Mutationsanalyse und Grundlagen für funktionale Untersuchungen zu den positionalen Kandidatengenen für katatone Schizophrenie, EIF2AK4 und SLC12A6, aus der chromosomalen Region 15q14-15

Inhalt

1. Abkürzungsverzeichnis

2. Einleitung
2.1 Überblick: Die Krankheit Schizophrenie
2.2 Kausalitäten der Erkrankung
2.3 Wissenschaftliche Grundlagen für diese Arbeit
2.4 Die KandidatengeneGCN2undKCC

3. Fragestellung
3.1 Mutationsanalyse des GensGCN2durch automatisierte Sequenzierung
3.2 Assoziationsstudie einer Variante in Exon 28 vonGCN2durch RFLP Analyse
3.3 Vorbereitungen zur funktionalen Analyse seltener Varianten im Promotor vonKCC
3.4 Überprüfung von KCC3 Exon 1A auf Spleißformen

4. Material
4.1 Materialien allgemein
4.1.1 Klinisch
4.1.2 Puffer
4.2 Materialien zur Mutationsanalyse des GensGCN2durch automatisierte Sequenzierung
4.2.1 Polymerase chain reaction (PCR)
4.2.2 Sequenzierreaktion
4.2.3 Fällung und Sequenzierung
4.3 Materialien zur Assoziationsstudie einer Variante in Exon 28 vonGCN2durch RFLP Analyse
4.3.1 PCR
4.3.2 Restriktion
4.3.3 Analyse der Restriktionsfragmente
4.4 Materialien für die Vorbereitungen zur funktionalen Analyse einer seltenen Variante im Promotor vonKCC
4.4.1 PCR
4.4.2 Expressionstest
4.4.3 Restriktion und Ligation von Vektor und KCC3 Promotor
4.4.4 Elektroporation und Selektion der Klone
4.4.5 Nachweis A- und G-Varianten im Konstrukt
4.4.6 Vorbereitung des Sequenzier-Auftrages an MWG-Biotech
4.4.7 Überprüfung der Segregation der distal gelegenen G-Variante in Familie
4.5 Materialien zur Überprüfung von KCC3 Exon 1A auf Spleißformen

5. Methoden
5.1 Methoden zur Mutationsanalyse des Gens GCN2 durch automatisierte Sequenzierung
5.1.1 PCR
5.1.2 Sequenzierreaktion, Fällung und Sequenzierung
5.2 Methoden zur Assoziationsstudie einer Variante in Exon 28 vonGCN2durch RFLP Analyse
5.2.1 PCR
5.2.2 Restriktion
5.2.3 Analyse der Restriktionsfragmente
5.3 Methoden für die Vorbereitungen zur funktionalen Analyse einer seltenen Variante im Promotor vonKCC
5.3.1 PCR
5.3.2 Expressionstest
5.3.3 Doppelverdau und Ligation von Vektor und KCC3 Promotor
5.3.4 Elektroporation und Selektion der Klone
5.3.5 Nachweis der A- und G-Varianten im Konstrukt
5.3.6 Vorbereitung des Sequenzier-Auftrages an MWG-Biotech
5.3.7 Überprüfung der Segregation der distalen G-Variante in Familie
5.4 Methode zur Überprüfung von KCC3 Exon 1A auf Spleißformen

6. Ergebnisse
6.1 Ergebnisse der Mutationsanalyse des Gens GCN2 durch automatisierte Sequenzierung
6.1.1 Überprüfung der Reinheit der PCR-Produkte
6.1.2 Sequenzierergebnisse
6.2 Ergebnisse der Assoziationsstudie einer Variante in Exon 28 vonGCN2durch RFLP Analyse
6.3 Ergebnisse der Vorbereitungen zur funktionalen Analyse einer seltenen Variante im Promotor vonKCC
6.3.1 Amplifizierung des 2,8 kb Fragmentes
6.3.2 Expressionstest
6.3.3 Restriktion mitHinDIII undNcoI
6.3.4: Selektion der Klone
6.3.5 Verifizierung der Varianten in den Konstrukten
6.3.6 Ergebnisse der Sequenzierung durch MWG biotech
6.3.7 Überprüfung der Segregation der distalen G-Variante in Familie
6.4 Ergebnis der Überprüfung von KCC3 Exon 1A auf Spleißformen

7. Diskussion

8. Zusammenfassung

9. Literaturverzeichnis

10. Danksagung

1. Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2. Einleitung

2.1 Überblick: Die Krankheit Schizophrenie

Das Standardwerk zur Diagnose psychiatrischer Erkrankungen DSM-IV („Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders; Fourth Edition, Text Revision“ American Psychiatric Association, 2000) beschreibt Schizophrenie als persistente, häufig chronische und normalerweise ernste psychische Störung, welche eine Vielzahl von Verhaltensaspekten, sowie das Denken und Emotionen beeinflusst. Die Patienten leiden an Wahnvorstellungen oder Halluzinationen. Ihre Gedankengänge können sprunghaft wechseln und der gesamte Denkprozess unlogisch sein. Die psychotische Symptomatik kann mit einem Rückgang sozialer Interaktion und Desinteresse einhergehen. Schizophrenie stellt eine Subgruppe der endogenen Psychosen dar.

Ein Kriterium zur Diagnose von Schizophrenie nach DSM-IV ist das Auftreten von zwei oder mehr Akutsymptomen, welche für mindestens zwei Wochen eines Monats auftreten. Diese umfassen Wahn, Halluzinationen, desorganisierte Sprechweise, grob desorganisiertes Verhalten oder Katatonie sowie negative Symptome wie unter anderem flacher oder deutlich unpassender Affekt oder Willensschwäche. Weiterhin können Leistungsminderung im Beruf, Veränderung von Sozialbeziehungen und eine verminderte Selbstständigkeit auftreten. Ferner müssen für die Diagnose andere Störungen, Krankheiten oder Substanzeinflüsse als Auslöser der psychotischen Phase ausgeschlossen werden. Es gibt eine Vielzahl von Subtypen der Erkrankung, z.B. katatone, paranoide oder undifferenzierte Schizophrenie, sowie schizophreniforme oder schizoaffektive Psychosen. Es gibt für die Charakterisierung einer Schizophrenie noch andere Diagnosekriterien, z.B. das ICD-10 („International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems“ 1989 Revision, Geneva, World Health Organization, 1992) der Welt-Gesundheits-Organisation (WHO) oder aber das System nach Karl Leonhard (1904-1988), welches zwar immer mehr an Bedeutung gewinnt, jedoch nicht international anerkannt ist. Die Kriterien Leonhards („Classification of Endogenous Psychoses and their Differentiated Etiology; Second revised and enlarged edition“ Karl Leonhard, Helmut Beckmann 1999) sind insofern etwas strenger, da hier nicht zwei oder mehr der Symptome zur Diagnose ausreichen. Nach Leonhard ist eine Diagnose nur dann möglich, wenn jedes einzelne charakteristische Kriterium erfüllt ist. Im Bereich der affektiven Psychosen betrachtete er neben den bipolaren (manisch-depressiven) die monopolaren Erkrankungen (reine Euphorien oder Depressionen) als eigene Krankheitsform. Die ursprünglich sehr große Gruppe der Schizophrenien unterteilte er in drei eigenständige Gruppen von Krankheiten. Die zykloiden Psychosen, die seiner Ansicht nach den manisch-depressiven Erkrankungen ähnlicher sind als die Schizophrenien, die sogenannten atypischen oder unsystematischen Schizophrenien, die den zykloiden Psychosen bzw. manisch-depressiven Erkrankungen näher stehen als den Krankheiten, die er als systematische Schizophrenien bezeichnete. Jede Gruppe kann dabei in zahlreiche Einzelkrankheiten unterteilt werden.

2.2 Kausalitäten der Erkrankung

Zu den Ursachen von Schizophrenie gibt es mehrere Ansichten (Innocenti, 2003). Viele Autoren diskutieren die Krankheit als Zustand abnormaler Konnektivität kortikaler Neurone, vor allem in übergeordneten Hirnstrukturen wie dem Präfrontal- und Temporallappen. Dabei stehen sich die Verfechter der „Hypokonnektivitätstheorie (verminderte Konnektivität)“ und der „Hyperkonnektivitätstheorie (erhöhte Konnektivität)“ gegenüber. Während beispielsweise die bei Schizophrenen recht häufig zu beobachtende Ventrikelvergrösserung für die Hypokonnektivitätstheorie sprechen könnte, gibt es bis dato noch keinen anatomischen Beweis, der die Hyperkonnektivitätstheorie unterstützen würde. Bigelow und Rosenthal schlugen bereits 1972 Veränderungen im Corpus callosum als mögliche Ursache für die Entwicklung einer Schizophrenie vor. Die allgemein bekannten eye tracking -Experimente (z.B. Levy, 1993) mit Schizophrenen unterstützen diese Annahme. Abnorme synaptische Verschaltung in dieser Hirnregion kann sekundär durch Fehlfunktionen in einer Hemisphäre hervorgerufen werden.

Im Allgemeinen lassen sich die verschiedenen Theorien auf einen gemeinsamen Konsens bringen: Schizophrenie ist die Manifestation einer abnormen neuronalen Entwicklung bzw. eines abnormen synaptischen Netzwerkes. Diese Veränderungen können durch genetische sowie epigenetische Faktoren hervorgerufen werden. Die Mehrheit von Autoren geht davon aus, dass sich die Entwicklung der Krankheit aus einem Zusammenspiel mehrerer Ursachen ergibt (3). Zu den möglichen epigenetischen Faktoren zählen z.B. sensorische Deprivation (6), fötaler Alkoholeinfluss (7), virale Infektion (8), Hormonstörungen (9) oder frühe Läsionen (10). Der Einfluss genetischer Faktoren konnte bereits mehrfach in Zwillings-, Adoptions- und Familienstudien gezeigt werden (Gottesman, 1991). Dabei ist wohl das größte Problem, ein möglichst homogenes Patientensample für die Studien zu etablieren. Es ist nämlich nicht auszuschließen, dass die verschiedenen Subtypen der Krankheit auf unterschiedliche Veränderungen im Genom zurückzuführen sind.

2.3 Wissenschaftliche Grundlagen für diese Arbeit

Unsere Arbeitsgruppe konzentriert sich auf katatone Schizophrenie. Periodische Katatonie (OMIM 181500) ist ein klinischer Subtyp unsystematischer Schizophrenien (nach Leonhard). Sie ist durch psychomotorische Störungen wie subtilen Veränderungen von Gesichtsausdruck und Gestik, Stupor, Haltungsstereotypien, Negativismus oder Rigidität gekennzeichnet. Einige der Symptome sind auch zwischen den psychotischen Episoden festzustellen, somit ist dieser Subtyp relativ sicher von den anderen unterscheidbar. Weiterhin besteht für Verwandte ersten Grades ein 26,9% höheres Risiko, ebenfalls an katatoner Schizophrenie zu erkranken (Stöber, 1995), so dass der genetische Einfluss nicht von der Hand zu weisen ist.

Die Suche nach mutmaßlichen Kandidatengenen erfolgt durch Kopplungs-Analyse von ganzen Populationen oder Familienstichproben. Die Analyse von Familien führt zu weniger signifikanten Ergebnissen, da die Stichprobe kleiner ist. Dafür wird im Falle genetischer Heterogenität bei der familienbezogenen Auswertung das Ergebnis nicht falsch-negativ.

Stöber et al. (2000) konnten bei einer genomweiten Kopplungsanalyse von 12 Familien (135 Probanden, darunter 57 an periodischer Katatonie erkrankte Individuen) signifikante Kopplung zur chromosomalen Region 15q14-15 feststellen (Maximum GENEHUNTER-PLUS LOD score 3,57, p = 0,000026, 35.3 cM). Ferner ergab sich suggestive Kopplung zur Region 22q13 (LOD = 1,85; p = 0,0018, 58.2 cM). Region 15q14-15 ist für die jeweiligen Familien seitdem mittels Kartierung von zusätzlichen polymorphen Markern weiter eingegrenzt worden (Meyer et al. 2002, Stöber et al. 2002).

Einen weiteren Ansatz zum Auffinden von Kandidatengenen liefert Hans W. M. Moises (2001). Moises ging theoretisch vor, das heißt, er prüfte bisher veröffentlichte Arbeiten zur Genetik von Schizophrenie nach folgenden Grundsätzen: Er sammelte Informationen zu allen Genen, die in all den chromosomalen Regionen lokalisiert sind, für die jemals signifikante Kopplung gezeigt werden konnte. Dann untersuchte er, ob es eine funktionale Beziehung zwischen diesen Genen geben könnte, ob man sie einem gemeinsamen funktionalen Signalweg zuordnen könnte und ob eine Veränderung dieser Gene die Hauptsymptome von Schizophrenie hervorrufen könnten. Nur 90 Gene konnten alle Voraussetzungen erfüllen. Moises´s Hypothese besagt, dass genetische und epigenetische Varianten von Genen, welche in Signaltransduktion, Transkription und Translation involviert sind, und somit Einfluss auf die cerebrale Proteinsyntheserate haben, für die genetische Prädisposition von Schizophrenie verantwortlich sind. Er schlägt eine verringerte cerebrale Proteinsyntheserate als Ursache für die Entwicklung von Schizophrenie vor. GCN2 (EIF2AK4) ist eines der 90 Gene, die alle Voraussetzungen der Hypothese erfüllen.

Hakak und Mitarbeiter führten 2001 eine genomweite Expressionsanalyse mit Hilfe von DNA Mikroarrays durch. Auf diese Weise wurden post mortem -Proben aus dem dorsolateralen präfrontalen Kortex von Schizophreniepatienten und Kontrollen untersucht. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass vor allem Gene, welche zur Myelinisierung benötigt werden, bei Patienten und Kontrollen unterschiedlich stark exprimiert werden. Diese Erkenntnis führte zu der Hypothese, dass ein Myelinisierungsdefizit eine weitere mögliche Ursache von Schizophrenie sein könnte.

2.4 Die Kandidatengene GCN2 und KCC3

Die für diese Arbeit untersuchten Gene befinden sich beide auf Chomosom 15q14-15, einem Locus der, wie gezeigt werden konnte, Kandidatengene für Chromosom 15-bezogene Schizophrenie (SCZD10) sowie bipolare Psychose enthält (12, 18).

Das Genprodukt von EIF2AK4 (Eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 4), oder auch GCN2 genannt, wird für die Zelladaption bei Aminosäuredeprivation benötigt, da es unbeladene t-RNA an eine Histidyl-tRNA-Synthease verwandte Domäne bindet (Zhang et al., 2002, Qiu et al., 2002). Wie bereits dargestellt, können Variationen der cerebralen Proteinsyntheserate oft mit neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. (z.B. Moises, 2001). GCN2 ist eines von nur 90 Genen, welche alle Voraussetzungen in der Studie von Moises erfüllt haben. Es ist auf Chr15q14-15 lokalisiert. Dieser Bereich wird auch nach weiterer Eingrenzung der Region durch polymorphe Marker von drei der in unserer Gruppe untersuchten Familien unterstützt (Stöber et al., 2002) (siehe Abb.1). Mutationen in Genen, welche für Translationsfaktoren kodieren, konnten in der Vergangenheit als Auslöser für Leukoenzephalopathien nachgewiesen werden. Leegwater und Mitarbeiter zeigten beispielsweise 2001, dass der Ausbildung von VWM (Leucoencephalopathy with vanishing white matter, OMIM 603896) Mutationen in EIF2B zu Grunde liegen. Weitere Leukoenzephalopathien wie z.B. MLC (Megalencephalic leucoencephalopathy with subcortical cysts, OMIM 605908) werden durch Mutationen in Genen (hier MLC1, KIAA0027) verursacht, welche auch im Zusammenhang mit der Etiopathogenese von katatoner Schizophrenie diskutiert werden (Meyer et al. 2001; Leegwater et al. 2001).

SLC12A6 oder KCC3 (Potassium chloride cotransporter 3) ist auf Chromosom 15q14 lokalisiert. Das Gen liegt proximal des Markers D15S1042 (siehe Abb.1), welcher die obere Grenze für den Bereich mit Kandidatengenen bei Familie 9 angibt (Stöber, 2002). Somit wird der KCC3- Genlocus nur von zwei Familien unterstützt und ist in Familie 9 als Kandidat ausgeschlossen. Trotzdem wird SLC12A6 aus folgenden Gründen weiterhin untersucht: Erstens sind Kationenkanäle wichtig für die Kontrolle der ionischen und osmotischen Homöostase mehrerer Zelltypen. Weiterhin zeigten Shen et al. 2001, dass die Expression von KCC3 die Zellproliferationsrate erhöht und somit KCC3 maßgeblich an der Neuronalentwicklung beteiligt ist. Wie beschrieben wird generell angenommen, dass fehlerhafte neuronale Entwicklung Schizophrenie verursachen könnte. Dazu kommt, dass in der Vergangenheit die Gene für mehrere Kanalproteine, z.B. KCNN3 (31) oder MLC1 (26, 27) als Kandidatengene für sowohl schizophrene Psychosen als auch Myelinopathien in Kombination mit motorischen Beeinträchtigungen vorgeschlagen wurden. Rezessive Mutationen von KCC3, die zu einem frühzeitigen Transkriptionsabbruch führen, sind die Ursache für schwere periphere Neuropathie mit oder ohne Agenese des Corpus callosum (ACCPN, OMIM 218000) (Howard et al., 2002). Das so genannte Andermann Syndrom geht nicht nur oft mit der Ausbildung einer Psychose einher, man beachte auch, dass Veränderungen der callosalen Konnektivität für Schizophrenie charakteristisch sind (3).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.1: Chromosom 15q14-15 mit den Stammbäumen der Familien (F) 30, 09 und 11 und polymorphen Markern, mit denen die Region eingeengt wurde, welche im Kopplungsungleichgewicht steht. Der Marker D15S1042 liegt an der oberen, D15S182 an der unteren Grenze des Bereiches, der von allen drei Familien unterstützt wird (15, 25).

3. Fragestellung

3.1 Mutationsanalyse des Gens GCN2 durch automatisierte Sequenzierung

Wie bereits in der Einleitung ausführlich dargestellt wurde, gehört GCN2 zu den wohl wichtigsten Kandidatengenen für Chromosom 15-bezogene Schizophrenie (SCZD10) in den von unserer Gruppe untersuchten Familien. Um die Frage zu klären, ob Veränderungen in GCN2 tatsächlich mit der Erkrankung kosegregieren, sollen Promotorregion sowie alle Exons des Gens dreier Patienten und zweier Kontrollindividuen sequenziert und miteinander verglichen werden. Die kodierende Region wurde zum Teil bereits im Rahmen einer medizinischen Dissertation von Lars Hertner untersucht.

Man erwartet, eine Reihe von Varianten zu finden. Sollten einige davon in der DNA der untersuchten Patienten, nicht aber bei den gesunden Kontrollen zu finden sein, müssen diese in einer größeren Stichprobe genauer untersucht werden.

3.2 Assoziationsstudie einer Variante in Exon 28 von GCN2 durch RFLP Analyse

Im Rahmen der Sequenzierung von GCN2 konnte ein codierender SNP in Exon 28 nachgewiesen werden (GGC (Gly) => TGC (Cys)). Durch die T Variante wird eine sechste Erkennungsstelle in Exon 28 für die Restriktionsendonuclease HpyCH4 V kreiert. Geschnittene Amplicons von Exon 28 können daher anhand ihres Bandenmusters nach der Auftrennung auf Agarosegel dahingehend analysiert werden, ob sie die G oder die T Variante enthalten.

Auf diese Weise sollen ca. 200 Patienten und 200 Kontrollen für den betreffenden Polymorphismus genotypisiert werden. Es soll untersucht werden, ob die Variante signifikant häufiger in Patienten als in gesunden Individuen auftritt.

3.3 Vorbereitungen zur funktionalen Analyse einer seltenen Variante im Promotor von KCC3

In der Vergangenheit konnte unsere Arbeitsgruppe zwei seltene kosegregierende G-Varianten in der Promotorregion und 5´-UTR von KCC3 nachweisen, welche signifikant mit Schizophrenie und bipolaren Psychosen assoziiert sind (Meyer et al., in Vorbereitung).

Da sich diese Varianten in der 5´-regulatorischen Region des Gens befinden, wäre es möglich, dass sie Einfluss auf die Aktivität von KCC3 haben. Diese Möglichkeit soll nun mit einem Luciferase-Assay überprüft werden

3.4 Überprüfung von KCC3 Exon 1A auf Spleißformen

Bei der in unserer Gruppe durchgeführten Annotation bekannter cDNAs von KCC3 konnte für einen Bereich in Exon 1A keine cDNA gefunden werden. Sollte hier ein Intron vorliegen, so läge der (alternative) Transkriptionsstart weiter in 3´ Richtung. Es ist wichtig zu wissen, ob die von uns gewählten Zelllinien zur späteren Transfektion mit dem pGL3 Konstrukt hier alternativ gespleißt werden. Wäre dies der Fall, dann läge der Transkriptionsstart downstream der Nco I Schnittstelle, welche gleichzeitig das Start-Codon (ATG) des Luciferase Gens im späteren Konstrukt beinhaltet.

4. Material

4.1 Materialien allgemein

4.1.1 Klinisch

Die Mitglieder der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten großen Stammbäume (Familien 9 und 11, siehe Abb.2) wurden bereits mehrfach im Detail beschrieben (z.B. Stöber, 2000, 2001, 2002; Meyer, 2002).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthaltenAbbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.2: Stammbäume für Familien 9 und 11, erkrankte Individuen sind durch ausgefüllte Symbole gekennzeichnet, die Symbole für bereits Verstorbene sind durchgestrichen

Aus dieser Stichprobe stammen die Patienten, deren DNA für die Mutationsanalyse (Patient 568, 744 und 834) und Klonierung (Patient 834) im Rahmen dieser Arbeit benutzt worden ist. Familie 11 umfasst drei Generationen mit zehn gesunden und sieben an periodischer Katatonie erkrankten Individuen. Familie 9 setzt sich aus sechs gesunden und fünf betroffenen Personen zusammen. Die diagnostische Charakterisierung innerhalb der Familien mit periodischer Katatonie erfolgte nach ausführlicher klinischer Beurteilung unter Einbeziehung der Krankengeschichte und der Befragung Angehöriger durch die Ärzte der Universitäts- Nervenklinik in Würzburg.

An der Assoziationsstudie mittels RFLP Analyse nahmen insgesamt 217 an periodischer Katatonie erkrankte Patienten und 217 Kontrollpersonen teil. Die Patienten stammen alle aus dem Raum Unterfranken und wurden entweder am Lehrstuhl für Psychiatrie und Psychotherapie der Universität Würzburg oder am Psychiatrischen Kreiskrankenhaus Werneck von erfahrenen Psychiatern ausgewählt. Faktoren wie signifikante neurologische Komorbidität, Epilepsie, geistige Retardierung und Drogenmissbrauch, welche die Homogenität des Patientensamples hätten beeinträchtigen können, wurden dabei ausgeschlossen.

Das Kontrollsample bestand aus Blutspendern, für welche keine psychiatrische Krankengeschichte bekannt war. Die Blutproben wurden von der Transfusionsmedizin und dem Institut für Psychiatrie und Psychotherapie der Universität Würzburg bereitgestellt. Die DNA der Kontrollpersonen TK66 und TK77 wurde auch für die Mutationsanalyse durch Sequenzierung eingesetzt.

Es wurden nur Personen einbezogen, welche dies nach mündlicher und schriftlicher Darlegung von Rahmen und Ziel der Studie durch schriftliche Einverständniserklärung erlaubten. Die Studie wurde durch das Komitee für Ethik der Universität Würzburg genehmigt.

Die im Rahmen dieser Arbeit benutzte DNA wurde weitgehend aus Frischblut der beschriebenen Personen extrahiert. Teilweise wurde sie auch aus Zellkultur gewonnen. Je nach Ausbeute bei der Extraktion wird der DNA Stock auf 400-600 ng/µl eingestellt und für die Arbeitslösung 1:10 verdünnt.

4.1.2 Puffer

Ein Standard PCR Puffer (10x) enthält 500mM KCl, 100 mM tris-HCl (pH 8,3), 0,25 % (V/V) Tween 20, 0,25 mg/ml BSA und 7,5 mM, 10 mM oder 15mM MgCl2.

Für die meisten Elektrophorese - Applikationen benötigt man ausserdem TAE Puffer. Eine 50x Stocklösung enthält 40mM Tris-Acetat und 1mM EDTAxNa2, pH 8,5. Als Arbeitslösung wird meistens 1x TAE verwendet.

4.2 Materialien zur Mutationsanalyse des Gens GCN2 durch automatisierte Sequenzierung

4.2.1 Polymerase chain reaction (PCR)

Für die PCR wurde genomische DNA der Patienten 568, 744, 834 und der Kontrollen TK66 und TK77 verwendet. Die Stocklösungen enthalten etwa 400 – 600 ng/µl DNA. Es wurden 40 – 60 ng pro Reaktionsansatz eingesetzt.

Zur Sequenzierung von Promoter, Exon 1 bis Exon 4 und Exon 10 wurden folgende Primerpaare verwendet:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Für einen Standard PCR Ansatz wurden 10 pmol des jeweiligen Oligonukleotids per Reaktionsgefäß eingesetzt. Neben den Oligonukleotiden benötigte man pro Ansatz 1µl eines Nukleotid-Mixes (je NTP 2,5 mM), 0,5 – 1 U T aq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) sowie ddH2O (Merck, Deutschland) in einem Endvolumen von 25µl. Das System wurde normalerweise durch 0,75 bis 1,5 mM MgCl2 gepuffert (Puffer-Zusammensetzung siehe oben). Die Optimierung und Amplifizierung der Fragmente wurden in einem T-Gradient Thermocycler (Biometra, Göttingen) durchgeführt. Bei schwer zu amplifizierenden Stellen im Gen wurde mit dem Goldstar System (Eurogentec, Seraing, Belgien) gepuffert. Dazu benötigte man pro 25µl Reaktionsansatz 2,5µl des 10x Goldstar Puffers, 1µl MgCl2 (25mM) sowie 2µl DMSO. Der Goldstar Puffer enthält 750mM Tris-HCl (pH 9), 200 mM (NH4)2SO4 und 0,1% Tween 20.

Zur Reinigung der PCR Produkte wurde der QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, Hilden) benutzt und die gereinigte DNA in 30µl ddH2O (Merck, Darmstadt) aufgenommen. Für die genauere Beschreibung der im Kit enthaltenen Materialien siehe Originalprotokoll (http://www.qiagen.com/literature/Handbooks/PDF/DNA_cleanup/INT/QQSpin/1021422_HBQQSpin_prot01.pdf). Bei den Zentrifugationsschritten wurde eine standardmäßige Tischzentrifuge benutzt.

Die Produkte wurden zur Kontrolle ihrer Reinheit s auf ein 1% Agarosegel (1g Agarose in 100 ml 1x TAE Puffer) aufgetragen. Zum Vergleich diente die Standard Peqgold 100bp DNA-Leiter plus (Peqlab, Erlangen; siehe Abb.3):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.3: Standard Peqgold 100bp DNA-Leiter plus (Peqlab, Erlangen)

4.2.2 Sequenzierreaktion

In der Sequenzierreaktion wurden 8 - 12µl des gereinigten Produkts eingesetzt. Weiterhin wurden 4 µl des Sequenziermixes und 2 µl des 5x Puffers aus dem Kit Big dye Terminator v1.1 cycle (Applied Biosystems, Foster City, USA) sowie 2 µl des jeweiligen 2,5 mM Primerpaares ins Reaktionsgefäss gegeben. Für die genauere Beschreibung der im Kit enthaltenen Materialien siehe Originalprotokoll (http://events-na.appliedbiosystems.com/mk/get/V11CYCLE_REG?_A=17401&_D=14667&_V=0). Bei Bedarf wurde mit ddH20 auf 20µl Endvolumen aufgefüllt. Die Sequenzierreaktionen erfolgten im T-Gradient Thermocycler (Biometra, Göttingen).

4.2.3 Fällung und Sequenzierung

Für de Fällung wurden ddH2O, Ethylalkohol (96%, 70%) und Natriumacetat (pH 4,6) benötigt. Die Zentrifugationsschritte wurden mit einer Biofuge fresco (Kendro lab products, Hanau), einer Tischzentrifuge mit Kühlfunktion durchgeführt.

Die gefällten Produkte wurden in jeweils 20µl ddH2O gelöst und mit Hilfe eines ABI 310 Automatisierten Sequenzers (Applied Biosystems, Foster City, USA) sequenziert.

4.3 Materialien zur Assoziationsstudie einer Variante in Exon 28^* von GCN2 durch RFLP Analyse

An der Assoziationsstudie mit RFLP Analyse haben insgesamt 217 an Periodischer Katatonie erkrankte Patienten und 217 Kontrollpersonen teilgenommen. Die Stichprobe wurde bereits oben erläutert.

4.3.1 PCR

Für alle Patienten wurde Exon 28 mit einer Standard PCR (Materialien siehe 4.2.1) amplifiziert. Die Oligonukleotide (10pmol/µl) hatten folgende Sequenz:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die PCR Produkte wurden stichprobenartig auf einem 2% Agarosegel (2g Agarose in 100µl 1x TAE Puffer) gegen eine Standard 100bp DNA Leiter (Peqlab, Erlangen) aufgetragen

4.3.2 Restriktion

Für diesen Schritt wurde die Restriktionsendonuklease HpyCH4 V (5 U/µl, Erkennungssequenz 5´…TG^CA…3´) (BioLabs, Beverly, USA) verwendet. Der geeignete Reaktionspuffer (1x NEB 4, pH 7,9) ist von der Firma mitgeliefert worden. Er enthält 50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat und 1 mM Dithiothreitol. Je nach Konzentration wurden 11-17 µl PCR Produkt, 2 µl Puffer, 1 µl (5 U) Enzym in einem Endvolumen von 20 µl verwendet. Für die Inkubation wurde ein Wasserbad benutzt.

4.3.3 Analyse der Restriktionsfragmente

Für die Analyse wurden zunächst 3% Agarosegele (3 g Agarose auf 100 µl 1x TAE) und ein EtBr2-Bad verwendet. Das Bandenmuster der RFLP Fragmente wurde mit einer UV Lampe sichtbar gemacht und fotografiert.

Später wurde mit 5% Agarosegelen gearbeitet, welche bereits EtBr2 (2 µl auf 100 ml Agarosegel) enthielten.

4.4 Materialien für die Vorbereitungen zur funktionalen Analyse einer seltenen Variante im Promotor von KCC3

4.4.1 PCR

Das 2,8 kb Fragment wurde unter Verwendung der Oligonukleotide KCC3-2,8-F28 (5´-GTT GGC TGC AGT TCT GCC TTT ATC TTA C-3´) und KCC3-2,8-R28 (5´-AAG AGC TAC CTA GCT AAC CCC TCT GGT C-3´) mit dem AdvantageTM GC Genomic PCR System (Clontech, Palo Alto, USA) im T-Gradient Thermocycler (Biometra, Göttingen) amplifiziert. Für die genauere Beschreibung der im Kit enthaltenen Materialien siehe Originalprotokoll (http://www.clontech.com/techinfo/manuals/PDF/PT3090-1.pdf). Zur Überprüfung des Resultats diente ein 1% Agarosegel (1g Agarose in 100ml 1x TAE Puffer) und eine Standard Peqgold 1kb DNA-Leiter (Peqlab, Erlangen; siehe Abb.4).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.4: Peqgold 1kb DNA-Leiter (Peqlab, Erlangen)

4.4.2 Expressionstest

Für den Luciferase-Assay sind SK-N-SH (neuroblastoide Zelllinie), IMR 32 (gliablastoid) sowie eine lymphoblastoide Zelllinie auf die Expression von KCC3 getestet worden. Die Zellen waren bereits in Aliquots bei -70°C gelagert.

Zur Isolation der gesamten RNA aus wurde der RNeasyMidi Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Für die genauere Beschreibung der im Kit enthaltenen Materialien siehe Originalprotokoll (http://www.qiagen.com/literature/Handbooks/PDF/RNA/INT/RNY_Midi_Maxi/1017849HB_prot_cytrna_anim_cell.pdf). Zur Durchführung des Protokolls wurden weiterhin RNAse- freies Wasser, frischer Ethylalkohol sowie der Homogenisierer Potter S (B. Braun Biotech, Melsungen) benötigt. Zur Dekontamination aller Instrumente ist DEPC-Wasser verwendet worden.

Für das Aufkonzentrieren der RNA benötigte man 3M NaAc (pH 5,2), Ethanol (96%, 80%), DEPC-H2O und eine Tischzentrifuge mit Kühlfunktion (Biofuge Fresco, siehe 4.2.3).

Für eine zweite Reinigung der RNA wurde der RNeasy Mini Kit (Quiagen, Hilden) benutzt. Für die genauere Beschreibung der im Kit enthaltenen Materialien siehe Originalprotokoll (http://www.qiagen.com/literature/Handbooks/PDF/RNA/INT/RNY_Mini/1016272HBRNY_cleanup.pdf). Die RNA Konzentration wurde mit einem Photometer ECOM 6122 (Eppendorf, Hamburg) bestimmt (gemessen wurde 1 μl gereinigtes Produkt in 80 μl Tris Puffer).

Je etwa 500 ng der RNA wurden mit dem ThermoScriptTM RT-PCR System (Invitrogen, Karlsruhe) im T-Gradient Thermocycler (Biometra, Göttingen) zu cDNA umgeschrieben. Auch hierfür sind alle Instrumente im Vorfeld mit DEPC-Wasser behandelt worden. Das Originalprotokoll kann unter folgender Adresse eingesehen werden: http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/11146016.pdf.

Zur Überprüfung der RT-PCR Produkte wurde das humane β-Aktin Gen mittels Standard-PCR (siehe 4.2.1) aus der hergestellten cDNA aller Zelllinien nachgewiesen. Es wurden Oligonukleotide folgender Sequenzen verwendet:

[...]

^* Als dieser Bereich sequenziert worden ist, waren einige zu GCN2 gehörende Exons noch unbekannt. Das heutige Exon 28 wurde noch als Exon 23 bezeichnet.