einzeller, Pflanzen, Pilze und Tiere. Im Jahr 1997 beruhten

bereits 60 % der Wirkstoffe sämtlicher zugelassener Medikamente auf dem Gebiet

der Krebs- und Infektionskrankheiten auf Naturprodukten und 1991 waren fast die

Hälfte der meistverkauften Pharamazeutika Naturstoffe oder deren Abkömmlinge

(Cragg et al., 1997). Berühmte Beispiele für solche natürlich vorkommenden und in-

zwischen vollsynthetisch hergestellten Substanzen, sind das bekannteste Schmerz-

mittel der Welt, die Acetylsalicylsäure (,,Aspirin") aus der Weidenrinde, oder Taxol®

aus der Rinde der pazifischen Eibe Taxus brevifolia (Wani et al., 1971). Dieses wird

mittlerweile unter dem Handelsnamen Paditaxel zur Behandlung von Eierstockkrebs

und metastasierendem Brustkrebs eingesetzt.

Das Wirkspektrum der Naturstoffe geht natürlich weit über die beschriebenen An-

wendungen hinaus. Zum Einsatz kommen sie nicht nur im Bereich der Biomedizin,

sondern auch in der Landwirtschaft, Kosmetik und Industrie. So wird z. B. das BT-

Toxin von Bacillus thuringiensis als Insektizid eingesetzt, Pseudopterosin C aus der

Weichkoralle Pseudopterogorgia elisabethae findet in Hautcremes Verwendung

I. E

INLEITUNG

(Colwell, 2002; Fenical 1997) und thermostabile Enzyme von z. B. Thermotoga

maritima, wie die UltmaTM DNA-Polymerase, sind kommerziell erhältlich (Huber &

Stetter, 2000).

Die Ozeane eine blaue Schatzkammer?

Während bisher erst 5-15 % aller etwa 250000 beschriebener Arten höherer Pflanzen

systematisch auf die Produktion bioaktiver Substanzen überprüft wurden, ist das

Potential mariner Lebewesen noch weitaus weniger untersucht (Cragg et al., 1997).

Man nimmt an, dass in den Ozeanen, die ca. 70 % der Erdoberfläche bedecken, etwa

500 Millionen verschiedene Arten von Pflanzen, Tieren und vor allem Mikro-

organismen leben (Dorn, 2003). Mehr noch: von 27 verzeichneten Phyla kommen nur

17 auf dem Land vor, alle 27 hingegen im Meer (Rayl, 1999). Zudem sind bis heute

nur etwa 5000 Arten prokaryotischer Lebensformen (terrestrische und marine) be-

schrieben worden, Schätzungen gehen aber von weit mehr als einer Million Arten

aus (Schleifer & Horn, 2000). Dies bedeutet, dass weniger als 0,5 % der insgesamt

existierenden Prokaryoten bekannt, geschweige denn kultivierbar sind. Die systema-

tische Erforschung der mikrobiellen Vielfalt und der Biodiversität generell in den

Weltmeeren steckt also gerade erst in den Kinderschuhen. Dementsprechend stam-

men bis jetzt nur etwa 10 % aller bekannten Naturstoffe aus marinen Organismen,

Tendenz jedoch steigend (Dorn, 2003).

W. Fenical geht allerdings davon aus, dass innerhalb der nächsten 20 Jahre sämtliche

marinen Makroorganismen analysiert und auf Produktion aktiver Substanzen getes-

tet sein werden. Die Entdeckung neuer Wirkstoffe wird sich zukünftig mehr auf die

Erforschung der mikrobiellen Welt konzentrieren (Fenical, 1997). Die Meere stellen

also die größte natürliche Resource für neue Verbindungen dar und man fängt

gerade erst an, dieses Potential für die Menschheit nutzbar zu machen (Hentschel,

2000).

I. E

INLEITUNG

Schon in den 1950er Jahren, konnten einige wenige marine Wirkstoffe isoliert

werden. Dazu zählen Acyclovir (Zovirax®), das antivirale Wirkung zeigte und

womit noch heute Herpes bekämpft wird, sowie Cytarabine (Cytosar®), das bei der

Behandlung bestimmter Krebserkrankungen Verwendung findet (Rayl, 1999). Beide

Stoffe wurden aus dem karibischen Zitronenschwamm Cryptothetya crypta extrahiert.

Darüberhinaus entdeckte man in dem Pilz Cephalosporium acremonium vor der Küste

Sardiniens die Cephalosporine, eine Gruppe damals neuer Antibiotika (Quelle:

http://focus.msn.de).

Vor diesem Hintergrund begann man gegen Ende der 70er Jahre des 20. Jahr-

hunderts, intensiv in den Weltmeeren nach neuen chemischen Verbindungen zu

suchen. Viele bioaktive Substanzen konnten seither isoliert werden. Als Produzenten

ließen sich Bakterien (auch Cyanobakterien), Pilze, bestimmte Algen, Schwämme,

Seehasen, Nudibranchia, Weichkorallen , Bryozoen, Mollusken, Echinodermen und

Tunikaten nachweisen (Faulkner, 2000). Für einige dieser vielversprechenden Meta-

bolite ist allerdings eine Anwendung am Menschen aufgrund starker Neben-

wirkungen ausgeschlossen. So musste das Antitumormittel Didemnin B (DB) aus

dem Tunikaten Trididemnum solidum wegen kardiotoxischer Eigenschaften nach der

klinischen Phase II aus dem Programm genommen werden; Testphasen mit dem

chemisch nah verwandten Dehydrodidemnin B aus Aplidium albicans dauern hin-

gegen noch an (Rinehart, 2000). Im fortgeschrittenen Stadium der Klinischen Phase II

befindet sich zur Zeit Ecteinascidin-743 (ET-743), ein Alkaloid aus der tropischen

Seescheide Ecteinascidia turbinata. Es wird hochwirksam gegen ansonsten therapie-

resistente Weichteil-Sarkome angewendet (Cvetkovic et al., 2002).

Wie und warum bilden Meeresbewohner überhaupt solche komplizierten Struk-

turen? Oft handelt es sich dabei um chemische Waffen sessiler Organismen

(Faulkner, 2000). Schwämme beispielsweise leben meist festsitzend auf Felsen oder

am Meeresboden und können sich weder aktiv verteidigen noch fliehen. Mit Hilfe

bioaktiver Substanzen schützen sie sich gegen Fressfeinde oder hindern Algen und

Bakterien daran, sie zu überwachsen (Thakur et al., 2000; Haygood et al., 1999).

I. E

INLEITUNG

Nähere Untersuchungen zeigten, dass für die Produktion vieler aktiver Substanzen

mit den Makroorganismen vergesellschaftete Mikroben verantwortlich sind (Thakur

et al., 2003; Jensen & Fenical, 1996; Kobayashi & Ishibashi, 1993). Betrachtet man etwa

Schwämme der Gattung Verongia oder Aplysina, ist dies nicht weiter verwunderlich,

da die mikrobielle Besiedelung in deren Gewebe 40 % ihres Gesamtgewichtes aus-

macht (Hentschel et al., 2001 und 2002). Auch in der für diese Arbeit herangezogenen

Ascidie Cystodytes dellechiajei wurde von etwa 2-3 mm langen, schlanken Stäbchen

berichtet, die unterhalb der Cuticula in großer Menge vorkommen (Rottmayer et al.,

2001).

Eine solche Symbiose macht für beide beteiligten Arten Sinn: sessile Lebewesen

können sich durch die von Mikoorganismen produzierten sekundären Metabolite

diverser Feinde erwehren, während die Mikroben im Gewebe günstigere Lebens-

umstände vorfinden. Weiterhin sind auch Bereitstellung von Nährstoffen, Stabili-

sierung des (Schwamm)skeletts und der Abbau toxischer Stoffwechselprodukte als

Funktionen mikrobieller Symbionten beschrieben worden (Hentschel et al., 2002 und

dort angegebene Literaturhinweise).

Solche Wechselbeziehungen sind vermutlich schon vor sehr langer Zeit entstanden.

Die Ursprünge der Klasse der Porifera etwa, gehen bis in das Präkambrium vor 600

Millionen Jahren zurück. Ein Vergleich der mikrobiellen Lebensgemeinschaften

innerhalb zweier Schwämme, Aplysina aerophoba und Theonella swinhoei deckte auf,

dass es sich dabei um eine mehr oder weniger einheitliche Population handelt, die

phylogentisch weit entfernt von anderen im Meerwasser oder Sediment lebenden

Bakterien ist. Möglich wäre, dass es sich um eine entwicklungsgeschichtlich sehr alte

Gemeinschaft handelt, das Ergebnis einer koevolutionären Schöpfung, wobei Mikro-

organismen nach und nach symbiontisch in den Schwamm integriert wurden. Die

Entstehung eines derartig einheitlichen Musters in mikrobiellen Lebensgemein-

schaften zweier Organismen, die ansonsten keine Gemeinsamkeiten aufweisen, setzt

das Vorhandensein hochspezifischer Selektionsmechanismen voraus. Ein Beispiel

hierfür wäre die Widerstandsfähigkeit der Bakterien gegenüber Phagocytose durch

I. E

INLEITUNG

Archeozyten des Schwammes. Dieser Selektionsdruck könnte im Laufe der Zeit bio-

aktive Substanzen produzierende Organismen hervorgebracht haben (Hentschel et

al., 2002).

Etwa 11 % der aus A. aerophoba isolierten Bakterien zeigten antimikrobielle Aktivität

gegen klinisch relevante, multiresistente Pathogene. Bei diesen Produzenten handelte

es sich um Mitglieder der Gattungen Bacillus, Enterococcus, Arthrobacter, Micrococcus,

Vibrio und Pseudoalteromonas, sowie um Vertreter der -Proteobacteria und Gram-

positiver, Nieder-GC Keime (Hentschel et al., 2001). Für die mutualistisch lebenden

Idiomarina spec., Pseudomonas spec. (Thakur et al., 2003), Micrococcus spec., Vibrio spec.,

Alteromonas spec. und Streptomyces spec. (Kobayashi & Ishibashi, 1993; Fenical, 1993),

sowie für das Isolat M88-4d/5 aus Alcyonium digitatum (Ruhland, 2001) wurde eben-

falls von der Produktion biologisch aktiver Metabolite berichtet. Diese Liste ließe sich

noch weiter fortsetzen.

Es bleibt festzuhalten, dass die Produktion biologisch aktiver Substanzen bei vielen

symbiontisch lebenden Mikroorgansimen beobachtet werden kann, die aus phylo-

genetisch völlig unterschiedlichen Divisionen stammen. Ihre Wirkstoffe können

komplett neue Leitstrukturen, aber auch schon bekannte Verbindungen oder

Derivate hiervon darstellen. Angesichts des derzeitigen Wissensstandes darf man auf

weitere Entdeckungen und Fortschritte auf dem Gebiet der Naturstoffforschung

hoffen.

I. E

INLEITUNG

Marine Biotechnologie Probleme, Ausblicke und Hoffnungen

In den letzten 30 Jahren haben die biologischen Wissenschaften auf vielen Gebieten

enorme Fortschritte gemacht. Die marine Biotechnologie wurde trotz glänzender

Entdeckungen jedoch stark vernachlässigt (Colwell, 2002).

Dafür gibt es eine Reihe von Gründen. Allein die Entdeckung einer neuen

chemischen Verbindung ist nicht genug. Für eingehendere Untersuchungen muss

der eigentliche Produzent identifiziert und im Idealfall kultiviert werden. Man

schätzt, dass momentan weniger als 1 % aller marinen Mikroorganismen im Labor

gezüchtet werden können (siehe z. B. Hentschel et al., 2000). Auch verlieren aus

marinen Makroorganismen isolierte und in Reinkultur gebrachte Bakterien gele-

entlich durch veränderte Umweltbedingungen, etwa durch ein abgeändertes Nähr-

stoffangebot oder durch Wegfall jeglichen Selektionsdrucks, ihre Fähigkeit wirksame

Substanzen zu produzieren (Hentschel et al., 2001).

Erschwerend kommt hinzu, dass viele Produzenten oft nur sehr selten vorkommen

und/oder die marinen Wirkstoffe nur in geringsten Mengen gebildet werden. Als

Beispiel hierfür sei der japanische Schwamm Halichondria okadai genannt. Er erzeugt

ein makrozyklisches Lacton, das Halichondrin B (Hirata & Uemura, 1986), welches

Melanom- , Leukämie- und Eierstockkrebszellen zuverlässig abtötet. Aus einer

Tonne Schwammgewebe lassen sich allerdings nur 20 mg dieses Wirkstoffes ge-

winnen (Dorn, 2003).

Um diesem Dilemma zu entkommen, werden mehrere Strategien verfolgt. Dabei

muss vor allem schonend und nachhaltig gehandelt werden, um die Resourcen zu

schützen. Bemühungen, marine Invertebraten im Labor in der sogenannten Mari-

kultur zu züchten, werden intensiviert. Des Weiteren wird versucht, Zellkulturen

von Makroorganismen anzulegen, was für Schwämme in einigen Fällen bereits ge-

glückt ist (Müller, W.E.G., Mainz; in: Dorn, 2003). In diesem Zusammenhang sind

gleichfalls die Methoden der Gentechnologie und Fermentation sehr wichtig. Gelingt

es, das (die) für die aktive Substanz codierende(n) Gen(e) zu klonieren, kann es in

I. E

INLEITUNG

einen leichter kultivierbaren Organismus, wie etwa E. coli, transferiert und im Ideal-

fall auch exprimiert werden. Dass dies prinzipiell möglich ist, zeigt die Klonierung

des für das green-fluorescent-protein (Gfp) codierenden Gens aus der Qualle

Aequoria spec. bzw. der Koralle Renilla reniformis (Colwell, 2002). Gfp findet vor allem

in der Zell-, Entwicklungs- und Molekularbiologie als Fusionsprotein Anwendung

(siehe z. B. Yang et al., 1996).

Darüberhinaus wird versucht, neu entdeckte Verbindungen mit Methoden der

organischen Chemie nachzubauen und zu derivatisieren. Bei dieser ,,Optimierung

einer Leitstruktur" wird in mehreren Richtungen gleichzeitig gearbeitet: Verschie-

dene Synthesemethoden werden parallel getestet und miteinander kombiniert. Am

Ende stehen im Idealfall vereinfachte, aber biologisch aktive Moleküle, wie die

Arbeit an Bryostatinen und Ecteinascidinen zeigen konnte (Newman et al., 2000).

Ribosomale RNA (rRNA)-Screening-Techniken, wie Fluoreszenz-In-Situ-Hybridi-

sierung (FISH), erlauben eine schnelle Identifizierung und grobe phylogenetische

Einordnung relevanter Mikroorganismen. In Kombination mit der Confocal Laser

Scanning Mikroskopie (CLSM) lässt sich auch die räumliche Anordnung mikrobieller

Lebensgemeinschaften in ihrer natürlichen Umgebung rekonstruieren (Wagner et al.,

2003). Viele Probleme bei der Anwendung von FISH können mittlerweile durch

Einsatz verschiedener Techniken behoben werden. So ist man beispielsweise im-

stande, eine schlecht erreichbare Targetsequenz durch zusätzliche Zugabe un-

markierter ,,Helfer-Sonden" oder Peptidnukleinsäuren mit dem entsprechenden

Oligonukleotid zu hybridisieren. Zellen mit niedrigem Ribosomengehalt können oft

mittels der sogenannten CARD (catalysed reporter deposition)-FISH detektiert

werden (Wagner et al., 2003).

Abschließend bleibt festzuhalten, dass angesichts der Erfolge und Entdeckungen der

letzten 20 Jahre auf dem Gebiet der marinen Naturstoffforschung gezeigt werden

konnte, welches Potential marine Biotechnologie in sich birgt. Auf die Entwicklung

völlig neuer Behandlungsmethoden für verschiedenste Krankheiten darf gehofft

werden. Anstrengungen, Biodiversität in den Weltmeeren zu erhalten, müssen

I. E

INLEITUNG

weiterhin verstärkt werden, um diese einmaligen Resourcen auch künftig nutzen zu

können.

Charakterisierung des Bakterienisolates C1 aus Cystodytes dellechiajei

In dieser Arbeit sollte das Isolat C1, das aus der koloniebildenden Ascidie C.

dellechiajei gewonnen wurde, näher untersucht werden.

Hierzu wurden Daten zur Morphologie, Phylogenie und über stoffwechsel-

physiologische Fähigkeiten erhoben. Versuche zur Natur der biologisch aktiven

Substanz wurden durchgeführt. Eine Stamm-spezifische Sonde sollte entwickelt

werden, um C1 in den im Labor gehälterten Tieren direkt nachweisen zu können.

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

1. Bezugsquellen

1.1 Chemikalien

Substanz Bezugsquelle

Acrylamid Serva,

Heidelberg

Agar

Difco, Sparks, MD (USA)

Agarose Sigma,

Deisenhofen

Alginat Peqlab,

Erlangen

AMP Roche,

Mannheim

AMPER Serva,

Heidelberg

Antibiotika, verschiedene

Oxoid, Wesel

BacLightTM

Molecular Probes, Leiden (NL)

Bromphenolblau Serva,

Heidelberg

BSA Sigma,

Deisenhofen

Casaminosäuren

Difco, Detroit, MI (USA)

Cellulose Roth,

Karlsruhe

Chill-out 14 Liquid Wax

MJ-Research Inc., Waltham, MA (USA)

Chitin Sigma,

Deisenhofen

Chitosan ICN,

Eschwege

Chrom-(III)kaliumsulfat Sigma,

Deisenhofen

Citifluor AF-1

Citifluor Products, Canterbury (UK)

CMP Roche,

Mannheim

Coomassie Brilliant Blue G250

Serva, Heidelberg

DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) Sigma,

Deisenhofen

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

Diatomeenerde/Celite Sigma,

Deisenhofen

DMSO Serva,

Heidelberg

EDTA ICN,

Eschwege

Ethanol (absolut)

Baker, Deventer (NL)

Ethidiumbromid Serva,

Heidelberg

Glutaraldehyd (25 % [v/v], EM Grade)

Agar Scientific, Essex (UK)

Glycerin ICN,

Eschwege

Glycogen Sigma,

Deisenhofen

GMP Roche,

Mannheim

Guanidinthiocyanat Roth,

Karlsruhe

Gummi (Galactomannanpolysaccharid)

Sigma, Deisenhofen

Hefeextrakt

Difco Laboratories, Detroit, MI (USA)

IPTG Serva,

Heidelberg

Pepton ICN,

Eschwege

SDS (Natriumdodecylsulfat)

ICN, Eschwege

Serdolit MB-1 (20-25 mesh)

Serva, Heidelberg

Succinat Sigma,

Deisenhofen

TEMED Serva,

Heidelberg

Thymidin Sigma,

Deisenhofen

Tissue-Tek®

Sakura, Zoeterwoude (NL)

TMP Roche,

Mannheim

Trehalose Sigma,

Deisenhofen

Tris Amersham,

Braunschweig

Tween 80

Serva, Heidelberg

X-Gal ICN,

Eschwege

Xylan Sigma,

Deisenhofen

Sonstige hier nicht aufgeführte Chemikalien wurden von der Firma VWR, Darm-

stadt, bezogen.

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

1.2 Enzyme und Reaktionskits

Enzyme Bezugsquelle

Lysozym

Sigma, Deisenhofen

BsaA I

Schnittstelle 5`...PyAC/GTPu...3`

3`...PuTG/CAPy...5`

New England Biolabs (NEB), Frankfurt

BstE II

Schnittstelle 5`...G/GTNACC...3`

3`...CCANTG/G...5`

New England Biolabs (NEB), Frankfurt

EcoR I

Schnittstelle 5`...G/AATTC...3`

3`...CTTAA/G...5`

New England Biolabs (NEB), Frankfurt

Hinc II

Schnittstelle 5`...GTPy/PuAC...3`

3`...CAPu/PyTG...5`

New England Biolabs (NEB), Frankfurt

Reaktionskit Bezugsquelle

E. Z. N. A. Plasmid Miniprep Kit I

Peqlab, Erlangen

pGem-T Vectorsystem I

Promega, Mannheim

QIAquick PCR Purification Kit (50)

Qiagen, Hilden

Taq PCR Master Mix Kit

Qiagen, Hilden

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

1.3 Geräte

Gerät Hersteller

Blockthermostat Thermomixer compact

5350

Eppendorf, Hamburg

Digitalkameras

Nikon Coolpix 950

Nikon Coolpix 990

Nikon, Düsseldorf

Inkubatoren

Heraeus Typ UT6120 und Typ B12

Mytron WB 120

MWG Biotech Mini Oven

Heraeus, Hanau

Mytron, Heiligenstadt

MWG, Ebersberg

Mikroskope

Labophot-2

Olympus BX60 mit UV-Netzgerät

U-RFL-T

Nikon, Düsseldorf

Olympus, Hamburg

Mikrotom CM3000

Leica, Bensheim

Photometer Spectronic Genesys 5

Milton Roy, Rochester, NY (USA)

Rollenmischer/Cellmixer CMV

(,,Rollerdrum")

Osrath, Geretsried

Vortex Genie 2

Scientific Industries, Bohemia, NY

(USA)

Waage Precision Standard TP400D

Ohaus, Cambridge (UK)

Wasserbadschüttler Gyrotory Model G76

New Bruinswick Scientific, New

Bruinswick, NJ (USA)

Zentrifugen

Biofuge 13 mit Rotor #3757

Sorvall® RC5C Plus mit Rotoren

SS34, GSA und GS3

Vakuumzentrifuge DNA-Mini

Labofuge GL mit Rotor #2150

Heraeus, Hanau

Du Pont, Newton, CT (USA)

Heto-Holten, Alleroed (DK)

Heraeus, Hanau

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

Hier nicht aufgeführte Geräte werden in den entsprechenden Abschnitten weiter

unten erwähnt.

1.4 Verbrauchsmaterial und Sonstiges

Verbrauchsgegenstand Bezugsquelle

Cellulosefilter

Schleicher Schüll, Dassel

Einwegkanülen 23G Sterican

Braun, Melsungen

Einwegspritzen ERSTA, 1 ml

Cordan, Roedby (DK)

Filter Filtron MacrosepTM

VWR, Darmstadt

Kanülen

Henke Sass Wolf, Tuttlingen

Küvetten, Plastik, 1 ml

Sarstedt, Nümbrecht

Parafilm ,,M"® Laboratory Film

American National CanTM, Chicago, IL

(USA)

Petrischalen, Plastik

Greiner bio-one, Kremsmünster (A)

pH-Stäbchen VWR,

Darmstadt

Pipettenspitzen 10, 200 und 1000 µl

Sarstedt, Nümbrecht

Reaktionsgefäße 1,5 und 2 ml

Eppendorf, Hamburg

Reaktionsgefäße 1,5 und 2 ml mit

Schraubverschluß und Dichtung

Sarstedt, Nümbrecht

Sterilfilter Dyna Gard®, 0,2 µm

Roth, Karlsruhe

Glaswaren wurden von der Firma Schott, Mainz, bezogen.

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

2. Organismen

Stamm

Bezugsort

Bacillus spec. sporulierend

Bakterienbank Regensburg

Bacillus subtilis

Bakterienbank Regensburg

Bacillus thuringiensis

Bakterienbank Regensburg

Brevibacterium linens

Bakterienbank Regensburg

Chromobacterium violaceum

Bakterienbank Regensburg

Citrobacter amalonaticus

Bakterienbank Regensburg

Citrobacter freundii

Bakterienbank Regensburg

C1 (Laborstamm)

Bakterienbank Regensburg

CJ11049

KORDI, Ansan (KOR)

Cystodytes-Isolate CysB1, CysB2, CysB3,

CysB4, CysC2 und CysC5

Im Zuge dieser Arbeit isolierte Stämme

aus gesammelten und im Labor gehäl-

terten Tieren

Enterobacter aerogenes

Bakterienbank Regensburg

Enterococcus durans

Bakterienbank Regensburg

Enterococcus faecalis

Bakterienbank Regensburg

Enterococcus gallinarum

Bakterienbank Regensburg

Escherichia coli

Bakterienbank Regensburg

Escherichia coli K12

Bakterienbank Regensburg

M88-4d/5 Bakterienbank

Regensburg

Micrococcus spec.

Bakterienbank Regensburg

Pseudomonas aeruginosa

Universitäts-Klinikum Regensburg

PB2 Universität

Mainz

Staphylococcus carnosus

Bakterienbank Regensburg

Staphylococcus hyicus

Bakterienbank Regensburg

Staphylococcus spec.

KORDI, Ansan (KOR)

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

Streptococcus salivarius

Bakterienbank Regensburg

Streptococcus mutans

Bakterienbank Regensburg

Streptococcus sanguis

Bakterienbank Regensburg

Streptomyces spec.

Bakterienbank Regensburg

Yersinia enterocolitica

Bakterienbank Regensburg

Tab. II/1: verwendete Mikroorganismen

3. Nährmedien und Kulturbedingungen

3.1 Kulturbedingungen

Mit Ausnahme der Enterobacteriaceae (37°C, aerob) wurden alle verwendeten

Mikroben aerob im Rollerdrum bei 30°C inkubiert. Außer den marinen Organismen

C1, CJ11049, PB2 und M88-4d/5 (MB, C1- bzw. M88-4d/5-Kulturmedium, vgl. II.3.2)

wurden alle Stämme in LB bzw. THB angezogen.

3.2 Zusammensetzung der Medien

3.2.1 Allgemeine Lösungen

Synthethisches Meerwasser, SME (Stetter et al., 1983); modifiziert

NaCl 27,7

MgSO

x 7 H

O 7,0

MgCl

x 7 H

O 5,5

CaCl

x 2 H

O 1,5

KCl 0,65

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

NaBr 0,1

0,03 g

SrCl

x 6 H

O 0,015

KJ 0,5

bidest

ad 1000 ml

Vitamin-Stammlösung nach Wolfe (10x) (Balch et al., 1979)

Biotin

20 mg

81,9 µM

Folsäure

20 mg

45,3 µM

Pyridoxamindihydrochlorid (Vit. B

)

100 mg

386,0 µM

Thiamindihydrochlorid (Vit. B

)

50 mg

148,0 µM

Riboflavin (Vit. B

)

50 mg

133,0 µM

Nikotinsäure

50 mg

406,0 µM

DL-Calciumpantothenat

50 mg

105,0 µM

Cyanocobalmin (Vit. B

)

5 mg

3,7 µM

p-Aminobenzoesäure (PABA)

50 mg

365,0 µM

Liponsäure

50 mg

242,0 µM

bidest

ad 1000 ml

3.2.2 Marine Broth 2216 (MB)

Marine Broth 2216 (Becton Dickinson, Le Pont De Claix, F)

Pepton 5,0

Hefeextrakt 1,0

Eisen(III)-Citrat 0,1

NaCl 19,45

MgCl

(wasserfrei) 5,9

II. M

ATERIAL UND

ETHODEN

3,24

CaCl

1,8

KCl 0,55

NaHCO

0,16 g

KBr 0,08

SrCl

34,0

22,0

SiO

4,0

NaF 2,4

1,6 mg

HPO

8,0 mg

bidest

ad 1000 ml

Marine Broth 2216 wurde als Fertiggemisch verwendet. Die Bouillon wurde ca. eine

Minute unter Rühren auf der Heizplatte gekocht und anschließend autoklaviert (vgl.

II.6).

3.2.3 Minimalmedien für C1

Glucose

[%]

Hefeextrakt

[%]

Casamino-

säuren [%]

Vitaminlö-

sung (10 x)

[%]

Nukleotide

[%]

Hefeextrakt

Fraktionen

[%]

a) 0,1; 0,5 bzw.

1,0

0,01; 0,05

bzw. 0,1

- - - -

b) 0,1; 0,5 bzw.

1,0

- 0,01;

0,05

bzw. 0,1

0,02; 0,1

bzw. 1,0

- -

0,5 - 0,5 -

0,001

bzw.

0,01

0,5 - - - - 0,1

Tab. II/2: Ansätze in 1 x SME mit 50 mM Tris-Cl, pH 7,5

Details

Seiten
Erscheinungsform: Originalausgabe
Jahr: 2004
ISBN (eBook): 9783832479466
ISBN (Paperback): 9783838679464
DOI: 10.3239/9783832479466
Dateigröße: 4.9 MB
Sprache: Deutsch
Institution / Hochschule: Universität Regensburg – Biologie
Erscheinungsdatum: 2004 (April)
Note: 1,0
Schlagworte: biotechnologie naturstoffe fish symbiose

Autor

Christian Lehmann (Autor:in)

Charakterisierung des Bakterienisolates C1 aus Cystodytes dellechiajei

Zusammenfassung

Leseprobe

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Autor

Christian Lehmann (Autor:in)