Physikalische Kartierung eines Blutdruck-assoziierten Bereiches auf Chromosom 10 der Ratte

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Projektschema der Diplomarbeit
1.2 Bluthochdruck
1.3 Die Ratte als Tiermodell für die Erforschung komplexer genetischer Erkrankungen
1.4 Die Identifizierung von Genen
1.4.1 Kartierung des BP/SP1 Intervalls
1.4.2 Congene Rattenlinien
1.5 Die positionelle Klonierung (Positional Cloning)
1.5.1 Das Kandidatengen Verfahren zur Genisolierung
1.6 Vektoren zur DNA-Klonierung
1.6.1 Das YAC-System (Yeast Artificial Chromosome)
1.6.2 PAC und BAC Klone als Alternativen zu YACs
1.7 Genomische Bibliotheken und Ressourcen der Ratte
1.7.1 YAC-Bibliotheken
1.7.2 PAC-Bibliothek
1.8 RH-Panel
1.8.1 Radiation-Hybrid Karte der Ratte
1.9 Genetische Kartierung
1.10 Physikalische Kartierung
1.11 IRS-PCR (Interspersed Repetitive Sequence-PCR)
1.12 Problemstellung und Zielsetzung

2 Material
2.1 Chemikalien
2.2 Enzyme
2.3 Radioaktive Isotope
2.4 Medien und Lösungen
2.4.1 Medien
2.4.2 Lösungen
2.5 DNA - Längenmarker
2.6 Geräte und Zubehör

3 Methoden
3.1 Präparation von genomischer Ratten DNA mittels Phenol / Chloroform Extraktion
3.1.1 Scheren von genomischer DNA durch Ultraschall
3.1.2 Bestimmung der DNA-Konzentration
3.1.3 Isolierung von YAC DNA in Agarose-Plugs
3.1.4 Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)
3.1.5 Blotten eines Pulsfeldgels
3.1.5.1 Markierung von genomischer Ratten DNA mit a-[32]P-dCTP
3.1.5.2 Hybridisierung von Pulsfeld-Gel-Filtern mit genomischer Ratten-DNA
3.1.5.3 Waschen der Filter
3.1.5.4 Auswertung
3.2 Herstellung von Radiation Hybrid Filtern
3.2.1 IRS-PCR
3.2.2 Herstellung von RH—Filtern durch Southern Blot
3.2.3 Herstellung von RH-Filtern durch Dot-Blot
3.3 Hybridisierung von YACs auf PAC-Filter
3.3.1 Radioaktive Markierung von YAC DNA mit a-[32]P-dCTP nach der Random-Hexamer-Methode (Baxendale, 1991)
3.3.2 Kompetitive Hybridisierung von YACs gegen PAC-Filter
3.3.3 Waschen der PAC Filter
3.3.4 Strippen der Filter
3.3.5 Auswertung der PAC-Filter
3.4 PAC DNA Isolation
3.4.1 Kontrolle der isolierten PAC-DNA
3.5 IRS-PCR von PACs und elektrophoretische Trennung der PCR-Produkte
3.6 Hybridisierung von PACs gegen RH- und YAC-Pool Filter
3.6.1 Radioaktive Markierung von IRS-PCR Produkten mit a-[32]P-dCTP
3.6.2 Hybridisierung
3.6.3 Filter waschen
3.6.4 Filterauswertung
3.6.4.1 Scoren von RH-Filtern
3.6.4.2 Scoren von YAC-Filtern Hybridisierung von PACs gegen PAC-Filter

4 Ergebnisse
4.1 Aufreinigung von YAC-DNA durch Pulsfeld-Gelelektrophorese und Hybridisierung gegen PAC-Filter Pulsfeldgelelektrophorese von YAC-DNA
4.3 Isolierung von genomischer Ratten-DNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion
Hybridisierung von gereinigter YAC-DNA gegen PAC-Filter aus Set 3
4.5 Hybridisierung von gereinigter YAC DNA gegen PAC-Filter aus Set 4
Vergleich kompetitive/nicht kompetitive Hybridisierung
Hybridisierung mit ungereinigter YAC-DNA
4.8 Isolierung von Plasmid-DNA aus PAC-Klonen
4.9 IRS-PCR von PACs
IRS-PCR des T55 Panels zur Herstellung von RH-Filtern
4.11 Physikalische Kartierung von PACs durch Hybridisierung gegen YAC-Filter
4.12 Radiation Hybrid Kartierung
4.13 Auf Chromosom 10 bestätigte PACs
Rückbestätigung von PACs durch Hybridisierung ihrer IRS-PCR Produkte gegen PAC-Filter

5 Diskussion
5.1 Aufreinigung von YAC-DNA durch Pulsfeld-Gelelektrophorese
5.2 Hybridisierung von gereinigter YAC-DNA gegen PAC-Filter und Vergleich der Hybridisierung mit / ohne Kompetition
5.3 IRS-PCR von PACs
5.4 Vergleich der Herstellung von RH-Filtern über Southern- oder Dot-Blot
5.5 RH-Kartierung von PACs
5.6 Physikalische Kartierung von PACs über YAC-Klone
5.7 Rückbestätigung von PACs
5.8 Zusammenfassung der Diskussion

6 Literaturverzeichnis
6.1 Websiteverzeichnis

7 Anhang
7.1 Durch Hybridisierung von YAC-Klonen gegen PAC-Filter identifizierte PAC-Klone
7.2 Übersicht der Radiation-Hybrid-bzw. über korrespondierende YACs kartierten PAC-Klone

8 Tabellarischer Lebenslauf und Publikationen

9 Eidesstattliche Erklärung

Zusammenfassung

Bluthochdruck, ein wichtiger Risikofaktor für Herz-Kreislauferkrankungen, betrifft etwa 15-20% der Bevölkerung in westlichen Industrienationen. Abgesehen von seltenen monogenetischen Formen wird er in über 90% der Fälle durch die Wechselwirkung von mehreren, bisher weitgehend unbekannten Genen untereinander und mit Umweltfaktoren ausgelöst.

Ein mit Bluthochdruck assoziierter QTL (quantitative trait locus) wurde in der Ratte auf Chromosom 10 gefunden und BP/SP1 bezeichnet (blood pressure/stroke prone). Diese Region ist evolutionär offenbar stark konserviert und findet sich auch beim Menschen auf Chromosom 17, wo ebenfalls eine Assoziation mit Bluthochdruck nachgewiesen wurde. Durch die Etablierung von congenen Linien konnte BP/SP1 in zwei kleinere QTLs, BP/SP1a und BP/SP1b, unterteilt werden, von denen durch IRS-PCR walking (interspersed repetitive sequence) YAC -Klon Contigs bereits konstruiert wurden.

In der vorliegenden Diplomarbeit wurde eine Feinkartierung beider QTLs durch PAC-Klone durchgeführt, d.h. es sollten korrespondierende PACs zu den YAC-Klonen der BP/SP1a und b Contigs gefunden werden. Dazu wurden 37 YAC-Klone aus den BP/SP1a und b Contigs gegen jeweils zwei Hochdichtefilter der PAC-Bibliothek Rat PAC mit 27648 Klonen pro Filter hybridisiert, was etwa zwei Genomäquivalenten pro YAC entspricht.

251 PACs konnten so identifiziert werden. Bei einer anschließenden IRS-PCR lieferten 37,1% der Klone (93 PACs) IRS-PCR-Produkte, die zur Radiation-Hybrid (RH)-Kartierung sowie zur Kartierung über korrespondierende YACs herangezogen wurden.

50 PAC-Klone konnten durch RH-Mapping kartiert werden, davon 33 Klone auf Chromosom 10. Die anderen 17 verteilen sich auf die Chromosomen 1, 6, 7, 11, 12, 13, 15 und 20.

Für 66 PACs konnten durch Hybridisierung gegen YAC-Pool-Filter der beiden Bibliotheken Rat YAC und WI/MIT Rat YAC mit zusammen 20 Genomäquivalenten korrespondierende YACs bestimmt werden, wobei pro Filter zwischen 2 und 15 YACs getroffen wurden. 17 dieser 66 PACs konnten zusätzlich auch RH-kartiert werden.

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Projektschema der Diplomarbeit

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1.2 Bluthochdruck

In vielen Industrienationen wie z. B. Deutschland sind Herz/Kreislauferkrankungen die häufigste Todesursache. Bluthochdruck, der etwa 15-20 % der Bevölkerung betrifft, ist hierfür ein wichtiger Risikofaktor (Lifton et al., 1996). Nach Definition der Weltgesundheitsorganisation WHO gilt beim Menschen ein Blutdruck von 140 mm Hg systolisch oder 90 mm Hg diastolisch als Hypertonie (Chalmers, 1999). Bluthochdruck prädisponiert für Herz-Kreislauferkrankungen wie Schlaganfall, Herzinfarkt, Herzversagen, periphere Gefäßschäden, Nierenversagen, und je höher der Blutdruck, desto schwerer sind die Folgeerkrankungen (Rapp, 2000).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Einteilung des Blutdrucks nach Definition der WHO (Chalmers, 1999)

Bluthochdruck wird in sekundäre und primäre Formen unterteilt. Bei sekundärer Hypertonie, etwa 10% der Fälle, lässt sich eine direkte Ursache finden, am häufigsten sind dies zu ca. 8% Erkrankungen der Nieren. Die restlichen zwei Prozent verteilen sich zu etwa gleichen Teilen auf hormonelle Ursachen und Nebenwirkungen von Medikamenten wie z. B. der Pille (http://www.bundesaerztekammer.de/20/15 Ratgeber/Bluthoch.pdf).

Meistens, in ca. 90 % der Patienten, lässt sich jedoch keine Ursache für Bluthochdruck finden. Diese Form von Bluthochdruck nennt man primären oder essentiellen Bluthochdruck. Etwa 5% davon sind monogenetische Formen mit mendelschem Vererbungsmuster (Lifton, 1996) wie z. B. Mutationen der 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 2 beim Glucocorticoid-hemmbaren Aldosteronismus (Lifton et al., 1992), der b- und g-Untereinheiten des Epithel-Natriumkanals beim Liddle Syndrom (Shimkets et al. 1994; Hansson et al. 1995) oder der 11b-Hydroxysteroid Dehydrogenase beim Syndrom des Apperenten Mineralokortikoid Exzess (Mune et al., 1995).

In den übrigen 95% der Fälle ist die primäre Hypertonie dagegen polygenetisch bedingt. Die dafür verantwortlichen Gene sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Der Blutdruck ist, wie auch z. B. die Körpergröße, ein quantitatives Merkmal. Quantitative Merkmale zeigen in einer Population, bedingt durch komplizierte Gen-Gen und Gen-Umwelt Wechselwirkungen, eine kontinuierliche Variation von niedrigen zu hohen Werten. Genetische Loci, die ein quantitatives Merkmal kontrollieren, werden als QTL bezeichnet (quantitative trait locus). Ein QTL ist dabei als eine Chromosomenregion definiert, die ein oder mehrere Loci enthält, welche ein quantitatives Merkmal beeinflussen, wird aber auch zur Bezeichnung des Locus selbst benutzt (Rapp, 2000).

Da QTLs untereinander wechselwirken können, d. h. additive, subtraktive oder epistatische Effekte zeigen, ist die Erforschung von polygenetischen Krankheiten schwierig. Oft ist der Beitrag eines QTLs zum beobachteten Phänotyp zudem recht klein (Rapp, 1998).

1.3 Die Ratte als Tiermodell für die Erforschung komplexer genetischer Erkrankungen

Die Möglichkeiten zur Aufklärung der relevanten molekularen Mechanismen multifaktorieller polygenetischer Erkrankungen wird z. B. durch die Heterogenität in menschlichen Populationen begrenzt. Der Einsatz von geeigneten Tiermodellen ist daher unerläßlich. Tiermodelle haben den Vorteil, Umweltfaktoren wie Ernährung, Stress oder körperliche Aktivität genau kontrollieren zu können und durch Verwendung von Inzuchtstämmen lässt sich die genetische Komplexität verringern (Lander et al., 1994-95).

Als Modellorganismus bietet sich in diesem Zusammenhang die Ratte an, da sie schon mehr als 100 Jahre in der medizinischen Forschung eingesetzt wird, eine kurze Generationszeit und hohe Anzahl an Nachkommen aufweist und in der Haltung anspruchslos ist. Ein weiterer Vorteil ist, dass durch ihre Größe medizinische Eingriffe in der Regel einfacher als bei der Maus möglich sind, z. B. die Implantation von Telemetriesendern zur Blutdrucküberwachung (Kreutz et al., 1995).

Für die Ratte sind bereits umfangreiche genetische Ressourcen entwickelt worden. Zu ihnen gehören über 12000 genetische Marker, mehrere hochauflösende Kartierungskreuzungen, zwei YAC Klon Banken, eine PAC und eine BAC Klon Bank mit jeweils 10 Genomäquivalenten, cDNA Banken für zahlreiche adulte und embryonale Gewebe sowie ein Radiation Hybrid (RH) Panel (http://ratmap.gen.gu.se/wlinks/ratres.html).

Mehr als 200 ingezüchtete Rattenstämme wurden bisher als Modell für menschliche Krankheiten etabliert, darunter auch einige, die Bluthochdruck spontan (SHR- spontaneously hypertensive rat), zusammen mit einer Neigung zu Schlaganfällen (SHRSP -spontaneously hypertensive rat - stroke prone) oder bei natriumreicher Ernährung (Dahl salt sensitive rat) entwickeln, indem Tiere mit erhöhtem Blutdruck aus einer Population ausgewählt und über viele Generationen miteinander gekreuzt wurden. Sobald der gewünschte Phänotyp in allen Tieren stabilisiert war, wurden Bruder/Schwesterpaare über 20 Generationen miteinander gekreuzt, um genetisch homogene Tiere zu erhalten (Rapp, 2000).

Als normotensiver Referenzstamm wird oft WKY (Wistar-Kyoto) eingesetzt. Der Stamm SHR wurde aus einer WKY Kolonie durch selektive Kreuzung von Ratten mit erhöhtem Blutdruck gezüchtet (Okamoto et al., 1963, 1972). Während der Züchtung von SHR wurde beobachtet, dass eine Teilpopulation eine erhöhte Neigung zu Schlaganfällen zeigte. Aus diesen Tieren wurde der Stamm SHRSP gezüchtet (Okamoto et al., 1974).

Bei WKY-Ratten beträgt der systolische Blutdruck 125-140 mm Hg, bei SHR ca. 160 mm Hg und bei SHRSP 190-250 mm Hg (Jacob et al., 1991).

Das Rattengenom wird momentan von einem Konsortium aus Celera Genomics, Genome Therapeutics, The Institute for Genome Research und The University of British Columbia unter Führung des Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center mittels „Whole genome shotgun approach“ sequenziert (http://hgsc.bcm.tmc.edu/projects/rat/) und man rechnet damit, dass eine erste “Arbeitsversion” mit etwa 4 Genomäquivalenten Ende 2002 fertig gestellt wird (Pennisi, 2000; Marshall, 2001).

Physikalische Karten des Rattengenoms werden aber dadurch dennoch nicht überflüssig. Ein Grund dafür ist, dass aus statistischen Gründen und durch schwer klonierbare DNA-Bereiche selbst bei einer Sequenzierung mit vierfacher Coverage weiterhin Lücken in der veröffentlichten Sequenz verbleiben werden.

Durch IRS-PCR basierte physikalische Kartierung mehrerer Ratten-Klonbanken, z. B. der BAC-, PAC- und YAC-Klonbanken mit zusammen etwa 40 Genomäquivalenten und Integration der so erhaltenen Karten lässt sich dagegen eine wesentlich höhere Coverage erzielen. Nimmt man an, dass 30% der Klone kartierbare IRS-PCR Produkte liefern, könnte man so eine theoretische Coverage von ca. 12,5 erzielen.

Durch physikalische Karten hat man außerdem Zugriff auf DNA eines bestimmten Chromosomenabschnitts in Form der Inserts in den kartierten Klonen. In einer bestimmten Region physikalisch kartierte Klone könnten z. B. gegen cDNA Chips oder Filter hybridisiert werden, um dort transkribierte Sequenzen zu finden.

Die Kombination einer Shotgun-Sequenzierung mit physikalischen Karten hilft ferner auch beim Zusammensetzen der Sequenz und beim Schließen von Lücken. Bei der Sequenzierung von Drosophila melanogaster wurde diese Strategie in Verbindung mit einer BAC-Karte und anderen genomischen Ressourcen erfolgreich eingesetzt (Adams et al., 2000).

1.4Die Identifizierung von Genen

1.4.1 Kartierung des BP/SP1 Intervalls

Um neue mit Bluthochdruck chromosomale Regionen zu finden, kann die Intervallkartierung eingesetzt werden. Dabei wird ein Satz aus Genmarkern, die über das gesamte Rattengenom verteilt sind, auf Cosegregation mit Bluthochdruck in der F2-Generation einer Kreuzung eines Rattenstamm mit und eines ohne Hypertonie getestet. Indem die F2-Generation einer Kreuzung von SHRSP und dem normotensiven Kontrollstamm WKY mit 150 Markern typisiert wurde, konnten mindestens vier mit Bluthochdruck assoziierte chromosomale Regionen identifiziert werden. Der höchste LOD-Score wurde für eine 35 cM große Region auf Chromosom 10 gefunden, die ca. 20% zur Blutdruckvariabilität in dieser Kreuzung beiträgt und somit BP/SP 1 genannt wurde (für blood pressure/stroke prone, Hilbert et al., 1991; Jacob et al., 1991). Im Menschen wurde eine zu BP/SP1 homologe, ebenfalls mit primärem Bluthochdruck assoziierte Region auf Chromosom 17q23 identifiziert (Julier et al., 1997). Durch die Etablierung von congenen Linien (siehe 1.3.2) wurde später gezeigt, dass der BP/SP1 QTL aus zwei kleineren Regionen besteht, die folglich BP/SP1a und b genannt wurden (Kreutz et al., 1995; Dukhanina et al., 1997). Der Locus BP/SP1a ist mit erhöhtem Blutdruck nach NaCl Belastung assoziiert, der Locus BP/SP1b dagegen mit einer erhöhten ACE-Aktivität (Anginotensin converting enzyme) im Blutplasma, aber nicht mit erhöhtem Blutdruck (Kreutz et al., 1995; Rapp, 2000). Für die Region BP/SP1a zwischen den Markern D10Wox11/D10Rat85 und D10Rat69 sowie für BP/SP1b zwischen D10Rat127 und D10Mit1 wurde in unserer Arbeitsgruppe ein YAC-Contig konstruiert (Zimdahl et al., Manuskript im Vorbereitung).

Auf der Milwaukee-Karte des Rattengenoms erstreckt sich das BP/SP1a Intervall von 475-625 ±5 cR (6 cM) und das BP/SP1b Intervall von 940-1080 ±5 cR (7 cM).

In dieser Karte entspricht 1 cR3000 durchschnittlich etwa 155 kb (Wantanabe et al., 1999), so dass sich daraus - grob geschätzt - für BP/SP1a eine Größe von 23,3 Mb und für BP/SP1b von 21,7 Mb ergibt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: Chromosom 10 der Ratte mit BP/SP1a und b Region dargestellt als integrierte genetische und Radiation-Hybrid (RH) Framework-Karte (Gösele et al., 2000). Blau dargestellt sind Mikrosatelliten Marker auf der genetischen Karte (SHRSP x BN) , die auch entweder in der Milwaukee (MCW, Steen et al., 1999) oder/und in der Oxford (OX) RH Framework-Karte (Wantanabe et al., 1999) als Ankermarker vorhanden sind. BP/SP 1a: 475-625 ±5 cR; BP/SP1b 940-1080 ±5 cR bezogen auf die Milwaukee (MCW) RH Framework-Karte.

Marker-Nomenklatur: Marker mit der Bezeichnung „Mdc“ stammen von Claudia Gösele, Max Delbrück Zentrum für molekulare Medizin in Berlin (Gösele et al., 2000). Marker mit dem Symbol „Mit“ wurden in dem Labor von E.S. Lander und von Mitarbeitern am Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research generiert, „Mcw“-Marker von H. Jacob et al. am Medical College of Wisconsin, „Wox“ Marker von M. Janes und M. Lathrop von der Oxford University und „Got“-Marker von A. Tanigami von der Otsuka Pharmaceutical Company (Levan et al., 1995).

1.4.2 Congene Rattenlinien

Durch Intervallkartierung wurde die Position des BP/SP1 QTLs nur mit einer Genauigkeit von ca. 35cM bestimmt (Jacob, 1991). Für eine Positionsklonierung (Positional Cloning) wäre aber eine Auflösung von £1-2 cM idealer. Durch die Etablierung von congenen Linien lässt sich ein QTL im Idealfall auf 1-2 cM eingrenzen, was in der Ratte durchschnittlich etwa 2x10[6] bp oder 50 Kandidatengenen entspricht (je nach Region variabel, Dominiczak et al., 2000).

Congene Linien enthalten einen kleinen Teil eines Chromosoms eines Stammes (Donor) auf dem genetischen Hintergrund eines anderen Stammes (Empfänger). Durch congene Rattenlinien konnte der BP/SP1a QTL bisher auf ca. 6 und der BP/SP1b QTL auf ca. 7 cM eingegrenzt werden, was aber dennoch für eine physikalische Kartierung ausreicht (Kreutz et al., 1995).

Zur Erzeugung von congenen Linien werden F1 Tiere aus einer Kreuzung zwischen einem Stamm mit Hypertonie und einem anderen Stamm mit normalem Blutdruck mit dem normotensiven Stamm rückgekreuzt. Die Nachkommen aus dieser Kreuzung werden genotypisiert und wenn sie den QTL des Hypertoniestammes enthalten, erneut mit dem normotensiven Stamm rückgekreuzt. Diese Prozedur wird für etwa 8-12 Generationen wiederholt. Anschließend werden Bruder-Schwester Paare für ca. 20 Generationen gekreuzt, um eine homozygote congene Linie zu erhalten (Dominiczak et al., 2000).

Durch diese Prozedur erhält man Ratten, die DNA aus einem Hypertoniestamm auf dem genetischen Hintergrund eines normotensiven Stammes enthalten. Diese Tiere werden nun auf die Blutdruckdifferenz zum Hypertoniestamm hin überprüft (Hübner et al., 1999).

Alternativ ist es auch möglich, einen congenen Stamm zu erzeugen, der DNA aus einem normotensiven Stamm auf dem Hintergrund eines hypertensiven Stammes enthält. In diesem Fall sollten Tiere, die den QTL des normotensiven Stammes enthalten, einen niedrigeren Blutdruck als der Hypertoniestamm zeigen (Rapp et al. 1995). Für die Erzeugung von congenen Linien ist eine hoch auflösende genetische Karte mit einer hohen Dichte polymorpher Marker Voraussetzung. Geeignet sind z. B. Mikrosatelliten-, IRS- (I nterspersed R epetitive S equence) oder SNP- Marker (S ingle N ucleotide P olymorphism).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: Prinzip der Lokalisation eines QTL für Blutdruck mit congenen Linien (Hübner et al., 1999; Rapp et al., 1995). Die Linien 1 bis 4 enthalten einen QTL des hypertensiven Stammes SHRSP, die Linien 1-7 den des normotensiven Stammes WKY, jeweils auf dem genetischen Hintergrund des WKY Stammes. Der QTL für Blutdruck liegt zwischen den Markern D und E.

1.5 Die positionelle Klonierung (Positional Cloning)

Hat man durch congene Linien einen QTL auf eine geeignete Größe eingegrenzt, kann mit einer positionellen Klonierung begonnen werden. Das „Positional Cloning“ Verfahren identifiziert mutierte Gene anhand ihrer Position auf einer genetischen Karte. Vorkenntnisse über das mutierte Gen oder die biochemischen Prozesse, an denen es beteiligt ist, sind beim „Positional cloning“ im Gegensatz zur Kandidatengenmethode nicht erforderlich.

Voraussetzung für ein Positionsklonierungsprojekt ist, geeignete Marker zu finden, die mit der untersuchten Mutation gekoppelt sind. Verwendet werden z. B. Mikrosatelliten oder SNP-Marker. Dichte genetische Karten beschleunigen diesen Prozess, da die Wahrscheinlichkeit, mit der eine Mutation in der Nähe eines genetischen Markers liegt, mit der Anzahl der kartierten Marker ansteigt.

Im Rahmen einer Positionsklonierung wird normalerweise zunächst ein Kloncontig konstruiert, das aus überlangen Klonen, z. B. YACs besteht, die Marker von beiden Seiten der Mutation enthalten. Anschließend erfolgt eine Feinkartierung, indem man das YAC-Contig in ein Contig aus Klonen mit kürzeren Inserts übersetzt, z. B. in PACs oder BACs. Um transkribierte Sequenzen zu finden, kann man diese Klone anschließend in cDNA Klone übersetzen und sequenzieren (Rapp, 1995).

Da aber auch Mutationen außerhalb von transkribierten Sequenzen, z. B im Promoterbereich eines Genes für die Pathogenese z. B. von Bluthochdruck relevant sein können (Jeunemaitre, 1998), ist der bessere, allerdings arbeitsintensivere Ansatz, aus dem PAC/BAC-Contig eine Shotgun-Library zu generieren und diese zu sequenzieren.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3: Positionsklonierungsstrategie am Beispiel des BP/SP1b QTL auf Chromosom 10 der Ratte zwischen den Genen für NGFR (nerval growth factor receptor) und ACE (angiotensin converting enzyme). Zunächst wird durch IRS-PCR walking (Hunter et al., 1997) ein YAC-Contig erstellt, das anschließend in PAC- oder BAC-Contigs übersetzt wird. Aus den so ermittelten PAC/BACs wird dann eine Shotgun-Bibliothek und danach ein Shotgun Klon-Contig erzeugt. Die Insertlänge der Shotgun Klone ist so klein, dass eine direkte Sequenzierung möglich ist.

Eine alternative Strategie ist, das PAC/BAC Contig in cDNA Klone zu übersetzen und diese zu sequenzieren, um die Sequenz von möglichen Kandidatengenen zu erhalten.

1.5.1 Das Kandidatengen Verfahren zur Genisolierung

Der Erfolg einer Positionsklonierung hängt ab vom Auftreten chromosomaler Deletionen, Translokalisationen oder Trinucleotidwiederholungen sowie von einer dichten Anzahl von Markern in enger Nachbarschaft zum anvisierten Gen. Im Gegensatz zur Positionsklonierung basiert die Kandidatengenmethode auf schon vorhandenen Informationen über Funktion und die Kartierungsposition von bereits isolierten Genen.

1.6Vektoren zur DNA-Klonierung

1.6.1 Das YAC-System (Yeast Artificial Chromosome)

YACs sind künstliche Hefechromosomen, die sehr große Inserts (Æ ca. 800 kb) aufnehmen können, was eine schnelle Kartierung größerer DNA Bereiche mit relativ wenigen Klonen ermöglicht (Burke et al.,1987). Der hohe Grad an Chimärismus (>30%), Instabilität und Schwierigkeiten in der Handhabung der Klone sind die Nachteile von YAC-Banken (Selleri, et al. 1992). Ein YAC-Vektor enthält unter anderem einen Replikationsursprung, ein Centromer, selektierbare Marker sowie Telomere. Will man intakte hochmolekulare YAC-DNA z. B. für Pulsfeldgelelektrophorese isolieren, so ist es erforderlich, die DNA aus in Agarose eingebetteten Hefezellen zu isolieren. Durch die Agarose-Matrix wird die DNA bei der Isolierung gegen Scherkräfte geschützt. Bei geringeren Qualitätsanforderungen an die isolierte DNA, z. B. für eine IRS-PCR, kann sie auch per Phenol-Chloroform-Extraktion gewonnen werden (Sambrook et al., 2001).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4: Prinzip der Klonierung in YAC Vektoren. TEL sind telomere Sequenzen, ORI ein Replikationsursprung, CEN ist ein Centromer, A und B sind selektierbare Marker (Burke, 1987).

1.6.2 PAC und BAC Klone als Alternativen zu YACs

Zu Beginn der 90er Jahre wurden bacterial artificial chromosomes (BACs, Shizuya, 1992) und P1-derived artificial chromosomes (PACs, Ioannou, 1994) als Vektoren entwickelt, die Inserts von durchschnittlich etwa 150 kb aufnehmen. BACs basieren auf dem Fertilitätsplasmid von E. coli, PACs auf dem P1-Phagen. Die Chimerismusrate in BACs und PACs ist sehr gering (0-1 %, Osoegawa et al., 2000), und aufgrund der strikt kontrollierten Replikation sind die Klone genetisch deutlich stabiler als YACs.

In der in der vorliegenden Diplomarbeit verwendeten RPCI-31 Rat PAC Bibliothek wurden bisher keine chimärischen Klone gefunden (Woon et al., 1998), während in der RPCI21 Mouse PAC Klonbank 1% Chimärismus ermittelt wurde (Osoegawa et al., 2000).

Ein weiterer Vorteil der E. coli basierten BAC und YAC Klone ist ihr wesentlich schnelleres Wachstum verglichen mit den S. cerevisiae basierten YACs und die dadurch bedingte Zeitersparnis. Die DNA Isolierung ist bei BAC und PAC Klonen bereits 12 h nach dem Animpfen einer Kultur möglich, verglichen mit 48 h bei YACs.

Aufgrund dieser Vorteile sowie der unkomplizierten Handhabung und Manipulation sind BACs und PACs heutzutage die meistbenutzten Vektoren (Klysik et al. 1999). DNA kann aus BACs und PACs mittels Mini-Prep in hoher Qualität isoliert werden. Eine Einbettung der Zellen in Agarose zur Aufrechterhaltung der DNA-Integrität ist nicht erforderlich, da die zirkuläre PAC-Plasmid DNA weniger scherempfindlich als lineare DNA ist, z. B. YACs (Sambrook et al., 2001).

1.7 Genomische Bibliotheken und Ressourcen der Ratte

1.7.1 YAC-Bibliotheken

Bisher wurden für die Ratte zwei YAC-Bibliotheken konstruiert, RatYAC sowie WI/MIT RatYAC.

Die Bibliothek RatYAC (RCPI -916) wurde mit DNA aus der Milz einer weiblicher R. norvegicus des Stammes SHRSP konstruiert, die in den 19,5 kb großen Vektor pCGS966 (Smith, 1990) kloniert wurde. Sie besteht aus ~50688 Klonen mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 736 kb, was ca. 9,8 Genomäquivalenten entspricht. Als Wirtsstamm dient S. cerevisiae AB1380 und als Selektionsmedium YAC broth mit Ampicillin. Etwa 30% der Klone sind chimärisch (Cai, 1997).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 5: pCGS966 Plasmidkarte. CEN4, Centromer; ARS1, Hefe Replikationsursprung; TK, Thymidin-Kinase; Amp, Ampicillinresistenzgen; TEL, Telomer; Neo, Neomycinrestistenzgen; ori, E. coli Replikationsursprung (Smith, 1990).

Die andere YAC-Bibliothek, WI/MIT Rat YAC (RPCI-933), wurde mit DNA aus der Niere einer weiblichen Ratte des Stammes Fisher 344 unter Verwendung der Vektoren pRLM1 und pRLM2 (Spencer, 1993) generiert. Sie enthält ~41568 Klone mit einer mittleren Insertlänge von 830kb, was etwa 9 Genomäquivalenten entspricht. Als Wirt dient der Hefestamm S. cerevisiae J57 (Haldi et al., 1997). Der Vektor besteht aus zwei Armen auf getrennten Plasmiden. Der pRML1 Vektor Arm enthält einen TRP1 Marker mit Promoter und der pRML2 Arm einen URA3 Marker. Somit ist eine gleichzeitige Selektion für Trp+ und Ura+ Transformanten möglich. PRML1 enthält außerdem ein Hefe Centromer mit benachbartem GAL1 Promoter und ein Thymidin-Kinase Gen. Die Kopienanzahl des Vektors läßt sich durch Selektion für Thymidinkinase und Wachstum auf Galaktose zur Inaktivierung des Centromers erhöhen (Haldi, 1996). Die Vektoren pCGS966 und pRLM1/2 enthalten ein Ampicillinresistenzgen als selektierbaren Marker.

[...]