Konstruktion und Charakterisierung rekombinanter bispezifischer Antikörper-Fragmente zur experimentellen Therapie der Hodgkinschen Krankheit

Inhaltsverzeichnis

1.Einleitung
1.1. Die Hodgkinsche Krankheit
1.2. Molekularbiologische Eigenschaften von Hodgkin- und Reed-Sternberg-Zellen
1.3. Das CD30-Antigen
1.4. Cytotoxische Mechanismen von natürlichen Killerzellen
1.5. Struktur und Funktion von Immunglobulinen und bispezifischen Antikörper-Fragmenten (Diabodies/Tandemdiabodies)

2. Aufgabenstellung

3. Zusammenfassung.

4. Material.
4.1. Laborbedarf
4.2. Geräte
4.3. Chemikalien
4.4. Puffer, Medien und andere Lösungen
4.5. Enzyme
4.6. Antikörper
4.7. Bakterienstämme
4.8. Zelllinien
4.9. Oligonucleotide
4.10. Vektoren

5. Methoden..
5.1. Molekularbiologische Methoden
5.1.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
5.1.2. Splice overlap extension -PCR
5.1.3. Restriktionsspaltung von DNA
5.1.4. Agaroseelektrophorese von DNA-Fragmenten
5.1.5. Dephosphorylierung von 5´-Enden der linearisierten Vektoren
5.1.6. Ligation von DNA-Fragmenten
5.1.7. Transformation von kompetenten Bakterien
5.1.8. Isolierung von Plasmid-DNA aus E.Coli
5.1.9. Konservierung der Bakterienklone
5.2. Proteinbiochemische Methoden
5.2.1. Präparation von periplasmatischen Extrakten
5.2.2. Großexpression von Antikörper-Fragmenten in E. Coli
5.2.3. Isolierung von Antikörper-Fragmenten aus dem periplasmatischen Raum
5.2.4. Dialysemembranen
5.2.5. Ammoniumsulfatpräzipitation der Antikörper-Fragmente
5.2.6. Immobilisierte Metall-Chelat-Chomatographie (IMAC)
5.2.7. SDS-PAGE
5.2.8. Westernblot-Analyse
5.2.9. Überprüfung des Klonierungserfolgs
5.2.10. Ionenaustauschchromatographie
5.2.11. Bestimmung der Protein-Konzentration
5.2.12. Bestimmung des Antikörper-Formats
5.3. Zellkultur-Methoden
5.3.1. Kultivierung eukaryontischer Zellen
5.3.2. PBMC-/Granulozyten-Präparation
5.3.3. BsAk-vermittelter in vitro- Cytotoxizitätstest
5.4. Durchflusscytometrie
5.4.1. Bindungstest von periplasmatischen Extrakten und aufgereinigten Antikörper-Fragmenten
5.4.2. Titration der bsAk auf CD16+- bzw. CD30+-Zellen
5.4.3. Cell-surface-retention -Test
5.4.4. Messung der in vitro -Stabilität der Antikörper-Fragmente

6. Ergebnisse
6.1. Klonierung von Antikörper-Fragmenten
6.1.1. Klonierung eines Konstrukts für einen bispezifischen anti mCD30/C16-TandDb scFv10-SL-scFv
6.1.2. Klonierung eines Konstrukts für einen bispezifischen anti-mCD30/CD16-TandDb scFv6-SL-scFv
6.2. Test des TandDb-Konstrukts zur Auswahl des Klons für die Expression in der Großkultur
6.3. Aufreinigung der in Großkulturen exprimierten Antikörper-Fagmente
6.4. Bestimmung der Proteinkonzentration
6.5. Bestimmung des Antikörper-Formats
6.6. Überprüfung der Reinheit der Antikörper-Fragmente
6.7. Charakterisierung der isolierten PBMC/Granulozyten
6.8. Bindungstest und Titration der Antikörper-Fragmente auf diversen Zelllinien
6.9. Cell-surface-retention -Test
6.10. Antikörper-vermittelter in vitro- Cytotoxizitätstest mittels PBMC gegen die Hodgkinzelllinie L540CY
6.11. Messung der in vitro- Stabilität der bsAk

7. Diskussion
7.1. Mutagenese der anti-CD30-scFv–Domäne
7.2. Auswahl der Peptide für die kovalente Verbindung von Fv-Domänen
7.3. Großexpression und Aufreinigung der Antikörper- Fragmente in E. Coli
7.4. Charakterisierung der rekombinanten Antikörper-Fragmente
7.5. Vermittlung einer NK-Zell–induzierten Tumorzelllyse durch anti-mCD30/CD16-bsDb/scDb in vitro
7.6. Vergleich der anti-mCD30/CD16-bsDb/scDb

8. Ausblick

9. Literaturverzeichnis

10. Anhang
10.1. Klonierungsschema für die Herstellung von anti-CDm30/CD16-TandDb
10.2. Vektorkarten und Sequenzen
10.3. Abkürzungsverzeichnis

1. Einleitung

Eine essenzielle Eigenschaft von multizellulären Organismen ist die Regulation von Proliferation und Apoptose. Im adulten Stadium besteht zwischen Wachstum und Differenzierung auf der einen und dem programmierten Zelltod auf der anderen Seite ein Fließgleichgewicht, bei dem sich die Gesamtzahl der Zellen die Waage hält. Eine Form der Störung dieser Homöostase stellen maligne Erkrankungen dar, bei denen es zu einer massiven Proliferation einer entarteten Zelle kommt. Eine Krebsgeschwulst ist die Ursache einer einzelnen klonal expandierenden, autologen und transformierten Zelle, die sich im Allgemeinen nicht weiter differenziert und nur unzureichend der Immunüberwachung unterliegt.

Die Tumorigenese ist ein Mehrstufenprozess, bei dem die Zelle durch somatische Mutationen Eigenschaften erwirbt, die zu einer Transformation in eine neoplastische Spezies führen. Im Allgemeinen sind Tumorzellen unempfänglich für Wachstumsinhibitoren, unabhängig von Wachstumssignalen, besitzen ein unbegrenztes replikatives Potenzial und oftmals eine unzureichende Apoptoseinduzierbarkeit. Die Motilität erlaubt den Zellen durch proteolytische oder amöboide Überwindung der Basalmembran über die Blut- oder die Lymphbahnen in andere Gewebe zu metastasieren [Weinberg et al., 2000]. Die Eigenschaften der neoplastischen Zellen ähneln häufig denen der Vorläuferzelle, aus der sie entstanden ist. Bei der Hodgkinschen Krankheit (HK) entsteht die maligne Zelle aus einem B-Lymphozyt eines Keimzentrums [Kanzler et al., 1996, Stein et al., 1999; Abe, 2001].

1.1 Die Hodgkinsche Krankheit

Sir Thomas Hodgkin veröffentlichte 1832 einen Bericht über einige Fälle von unbekannten Tumoren in den Lymphknoten und der Milz [Hodgkin, 1832]. Die Histologie wurde 1898 systematisch von Carl Sternberg beschrieben [Sternberg, 1898] und 1902 von Dorothy Reed ergänzt [Reed, 1902]. Die HK bildet eine der zwei großen Untergruppen der Lymphome und ist der komplizierteste lymphatische Tumor. Sie unterscheidet sich von den non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) durch das auftreten der neoplastischen Hodgkin (einzellig) und Reed-Sternberg- (H-RS-) Zellen (mehrkernige Riesenzellen). Statistisch erkranken 3 von 100.000 Menschen jährlich an dieser Krankheit. Die HK tritt am häufigsten bei Jugendlichen und im Alter zwischen 30 und 40 Jahren auf [Hiddemann, 2000], Männer erkranken aus unbekannten Gründen signifikant häufiger als Frauen (Verhältnis 3,5:1) [Chang et al., 1996].

Typisch für das Krankheitsbild ist die im Bereich des Cervix und des Mediastinums auftretende Lymphknotenschwellung. Von dort aus metastasieren die Zellen zunächst in den Brustbereich der Lunge und des Herzens. In späten Krankheitsstadien treten Metastasen unterhalb des Zwerchfells, in der Milz, dem Knochenmark und der Leber auf. Das Krankheitsbild kann von B-Symptomen wie Nachtschweiß, genereller Juckreiz, Alkoholschmerz, leichte Trombozytose, Fieber und einer Gewichtsreduktion von bis zu 10% in sechs Monaten begleitet werden [Kaplan, 1980].

Die Diagnose beruht auf Lymphknotenexzision mit anschließender histologischer Untersuchung des Gewebes und Nachweis der H-RS-Zellen. Typisch ist die rosettenförmige Anordnung von nicht-malignen und hyperreaktiven Lymphozyten, Plasmazellen, Monozyten/Makrophagen, neutrophilen Zellen, eosinophilen Zellen und Stromazellen um die neoplastischen Zellen [Lukes et al., 1966]. H-RS-Zellen machen daher interessanterweise weniger als 1 % der gesamten Tumorzellmasse aus. Das Auftreten von spezifischen Interaktionen von Immunzellen mit neoplastischen Zellen ist charakteristisch bei Hodgkin-Lymphomen und das Ergebnis der Cytokin- und Chemokinsekretion des Tumorgewebes. Diese Lymphozyten werden allgemein als TIL (tumorinfiltrierende Lymphozyten) bezeichnet und sind in der Progression der Krankheit involviert [Kaplan, 1980, Pinto et al., 1998].

Die HK wird in vier Unterklassen eingeteilt: 1) lymphohistiozytäre Form (LP = lymphocyte predominant), 2) noduläre Sklerose (NS), 3) Mischzelltyp (MC = mixed cellularity), 4) Lymphozyten-arme Form (LD = lymphocyte depleted) [Kaplan, 1980]. Des weiteren wird die Krankheit zur klinischen Beurteilung in vier Stadien unterteilt. Die Stadien I-IV beschreiben die Tumorregionen mit ansteigender Tumorzellmasse und sind nochmals unterteilt in A (keine B-Symptome) und B (B-Symptome mit Fieber und Gewichtsverlust). Stadium IV beschreibt ein im Organismus weit verteiltes Tumorwachstum, auch in Organen außerhalb des Lymphsystems mit sehr großer Tumormasse und entsprechend schlechter Prognose [nicht genannte Autoren; http://health.medscape.com/cx/viewarticle/207624, 1999].

Zur Behandlung der HK werden die Chemotherapieschemata MOPP (Mechlorethamin, Vincristin, Procarbazin, Prednison) und neuerdings ABVD (Doxorubicin, Bleomycin, Vinblastin, Dacarbazin) in Kombination mit Bestrahlung der befallenen Regionen durchgeführt. Eine Remission erreichen 90 % der Patienten in frühen und etwa 75 % in fortgeschrittenen Stadien [DeVita et al., 1993]. Die Rezidivrate bei Hodgkin-Patienten ist jedoch hoch; bei 20 – 35 % der Patienten tritt die Krankheit nach einer Latenzzeit von bis zu 10 Jahren erneut auf (am häufigsten innerhalb der ersten drei Jahre). Bei einem Rückfall bleiben weniger als 30 % nach einer zweiten Therapie tumorfrei [Sundarapandiyan et al., 2001]. Studien belegen, dass 85 % aller Patienten nach 15 Jahren noch leben. Insgesamt erreichen 80 % der therapierten Patienten langfristig eine komplette Remission [nicht genannte Autoren; http://health.medscape.com/cx/viewarticle/207624, 1999].

1.2. Molekularbiologische Eigenschaften von Hodgkin- und Reed-Sternberg-Zellen

Untersuchungen mit immunophänotypischen Methoden von H-RS-Zellen zeigen ein stark differenzielles Expressionsmuster und machen eine Zuordnung des Zellursprungs nicht möglich [Stein et al., 1982; Strauchen et al., 1986]. PCR-Einzelzellanalysen haben jedoch ergeben, dass monoklonale Immunglobulin-Gen-Umlagerungen mit somatischen Mutationen in 95 % der HK-Fälle auftreten [Stein et al., 1999]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass in den meisten, wenn nicht in allen Fällen die H-RS-Zellen von einer Antigen-selektierten B-Zelle aus einem Keimzentrum abstammen [Kanzler et al., 1996; Schwartz, 1997; Kuppers et al., 1998; Abe, 2001]. Die Fähigkeit zur Metastasierung und das Auftreten von Aneuploidität und der Präsenz von Onkogenen und Mutationen in Tumorsupressorgenen wie z. B. bcl-2, p53 und N-ras zeigen die neoplastische Natur der Zellen [Gruss et al., 1996; Martin-Subero et al., 2002; Joos et al., 2002]. H-RS-Zellen zeigen in allen Fällen Parallelen zu professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Die Zellen exprimieren die dafür notwendigen Adhäsionsmoleküle ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58) und die aktivierenden Oberflächenmarker CD27L (CD70), CD 80, CD86, CD30, CD40 sowie CLIP beladene MHC-Klasse II Moleküle (HLA-DR) [Gruss et al., 1996; Bosshart, 1999]. Neben den aktivierenden Oberflächenmarkern sind CD15, IL-1R, IL-2R(abg), IL-6R, IL-9R, IL-13Ra, 4-1BB, CD40 und CD95L auf H-RS-Zellen vorhanden. Außerdem sezernieren die Zellen wenigstens 12 Cytokine, darunter IL-1a, IL-5, IL-6, M-CSF, TNFa und TNFb [Gruss et al, 1994; Schwartz, 1997].

Die Mimikry einer APC und die freigesetzten Cytokine der H-RS-Zellen führen zu einer Aktivierung zahlreicher Zellen des Tumorinfiltrats und induzieren eine inflammatorische Reaktion in unmittelbarer Umgebung. Besonders CD4+ T-Zellen werden von H-RS-Zellen stark und unspezifisch aktiviert. Das Bedeutet, dass die CD4+ T-Zellen die Cytokine IL-2, IL-4, IL-6, IL-9, M-CSF, CD30L und CD40L sezernieren und damit die lokale Immunreaktion erzeugen. Das Cytokinprofil entspricht einer Th2-ähnlichen Immunantwort [Poppema et al., 2000]. CD4+ T-Zellen die von H-RS-Zellen stimuliert werden, zeigen nach der Aktivierung abgeschwächte Immunfunktionen. Sie sekretieren nur wenig IL-2 und sind gleichzeitig anergisch gegen die Stimulation mit diesem Wachstumsfaktor. Die signifikante Rolle von CD4+ T-Zellen in der Progression von Hodgkintumoren wurde am Mausmodell bestätigt: SCID-Mäuse entwickeln nach subkutaner Injektion von Hodgkinzelllinien xenogenes Tumorwachstum. Keine der Zelllinien wächst jedoch in T-Zell-defizienten Nackt-Mäusen [von Kalle et al, 1992]. Die bei Hodgkin-Patienten oft beobachtete zelluläre Immunschwäche ist Ursache der gleichzeitigen Suppression einer Th1- und CD8+ T-Zell vermittelten Immunantwort. Durch das entstehende komplexe und bisher noch wenig verstandene Cytokin- und Chemokinnetzwerk werden auch neutrophile Zellen, eosinophile Zellen, Plasmazellen, Fibroblasten und Stromazellen durch Chemotaxis angelockt und beeinflusst [Gruss et al., 1994].

Durch die wechselseitigen Interaktionen mit den TIL können die H-RS-Zellen eine Reihe aktivierender und anti-apoptotischer Signale zum Überleben und zur Proliferation erhalten [Pinto et al., 1998]. Wahrscheinlich benötigen die H-RS-Zellen diese Signale konstitutiv und aus diesem Grund können keine Hodgkin-Zelllinien aus frühen Stadien etabliert werden [Gruss et al., 1994]. Die Initiation der Signaltransduktion durch Interleukine (IL-4, IL-6, IL-13) über den Jak-STAT (Janus kinase, signal transducer and activator of transcription)–Weg spielt eine zentrale Rolle in Hodgkin-Lymphomen (HL). STAT 3 und STAT6 sind typischerweise in H-RS-Zellen konstitutiv phosphoryliert. Diese Transkriptionsfaktoren halten die genetischen Grundlagen für eine anhaltende Cytokinsekretion aufrecht [Skinnider et al., 2001]. Der ebenfalls konstitutiv aktivierte Transkriptionsfaktor NF-kB (nuclear factor k B) ist für den Erhalt des pathobiochemischen Netzwerks der aktivierenden Oberflächenmarker und einiger anti-apoptotischer Proteine in H-RS-Zellen verantwortlich und führt bei Inhibition zu massiver Apoptose [Hinz et al., 2001]. Die Signaltransduktion von NF-kB erfolgt über RANK (receptor activator of nuclear factor k B)/RANKL-Interaktionen. Beide Oberflächenmarker werden von H-RS-Zellen exprimiert und lösen so eventuell einen Mechanismus aus, der zu einer autokrinen Aktivierung der Zellen führt [Fiumara et al., 2001].

Die Subtypen der HK reflektieren unterschiedliche Cytokinprofile der H-RS-Zellen: Noduläre Sklerose führt durch TGF-b und PDGF zur Überproduktion und somit zu Ablagerungen von Kollagen im Tumorgewebe. Die Eosinophilie des Mischzell-Typs wird durch IL-5 verursacht und TNF-a verursacht beim Lymphozyten-armen Subtyp eine Lymphopenie [Schwartz, 2001; Skinnider et al., 2001]. Die vom Tumorgewebe produzierten Cytokine IL-1, IL-6 und TNF-a zeigen darüber hinaus auch systemische Wirkung und verursachen die B-Symptome wie Fieber und Gewichtsverlust [Gruss et al., 1994].

H-RS-Zellen können vom Immunsystem erkannt und potenziell abgetötet werden, besonders wenn diese EBV-transformiert sind. Die Zellen besitzen jedoch vielfältige Möglichkeiten, sich der Immunabwehr zu entziehen [Gruss et al., 1994; Poppema et al., 1998; Bladergroen et al., 2002] und sind in der Lage, in ihrer eigens erzeugten inflammatorischen Umgebung zu überleben [Cossman et al., 1998].

1.3. Das CD30-Antigen

Das CD30 Antigen gehört zur Familie der Tumornekrosefaktor-Rezeptoren (TNFR). Monoklonale Antikörper gegen CD30, wie z.B. Ki-1 und Ber-H2, erkennen ein 120 kDa schweres phosphoryliertes Transmembranglycoprotein und ein unphosphoryliertes 84kDa-Vorläuferprotein [Gruss et al, 1994]. Extrazellulär befinden sich sechs Cystein-reiche Domänen. Intrazellulär wird die Signalkaskade nach Binden des Liganden (CD30L, CD153) durch Adhäsion der TNFR-assoziierten Faktoren (TRAF) 1, TRAF2, TRAF3 und TRAF5 initialisiert. Diese Moleküle verbinden das CD30-vermittelte Signal mit anderen Signalkaskaden der TNFR-Familie, die Aktivierung, Apoptose und Proliferation regulieren [Gedrich et al., 1996; Aizawa et al., 1997; Boucher et al., 1997].

Die Expression von CD30 wird in gesunden Individuen nur auf wenigen lymphoiden Zellen Antigen-stimulierender Gewebe gefunden, dazu gehören hyperblastische Lymphknoten und die Mandeln [Stein et al., 1985]. Zellen, die mit HTLV oder mit EBV transformiert sind, humane NK-Zell Klone, aktivierte B- und T-Zellen und T-Gedächtniszellen sind CD30 positiv. Eine Überexpression dieses Markers wurde bisher ausschließlich auf Tumorzellen der HK, dem ALC-Lymphom und auf dem Embryonalkarzinom nachgewiesen [Pallesen et al., 1982; Stein et al., 1985; Gruss et al, 1994].

Das cd30 -Gen ist auf Chromosom 1p36 lokalisiert und besteht aus 24 kb mit acht Exons und sieben Introns. Untersuchungen von Dürkop et al. haben gezeigt, dass die starke Expression auf malignen Zellen auf einen Polymorphismus einer ATCC-reichen Mikrosatellitenregion im CD30-Promoter zurückzuführen ist. Die Promoterstärke korreliert mit der Länge dieser Region. In einigen Fällen von CD30+- Tumorzellen ist die Region im Vergleich zu CD30- -Zellen um über 550 bp länger. Auf diese Weise wird die CD30-Expression um bis zum Achtfachen verstärkt [Dürkop et al., 2001].

Statistisch sind HL zum Großteil CD30-positiv. In 84 bis 91 % der untersuchten LD, MC und NS Fälle kann das Antigen nachgewiesen werden. Eine Ausnahme ist die LP-Subform, die nur in 32% der Fälle CD30 positiv ist [Drexler et al., 1987].

Die lösliche Form von CD30 (sCD30) kann als 85kDa-Molekül im Serum von CD30+ Hodgkin-Patienten nachgewiesen werden. SCD30 eignet sich als somit Tumormarker, da eine Überexpression nur auf den malignen Zellen auftritt und die Konzentration im Serum etwa mit der Tumormasse korreliert. Werte von über 100 U/ml sind pathologisch. Das Auftreten von sCD30 im Serum wird mit signifikant schlechteren Heilungsaussichten durch eine höhere Rückfallrate und progressiverem Tumorwachstum in Verbindung gebracht. Eine Untersuchung vom sCD30-Signaling in vitro zeigt eine höhere Affinität an CD153 und eine mögliche biologische Funktion in vivo [Hargreaves et al., 2002]. Nach einer kompletten Remission lässt sich der sCD30-Marker im Blut des Patienten nicht mehr nachweisen [Gruss et al., 1994].

1.4. Cytotoxische Mechanismen von natürlichen Killerzellen

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind akzessorische Effektorzellen des lymphatischen Systems mit sichtbaren zellulären Granula und stellen etwa 15 % der gesamten Lymphozytenpopulation dar. Sie entstehen im Knochenmark aus dem pluripotenten hämatopoetischen Stammzellpool über eine lymphoide Vorläuferzelle und unterliegen keiner antigenspezifischen Selektion. NK-Zellen sind per Definition Nicht-B-Nicht-T-Zellen, CD3- und in der Lage, ein begrenztes Spektrum anormaler Zellen zu erkennen und zu töten [Miller, 2001].

CD56 (NCAM) ist ein Zelladhäsionsmolekül, das auf allen NK-Zellen nachgewiesen werden kann. Es ist ein wichtiger Marker zur Aufreinigung und Charakterisierung dieser Zellen. Bei humanen NK-Zellen treten abhängig von der Dichte des CD56-Antigens auf der Zelloberfläche zwei Subpopulation auf: CD56 bright (starke Expression) und CD56 dim (schwache Expression) besitzen unterschiedliche phänotypische Eigenschaften. CD56 dim -NK-Zellen haben eine hohe natürliche Cytotoxizität und sind CD16+, dieser Zelltyp macht etwa 90 % der gesamten NK-Zell-Population aus. Der verbleibende Teil der Population ist CD56bright CD16dim oder CD56bright CD16- und kann Cytokine zur Aktivierung von Monozyten produzieren. Diese Subpopulation ist die einzige bisher bekannte Lymphozytenart, die konstitutiv den hochaffinen IL-2R (IL-2Rabg) exprimiert und ohne Costimulation bei picomolaren IL-2 – Konzentrationen proliferiert. CD16+ NK-Zellen tragen den IL-2Rbg und sind selbst durch hohe IL-2 Konzentrationen (bis 10 nM) in vitro nicht stimulierbar [Cooper et al., 2001]. Die Funktion des Zelladhäsionsmoleküls CD56 ist noch ungeklärt. Die frühere Annahme, dass CD56-Interaktionen zwischen der NK-Zelle und der Zielzelle vermittelt, konnte nicht bestätigt werden [Cooper et al., 2001].

Rezeptoren auf NK-Zellen (NKR) erkennen ein oder mehrere (klassische und/oder nicht-klassische) MHC Klasse-I-Allele auf der Oberfläche von Zielzellen, die auf normalen Zellen vertreten sind, und generieren ein inhibitorisches Signal. Eine zu geringe oder gar fehlende Expression dieser Moleküle führt durch Interaktion der Signalkaskade mit aktivierenden NK-Zell Rezeptoren zur Induktion der NK-Zell vermittelten Cytotoxizität (MHC-Klasse-I-Überwachung). Untersuchungen an TAP-defizienten Patienten, die nur 1-3 % der normalen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren, zeigen drastische Änderungen in der Zusammensetzung der NK-Zell Population und lassen vermuten, dass die NK-Zell-Reifung MHC-Klasse-I-abhängig ist [Cooper et al., 2001]. Obwohl bereits zahlreiche NCRs (natürliche Cytotoxizitätsrezeptoren, wie z.B. NKp30, NKG2D, NKp44) und inhibierende NKRs (z.B. KIR (killer cell Ig-like receptor)) identifiziert und charakterisiert worden sind, ist das komplexe Zusammenspiel aus Expression der Rezeptoren und Interaktion von aktivierenden und inhibierenden Signalen noch wenig verstanden [Moretta et al., 2000; Cooper et al., 2001].

Eine weitere wichtige Effektorfunktion von NK-Zellen ist die antikörperabhängige zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC). Opsonierte Pathogene können von NK-Zellen erkannt und getötet werden. Dabei übernimmt der niederaffine Fcg-Rezeptor III (CD16) eine Schlüsselrolle. Nach dem Binden des Fc-Teils von IgG1 und IgG3 Antikörpern an CD16 initiiert die NK-Zelle einem gezielten cytotoxischen Angriff auf die antikörperbehaftete Zielzelle, indem die cytoplasmatischen Granula mit Perforinen und Granzymen gezielt freigesetzt werden [Lanier et al., 1988].

Von CD16 existieren zwei Isoformen: CD16A kommt in einer Polypeptid-verankerten Form auf humanen NK-Zellen und Makrophagen vor; Neutrophile tragen CD16B auf einem Glycosylphosphatidylinositolanker. CD16A muss zur Expression auf der Zelloberfläche mit der z-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes oder mit der g-Untereinheit des FceRI assoziieren. Morphologisch unterscheidet CD16B die Allele NA1 und NA2 [Nagarajan et al., 1995]. Die Aktivierung durch das Binden des Fc-Teils oder eines anti-CD16-Antikörpers führt bei NK-Zellen zu starker Cytotoxizität und Proliferation, aber auch zur Apoptoseinduktion nach der Aktivierung. Vermutlich ist dieser Mechanismus für die negative Regulation von inflammatorischen NK-Zell-Antworten verantwortlich [Warren et al., 1999].

1.5. Struktur und Funktion von Immunglobulinen und bispezifischen Antikörper-Fragmenten (Diabodies/Tandemdiabodies)

Antikörper sind für die Vermittlung der humoralen Immunität verantwortlich. Bindet ein Antigen an den B-Zellrezeptor und erhält der B-Lymphocyt von einer T-Zelle ein costimulatorisches Signal, erfolgt die klonale Expansion und Differenzierung zu einer Plasmazelle. Diese Zellen bilden große Mengen von löslichem Immunglobulin (Ig) einer definierten Spezifität.

Ig sind große Moleküle mit einem Molekulargewicht von etwa 150 kDa mit der Fähigkeit, ein Antigen spezifisch zu binden. Ein Antigen:Antikörperkomplex ist in der Lage, Effektorfunktionen zu initiieren. Die Fc-Domäne leitet die Komplement-vermittelte und die Zell-vermittelte antikörperabhängige Cytotoxizität ein [Frank et al., 1991; Lanier et al, 1988].

Köhler und Milstein gelang 1975 erstmals die Herstellung monoklonaler Antikörper (mAk) mit Hilfe der Myelomzell-Fusionstechnik. Diese Technik eröffnete neue Möglichkeiten in der Immundiagnostik. Zur in vivo -Diagnostik und Therapie verschiedener Krankheiten haben sich murine Antikörper aufgrund unzureichender Aktivierung der Effektorfunktionen und dem Auftreten von Anti-Maus-Antikörper (HAMA = human anti-mouse antibodies) als überwiegend ungeeignet erwiesen. HAMA sind zu 90 % gegen Epitope der konstanten Domänen gerichtet [Brüggemann et al., 1989]. Bei wiederholter Verabreichung des murinen Antikörpers können Immunreaktionen entstehen, die von Fieber und Schüttelfrost bis hin zum anaphylaktischen Schock variieren [Dyer et al., 1989; Hartmann et al., 2001].

Die Technologie der rekombinanten Antikörper basiert auf der Manipulation von bereits bestehenden Hybridomen, Antikörpern und Antikörpersequenzen mittels zellbiologischen, chemischen und gentechnologischen Methoden [Kipriyanov et al., 1999 a; Little et al., 2000; Segal et al., 2001] und erweitert das Potenzial und die Anwendungsgebiete der Antikörper.

Bispezifische Antikörper (bsAk) besitzen Domänen von Immunglobulinen und haben zwei unterschiedliche Bindungsspezifitäten. Diese Moleküle sollen Effektorzellen des Immunsystems an pathologische Zellen wie etwa Tumor- oder virusinfizierte Zellen dirigieren, indem je eine Spezifität des Antikörpers an den entsprechenden Zellmarker bindet. Wird die Spezifität gegen die Effektorzelle so gewählt, dass ein aktivierender Rezeptor gebunden wird, kann durch die Induktion der Zell-vermittelten Cytotoxizität die Zielzelle abgetötet werden [Segal et al., 2001].

Eine Form von bsAk sind bispezifische Diabodies (bsDb). Sie besitzen eine Molekülmasse von etwa 55-60 kDa und bestehen aus den variablen Domänen (VL und VH) je einer Spezifität. Die Domänen sind kovalent über kurze Peptide-Fragmente verbunden, die Nachfolgend als Linker bezeichnet werden. Die über einen Linker verbundenen Domänen aus VH und VL bilden ein scFv (single chain Fv). Der Aufbau dieser Antikörper-Fragmente ist in Abb 1.2. und 1.3. dargestellt. Ein bsDb ist bivalent; kristallographische Analysen haben gezeigt, dass die Bindungsstellen sich jeweils auf der gegenüberliegenden Seite des Moleküls befinden [Perisic et al., 1994].

Diese bsDb lassen sich im Vergleich zu anderen bsAk schnell, kostengünstig und in hoher Reinheit und Ausbeute in Bakterien herstellen [Kipriyanov, Little, 1999a]. Aufgrund des Fehlens von konstanten Regionen und der geringen Größe sind bsDb weniger immunogen und können besser Tumorgewebe infiltrieren als komplette Ig. Jedoch ergibt sich bei der Expression durch Cosekretion beider Antikörper-Fragmente die Möglichkeit der Bildung von inaktiven Homodimeren. Ein weiteres Problem ist die nicht-kovalente Bindung der beiden Antikörper-Fragmente, die in Lösung dissoziieren können und so die Fähigkeit zur Bindung der Antigene verlieren. Pro Antigen steht dem bsDb nur eine Valenz zur Verfügung und in vivo beträgt die Halbwertszeit aufgrund der geringen Größe und der daraus resultierenden schnellen Ausscheidung über die Niere nur wenige Stunden. Eine effektive therapeutische Anwendung würde demnach hohe Dosierungen erforderlich machen [Kipriyanov, 2002]. Mit einem CD16/CD30-bsDb (Spezifität HRS3/A9) konnte gezeigt werden, dass in einem in vivo -Modell eine Quervernetzung von NK-Zellen mit H-RS-Zellen zu einer spezifischen Lyse der Tumorzellen führt [Arndt et al., 1999]. Ein rekombinanter bispezifischer mAk mit den gleichen Spezifitäten hat bereits in einer klinischen Studie Phase I/II therapeutische Erfolge erzielt [Hartmann et al., 2001].

Ein weiteres Format ist der bispezifische Tandemdiabody (TandDb); dieser beinhaltet keine der oben genannten Nachteile von bsDb.

Die bispezifischen TandDb sind tetravalent, besitzen somit eine verbesserte Bindungskapazität durch höhere Avidität und eine höhere Stabilität als bsDb. TandDb sind Homodimere aus zwei über einen weiteren Linker verknüpften scFv. Die Molekülmasse beträgt etwa 115 kDa. Abb. 1.4. und 1.5. zeigt die Domänen eines TandDb. Die Peptid- Linker sind kritische Komponenten bei der Faltung der Monomere in dieses Format. Die Konstruktion eines TandDb anti-CD19/CD3 hat bereits signifikant bessere Ergebnisse bei in vitro -Tests als Therapieansatz für NHL geliefert als der entsprechende Diabody [Kipriyanov et al., 1999 b].

Die Abb 1.6. veranschaulicht die Organisation der Anordnung der Immunglobulin-Sequenzen der angegebenen Anti-körper-Fragmente in einem bakteriellen Expressionsvektor (s. auch Abschnitt 4.10.) und die daraus exprimierten aktiven und verschiedenen Formen der rekombinanten Antikörper-Fragmente.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb 1.6. Das bicystronische Konstrukt wie in a) gezeigt führt zur Expression von dimeren, nicht-kovalent assoziierten bsDb aus den hybriden scFv VH1/VL2 und VH2/VL1, sofern ein geeigneter Peptid- Linker verwendet wird und beide scFvs in gleicher Quantität gebildet werden. Kurze Linker (~ 6-10 As) forcieren die Bildung von Dimeren, anstelle von monomeren hybriden scFv.

b) Aus einem Produkt, bei dem zwei bsDb-Sequenzen in Tandemanordnung aufgereiht werden, entsteht durch Dimerisierung in antiparalleler Orientierung ein bispezifischer und tetravalenter TandDb. Bei intramolekularer Faltung entsteht ein bispezifischer und bivalenter scDb (single chain Db). Die Präferenz zur Bildung von Mono- bzw. Dimeren werden durch die Aminosäure- Linker und die individuellen VH/VL-Domänen der Antikörper determiniert. Der verwendete zentrale Linker im Konstrukt für einen TandDb besitzt eine andere Peptidsequenz als die Linker innerhalb der scFv.

Die Antigene sind in rot dargestellt und zeigen den Bereich der Bindung an den Antikörper; lac P/O: Wildtyp lac Promoter/Operator; rbs: Ribosomen-Bindestelle (Shine-Dalgarno Sequenz); pelB: Signalpeptid.

Die therapeutische Wirkung von rekombinanten bsDb gegen HL wurde bisher am Tiermodell bewiesen [Arndt et al., 1999], aufgrund der Instabilität und den unzureichenden Bindungseigenschaften der bsDb konnte jedoch nur eine temporäre Remission mit anschließend progressiven Tumorwachstum erreicht werden. Für eine effektive Antikörpertherapie ist es daher notwendig, das therapeutische Potenzial der rekombinanten Antikörper-Fragmente durch höhere Stabilität und optimierte Bindungseigenschaften zu verbessern. Das Ziel ist es, verbesserte Antikörper-Formate aus dem bestehenden Diabody-Format zu konstruieren, um bei therapeutischer Anwendung eine vollständige Zerstörung aller malignen Zellen zu erreichen. Basierend auf rekombinanten Antikörpern würde eine Therapie die Lebensqualität des Patienten aufgrund der drastisch reduzierten Nebenwirkungen im Vergleich zur aggressiven Chemotherapie und Bestrahlung deutlich verbessern. Auch hinsichtlich der Langzeitnebenwirkungen sollte eine Antikörper-Therapie vorteilhafter sein. Antikörper besitzen eine relativ kurze biologische Halbwertszeit und stellen hochspezifische Agenzien dar, während Cytostatika systemisch wirkende Toxine mit cancerogenen und teilweise neurodegenerativen Eigenschaften sind.

2. Aufgabenstellung

Ein CD30+-Hodgkin-Lymphom ist eine maligne Erkrankung, für die eine Antikörpertherapie sehr vielversprechend ist. Ziel der Arbeit war es, für einen solchen Therapieansatz aus den DNA-Sequenzen herkömmlicher rekombinanter bispezifischer Antikörper-Fragmente ein im Bezug auf Wirksamkeit und Stabilität optimiertes Format herzustellen und zu charakterisieren. Zur Optimierung der Expression sollten zwei bispezifische Diabodies anti-CD16/CD30 bakteriell exprimiert und aufgereinigt werden. Die verbesserten Expressionseigenschaften einer Variante des bsDb gegen CD30 (mCD30) sollte durch den Vergleich mit dem Wildtyp bsDb bestätigt werden. Aus den scFv gegen CD30 und CD16 sollten anschließend zwei bispezifische und tetravalente Tandemdiabodies mit unterschiedlichen Aminosäure- Linkern generiert werden. Die Konstrukte der TandDb sollten ebenfalls exprimiert und aufgereinigt werden. Die Antikörper-Fragmente mit der Spezifität anti-CD30/CD16 dirigiert NK-Zellen an H-RS-Zellen, initiieren die ADCC der NK-Zellen und führt zu einer spezifischen Lyse der H-RS-Zellen. Ein weiteres Ziel war es, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Antikörper-Fragmente zu charakterisieren und im Rahmen eines in vitro -Cytotoxizitätstests gegen eine etablierte Hodgkin Zelllinie die therapeutischen Wirksamkeit zu überprüfen. Auf diese Weise sollten neuartige Formen rekombinanter Antikörper-Fragmente generiert und getestet werden, um die Grundlage für eine effektive Antikörper-basierte Therapie für die Hodgkinsche Krankheit zu etablieren.

3. Zusammenfassung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zur Optimierung eines Expressionssystems zwei rekombinante anti-CD30/CD16-bsDb in einer bakteriellen Großkultur exprimiert und aufgereinigt. Die höhere Ausbeute nach einer Expression der zuvor in der Arbeitsgruppe von Prof. Little generierten Variante der Spezifität anti-CD30 konnte bestätigt werden. Die Variante der anti-CD30-Fv-Domäne hat sich unter Erhalt der Spezifität als stabiler erwiesen und ließ sich unter gleichen Bedingungen mit 38 % höherer Ausbeute aufreinigen als der Wildtyp. Anschließend wurden erstmals aus den anti-mCD30/CD16-scFv-Sequenzen zwei Konstrukte für die Expression von bispezifischen TandDb kloniert. Das Konstrukt für den anti-mCD30/CD16-TandDb scFv10-SL-scFv10 wurde ebenfalls in einer Großkultur exprimiert und aufgereinigt. Die Charakterisierung dieses Antikörpers hat gezeigt, dass bei dieser Linker -Kombination der Antikörper sich intramolekular zu einem scDb faltet und nur in geringem Umfang TandDb bildet. Der scDb zeigt beim Vergleich mit dem bsDb ein sehr ähnliches Bindungsverhalten auf CD16+-CD30--Zellen und auf CD16--CD30+-Zellen. Mit beiden Antikörpern wurde in in vitro -Stabilitätstest durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der scDb aufgrund des zusätzlichen Peptid- Linkers eine mehr als 6-fach erhöhte Halbwertszeit unter in vivo- ähnlichen Bedingungen hat und somit deutlich stabiler ist als der herkömmliche bsDb. In einem Cytotoxizitätstest mit heterologen Effektorzellen und CD30+-Zellen führte der anti-mCD30/CD16-scDb zu einer 100 % höheren spezifischen Lyse im Vergleich zum anti-mCD30/CD16-bsDb. Mit der höheren Stabilität und der besseren Effektorfunktion besitzt der scDb ein verbessertes immuntherapeutisches Potenzial zur Behandlung der Hodgkinschen Krankheit.

4. Material

4.1. Laborbedarf

Blutabnahme-Set diverse Firmen

CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega

Dialysemembran (Spectra/Por) Roth

Durchflusscytometrie-Röhrchen Sarstedt

Elektroporationsküvette BioRad

Gelfiltration-Kalibrierungs-Set (LMW/HMW) Amersham Biosciences

Halbmikroküvetten Eppendorf

Microtiterplatte (96 wells) Greiner

Nitrocellulosemembran BA-S Schleicher & Schuell

Pipettenspitzen, PCR-Tubes Steinbrenner

PD10 Säulen (Sephadex) Amersham Pharmacia

Biotech

Petrischalen Greiner

Serologische Pipetten (2, 5, 10, 25 ml) Sarstedt

Protein Assay (nach Bradford) BioRad

Qiagen QIAprep Spin Midiprep. Qiagen

Qiagen QIAprep Spin Miniprep. Qiagen

Qiagen QIAquick Gel Extraction Qiagen

Qiagen QIAquick PCR-Purification Qiagen

Reagenzgefäße (15 ml, 50 ml) Falcon

Reaktionsgefäße 1,5 ml Sarstedt

Sterilfilter Millipore

Konzentriereinheit Ultrafree-15 PBGC

(AMICON, NMWL 10.000) Millipore

Wägeschalen NeoLab

Zellkulturröhrchen (15 ml) Greiner

4.2. Geräte

Autoklav Varioklav Heidolph

Brutschrank Multitron Infors

Durchflusscytometer Epics XL-4-Color Beckman Coulter

Elektrophoresekammer Mini-Protean BioRad

Elektroporationsgerät Gene Pulser II Eppendorf

FPLC-Anlage LCC-501 Plus Pharmacia Biotech

Geldokumentations- Alpha ImagerTM 1220 Alpha Innotech

system Corporation

Gelsystem Miniprotean BioRad

IMAC-Säule Pharmacia

Magnetrührer MR 3001 Heidolph

Microplatereader Model 550 BioRad

PCR-Gerät PTC-200 MJ Research

pH-Meter pH Level 2 inoLab

Photometer BioPhotometer Eppendorf

Reinstwasseranlage EASYpure LF Barnstead

Schüttler Duomax 1030 Heidolph

Thermomixer Thermomixer compact Eppendorf

Trockenblotapparatur Biometra Fast-Blot B33 Biometra

Sicherheitswerkbank HERAsafe (Klasse2, Typ H) Heraeus

Spannungsquellen Electrophoresis Powersupply BioRad

Ultra-Turrax T 25 basic IKA-Werke

Vortexer REAX top Heidolph

Waagen BL 1500S Sartorius

Zentrifugen Kühlzentrifuge

RC 5C Plus Sorvall

(Rotoren SLA 300, SS34)

Picofuge fresco Hereaus

Megafuge 1.0 R Heraeus

4.3. Chemikalien

Die angegebenen Chemikalien wurden in der Qualität p.A. verwendet.

Agar Gibco

Agarose Serva

Agarosegelelektrophorese Probenpuffer Life Technologies

Ammoniumperoxodisulfat (APS) Roth

Ampicillin (Na-Salz) Serva

Ammoniumsulfat Roth

Betain Sigma

BioRad Protein Assay 0500-0006 BioRad

beta-Mercaptoethanol Roth

Brilliant Blue R Sigma

Bromphenol Blau Roth

Cobaltchlorid (×2 H2O) Roth

Diaminobenzidin (DAB) Sigma

Ethanol (vergällt/absolut) Sigma

Ethidiumbromid Merck

D(+)-Glukose (× H2O) AppliChem

FCS (fötales Kälberserum) Invitrogen

Glycerin Roth

Histopaque 1077 Sigma

Histopaque 1119 Sigma

Imidazol Serva

Isopropanol Sigma

Isopropyl b-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Sigma

Kaliumchlorid 3 M Lsg. Roth

Kupfer-(II)-sulfat Roth

Methanol Sigma

Magermilchpulver Merck

Magnesiumchlorid (× 4H2O) Sigma

Natriumacetat (×3 H2O) Roth

Natriumchlorid Roth

Natronlauge 1 M Sigma

PBS Invitrogen

Ponceau S Sigma

Propidiumiodid Sigma

Roti – load, (4x konz., reduzierend) Roth

Rotiphorese Gel (AA, BisAA) Roth

RPMI-Medium Gibco

D-Saccharose (Sucrose) Roth

Salzsäure 37 %, rauchend Sigma

SDS/Dodecylsulfat-Na als 10 % Lsg. Merck

D-Sorbitol Roth

Stickstoff, liquid Messer

TEMED (N, N, N, N-Tetramethylethylendiamin) Roth

TRIS-Base Roth

Trypan Blue Lösung Sigma

Tryptone Peptone Difco

Tween20 Serva

Wasserstoffperoxid 30 % Lsg. Roth

Yeast Extract Difco

4.4. Puffer, Medien und andere Lösungen

Die Medien wurden für 20 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Puffer und Lösungen für die molekularbiologischen Arbeiten wurden sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert. Die Medien wurden nach dem Autoklavieren bei RT aufbewahrt. Alle Puffer, Medien und Lösungen wurden mit bidestilliertem Wasser hergestellt.

2 YT Medium 80 g Baktotrypton;

50 g Hefeextrakt;

25 g NaCl; pH 7,5 (eingestellt mit NaOH)

ad 5000 ml

2YT-GA Medium 2YT Medium

100 mg/ml Ampicillin

100 mM Glukose

Ampicillin-Lsg. 100 mg/ml Ampicillin-Na-Salz in 50% Ethanol (unfiltriert,

Lagerung bei –20° C)

Acrylamid-Lsg. 30 % Acrylamid;

0,8 % Bisacrylamid; 4 °C

APS 10 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat in H2O

Dialysepuffer 50 mM Tris-HCl pH 7 ;

1 M NaCl ; unfiltriert

Elektrophoresepuffer 25mM Tris;

192mM Glycin;

0,1% (w/v) SDS; unfiltriert

Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl ; 1 M NaCl ;

300 mM Imidazol ; pH 7 (eingestellt mit HCl)

Entfärbelsg. 10 % Eisessig, 45 % Ethanol; unfiltriert

FACS-Puffer PBS (Invitrogen); 2 % FCS; 0,1 % (w/v) NaN3

Glukose-Lsg. 396 g a-D-Glukose-Monohydrat; ad 1000 ml H2O

Imidazol 5 M 68,1 g Imidazol; ad 200 ml

LB-Medium 10 g Baktotrypton;

5 g Hefeextrakt;

10 g NaCl; ad 1000 ml

Größenstandard 1 kb-DNA-Ladder (Life Technologies);

(Agarose- 10 mM Tris-HCl; 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA;

gelelektrophorese) pH 7.5; 5x BlueJuiceTM Gel Loading Buffer (Life

Technologies); (Banden (bp): 298, 344, 396, 506, 517, 1018, 1636, 2036, 3054, 4072, 5090, 6108, 7126, 8144, 9162, 10180, 11198, 12216)

Größenstandard gefärbter Protein Größenstandard

(SDS-PAGE) (New England BioLabs);

70 mM Tris-HCl; 33 mM NaCl;

1 mM Na2EDTA; 2 % (w/v) SDS; 1 mM

NaN3; 40 mM DTT; 0,01% (w/v) Phenolrot;

10 % Glycerin; pH 6.8;

(Banden (kDa): 7, 17, 25, 33, 48, 62, 83, 175)

SDS-7 (Sigma);

62,5 mM Tris-HCl; pH 6,75 ; 2 % SDS ;

5 % ß-Mercaptoethanol (v/v) ;

10 % Glycerin (v/v); 0,001% Bromphenolblau (v/v)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Milchpulverlösung 3 % (w/v) Milchpulver in 1x TBS

PBS 50 mM Na2HPO4; 140 mM NaCl;

pH 7 (eingestellt mit HCl)

PBSI PBS mit 50 mM Imidazol; pH 7 (eingestellt mit HCl)

PI-FACS-Puffer FACS-Puffer mit 2 mg/ml Propidiumiodid

Puffer A (IEX) 50 mM Imidazol; 50 mM NaCl; pH 6.4-7

Puffer B (IEX) 50 mM Imidazol; 1 M NaCl; pH 6.4-7

RPMI-Komplettmedium RPMI – 1640; 2 mM L-Glutamin, 100 U Penicillin;

Streptomycin 100 mg/ml, 10-20 % FCS (Hitze-inaktiviert)

SDS-Probenpuffer (2x) 125 mMTris-HCl (pH 6.8);

10 % Glycerin; 4 % SDS;

10 % b-Mercaptoethanol

Trockenblot-Puffer 25 mM Tris; 150 mM Glycin;

10 % (v/v) Methanol; unfiltriert

SOC Medium 100 ml SOB Medium; 1 ml Glukose-Lsg.

SOB Medium 20 g Baktotrypton; pH 7 (eingestellt mit NaOH);

5 g Hefeextrakt; 590 mg NaCl; 190 mg KCl;

ad 990 ml H2O;

Nach dem Autoklavieren:

10 ml 1 M MgCl2-Lsg.

TAE-Puffer 40mM Tris/Essigsäure pH 7.8;

10mM NaOAc; 1mM Na-EDTA

TBS-Puffer 25 mM Tris ; 140 mM NaCl

TE-Puffer 10mM Tris-HCl pH 8.0;

1mM Na-EDTA

TES-Puffer 50 mM oder 200 mM Tris-HCl pH 8 ;

20 % D-(+)-Saccharose (w/v); 1 mM EDTA

TNT(TBST)-Puffer 0,05 % (v/v) Tween 20 in TBS-Puffer

Trypsin/EDTA-Lsg. 0,05 % Trypsin; 0,02 % EDTA; (Fa. Invitrogen) steril

Waschpuffer 50 mM Tris-HCl ; 1 M NaCl;

(IMAC) 50 mM Imidazol ; pH 7 (eingestellt mit HCl)

YTBS 80 g Baktotrypton;

50 g Hefeextrakt;

25 g NaCl;

911 g D-Sorbitol (1 M)

1,69 g Betain (2,5 mM);

pH 7.5 (eingestellt mit NaOH); ad 5000 ml

4.5. Enzyme

Die verwendeten Restriktionsnukleasen und die entsprechenden Puffer stammen von New England BioLabs. Die T4 DNA Ligase, das Expand High Fidelity PCR System und CIP (calf intestine phosphatase) wurden von Roche bezogen. Alle Enzyme wurden gemäß den Angaben des Herstellers verwendet.

4.6. Antikörper

anti-cmyc-Antikörper (9E10, mIgG) Muriner monoklonaler Antikörper gegen das Epitop EQKLISEENL von Calbiochem Novabiochem International (Evan et al., 1985).

anti-Maus-Antikörper/HRP Polyklonaler Ziege-anti-Maus Antikörper konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) (Dianova, Hamburg).

anti-(His)6-Antikörper (DIA900, mIgG1) Monoklonaler Antikörper gegen das hexa-His-Epitop zur Verwendung bei der Durchflusscytometrie-Analyse (Dianova, Hamburg).

anti-(His)5-Antikörper/HRP (mIgG) Monoklonaler Antikörper gegen das penta-His-Epitop zum direkten Nachweis von His-getagten Proteinen im Westernblot (Dianova, Hamburg).

anti-CD30-Antikörper (HRS-3, mIgG) Monoklonaler IgG1k-Antikörper gegen das humane CD30-Antigen (Engert et al., 1990), der freundlicherweise von Dr. Gerhard Moldenhauer vom DKFZ/Heidelberg zur Verfügung gestellt wurde; anti-CD30-scFv stammt aus der Myelomhybridzelllinie HRS-3 [Hombach et al., 1998].

anti-CD19-Antikörper (HD37, mIgG) Monoklonaler Antikörper gegen das humane CD19-Antigen, der freundlicherweise von Dr. G. Moldenhauer vom DKFZ/Heidelberg zur Verfügung gestellt wurde.

anti-CD3-Antikörper (OKT3, mIgG) Monoklonaler Antikörper gegen das humane CD3-Antigen, der freundlicherweise von Dr. G. Moldenhauer vom DKFZ/Heidelberg zur Verfügung gestellt wurde.

anti-CD16-Antikörper (A9, mIgG) Monoklonaler IgG1l-Antikörper gegen das humane CD16B-Antigen [Hombach et al., 1993]. Dieser Antikörper wurde freundlicherweise von Dr. G. Moldenhauer vom DKFZ/Heidelberg zur Verfügung gestellt. Das verwendete anti-CD16-scFv stammt ebenfalls aus der Myelomhybridzelllinie A9.

anti-Maus-Antikörper/FITC FITC-gekoppelter polyklonaler Ziege-anti-Maus-Antikörper gegen die schweren und leichten Ketten von mIgG (Dianova, Hamburg).

4.7. Bakterienstämme

Bakterienstamm Genotyp

E.Coli K12 RV308 (D lac c74 gal ISII: :OP308 strA)

E.Coli XL1-Blue (recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-, mk+) supE44,

relA1, [F´proAB, lacIqZDM15, TN10])

4.8. Zelllinien

4.8.1. L-428

Diese Zellen stammen von einer 37 Jahre alten Frau mit der HK (NS, Stadium IVB) aus dem Jahr 1978. L-428 bildet eine Einzelzellsuspension mit 1-5 % mehrkernigen Riesenzellen (Kultivierung in 10 % FCS). Merkmale: CD15+, CD21+, CD30+, HLA-DR+; EBV-; HTLV-I/II-. DSMZ ACC 197. Diese Zelllinie wurde freundlicher Weise von Dr. Moldenhauer vom DKFZ Verfügung gestellt.

4.8.2. HEK293

HEK293 wurde aus einer humanen Nierenepithelzelle eines Fötus etabliert. Die Zellen sind mit Adenovirus Typ 5 transformiert (ATCC Nr. CRL-1573, DSMZ ACC305). Diese Linie wurde zusätzlich stabil mit CD16B-NA1 transfiziert, die Zellen sind konstitutiv CD16B+. Kultivierung in 10 % FCS. Diese Zelllinie wurde freundlicher Weise von Dr. Schmidt von der medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.

4.8.3. Jurkat, Klon E6-1

Diese Zelllinie (ATCC Nr. TIB-152) stammt von einem Subklon der Jurkat Zelllinie ab. Jurkat wurde aus dem peripheren Blut eines 14-jährigen Jungen mit akuter T-Zell Leukämie isoliert (Kultivierung in 10 % FCS). Weitere Merkmale: CD3+, CD5+, CD28+, CD30+. Diese Zelllinie wurde freundlicher Weise von Dr. Moldenhauer vom DKFZ zur Verfügung gestellt.

4.8.4. L-540CY

Die humane Zelllinie L540 wurde aus dem Knochenmark einer 20-jährigen Frau mit der HK (NS, Stadium IVB) kultiviert. Die Zelllinie L540CY ist eine Mutante der Linie L540 und wurde ursprünglich durch Rekultivierung nach Injektion der L540-Linie in Nackt-Mäuse gewonnen [von Kalle et al., 1992] (Kultivierung in 20 % FCS).

Merkmale: CD2+, CD3-, CD13-, CD14-, CD15+, CD19-, CD21-, CD25+, CD30+, CD34-. DSMZ ACC 72. Diese Zelllinie wurde freundlicher Weise von Dr. Moldenhauer vom DKFZ zur Verfügung gestellt.

4.9. Oligonukleotide

Die synthetischen Oligonukleotide wurden zur PCR-Amplifikation von DNA der schweren und leichten Ketten der scFv-Fragmente verwendet. Die Oligonukleotide wurden von der Firma MWG bezogen.

· DP1p (5´-Primer, Sequenzier- und Amplifikationsprimer, bindet in Position 5´ vor pelB in pHOG21, 27 Nukleotide):

5´-GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACC-3´

· OKT­_5 (3´-Primer, Deletion der Hind III-Schnittstelle, generiert einen Linker mit sechs As-Resten in VH-Genen unter Erhalt der Eco RV-Schnittstelle, 34 Nukleotide)

5´-TATTAAGATATCGGGTGTTGTTTTGGCTGAGGAG-3´

Eco RV

· Bi3h (5´-Primer für VH, 35 Nukleotide)

5´-CCGGCCATGGCGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGG-3´

Nco I Pvu II

· Bi3sk (5´-Primer, zerstört die Pvu II-Schnittstelle in VH-Genen, 33 Nukleotide)

5´-CAGCCGGCCATGGCGCAGGTGCAACTGCAGCAG-3´

Nco I Pst I

· 3-Link6 (3´-Primer, generiert einen Linker mit sechs As-Resten in VH-Genen unter Erhalt der Eco RV-Schnittstelle, 28 Nukleotide)

5´-GATATCGGGTGTTGTTTTGGCTGAGGAG-3´

Eco RV

· 5-Link6 (5´-Primer, generiert einen Linker mit sechs As-Resten in VL-Genen unter Erhalt der Eco RV-Schnittstelle, 28 Nukleotide)

5´-CTCCTCAGCCAAAACAACACCCGATATC-3´

Eco RV

· pSEXBn (3´-Primer, Sequenzier- und Amplifikationsprimer in pHOG21, 34 Nukeotide)

5´-GGTCGACGTTAACCGACAAACAACAGATAAAACG-3´

4.10. Vektoren

Für die bakterielle Expression rekombinanter Antikörperfragmente wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Little verschiedene Vektoren entwickelt. Für die Expression von scFv-Fragmenten und zur Klonierung wurde pHOG21 verwendet (Abb. 4.1.). Bispezifische Diabodies wurden mit dem bicystronischen Vektor pSKID exprimiert (Abb. 4.2.). Der Vektor pDISC diente zur Klonierung von Fragmenten des TandDb (Abb. 5.3.). Zur Expression der TandDb diente der Vektor pSKK3 (Abb. 4.3.) [Kipriyanov et al., 1998, 2002].

5. Methoden

5.1. Molekularbiologische Methoden

5.1.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zur Amplifikation der Immunglobulinsequenzen und zur Generierung von Mutationen in den DNA-Sequenzen wurden 10-100 ng Matrizen-DNA, 25 pmol jedes Primers, 5 ml 10x-PCR-Puffer, 300 mM dNTPs und 0,5 ml des thermostabilen High Enzyme Fidelity in ein Gesamtvolumen von 50 ml gegeben. Die PCR wurde im Thermoheizblock über 30 Cyklen mit einem der folgenden Programmen durchgeführt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab 5.1. Die verwendeten Programme des PCR-Geräts für die durchgeführten PCRs. Die Schritte 2.-4. wurden mit der angegebenen Zeit und Temperatur insgesamt in 30 mal durchlaufen. Die Schritte 1. und 5. jeweils einmal.

Nach der PCR wurde der Reaktionsansatz mit 5x-Probenpuffer versetzt und auf einem Agarosegel gereinigt, um Matrize, Primer, DNA-Polymerase und evtl. unspezifische Banden zu entfernen. Die DNA in dem DNA-haltigen Banden wurde aus dem Gel herausgeschnittenen und mit dem Gelextraktions-System der Firma Qiagen aufgereinigt.

5.1.2. Splice overlap extension - (SOE-) PCR

Mit der SOE-PCR ist es möglich, DNA-Sequenzen zu Fusionieren und zu Amplifizieren, die an einem Terminus eine überlappende Oligonukleotidsequenz besitzen. Zur Mutagenese des scFv6(16-m30)-Fragments wurde eine SOE-PCR durchgeführt, da zwei Eco RV-Schnittstellen im VH16-Gen einen Spaltung mit diesem Restriktionsenzym nicht zuließen. Die Gene VH16 und VLm30 wurden separat mit PCR amplifiziert. Durch die Wahl der Primer besaßen das VH16-DNA-Fragment am 3´- und das VLm30-DNA-Fragment am 5´-Terminus eine überlappende Sequenz von 20 Nukleotiden. Mit etwa 75 ng DNA von jedem Fragment wurde zur Assemblierung der Matrize eine PCR durchgeführt, bei dem zum Reaktionsansatz keine Primer gegeben wurden. Es wurden 5 Cyklen SKIP1 durchgeführt. Anschließend wurden die Primer und nochmals 0,5 ml Polymerase zugegeben. Nach der Assemblierung wurden weitere 30 Cyklen SKIP1 gestartet. Das PCR-Produkt wurde aufgereinigt und für den nächsten Klonierungsschritt verwendet.

5.1.3. Restriktionsspaltung von DNA

Restriktionsendonukleasen können an spezifischen, meist palindromen Sequenzen doppelsträngige DNA schneiden. Als Berechnungsgrundlage zur Ermittlung der Restriktionsenzymkonzentration gilt, dass 1 U eines Restriktionsenzyms 1 mg Lamba-DNA mit einer Restriktionsschnittstelle bei 37 °C vollständig schneidet. Die Restriktionsspaltungen wurden in einem für das Enzym geeigneten Puffer durchgeführt. Die Herstellung des Probenansatzes erfolgte nach Angaben des Herstellers. Analytische Spaltungen wurden in einem Volumen von 10-20 ml über 3 h durchgeführt. Präparativer Verdau erfolgte in einem Reaktionsvolumen von 5 ml/mg DNA für mindestens 5 h oder üN.

5.1.4. Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten

Zur Analyse und Präparation von Plasmiden und DNA-Fragmenten wurden 0,8-1,5 %ige TAE-Agarosegele hergestellt. Der Anteil der Agarose im Gel wurde in Abhängigkeit von der Größe der DNA-Stränge gewählt. Nach dem Aufkochen der Agarose in 1x TAE-Puffer wurde 0,5 mg/ml Ethidiumbromid zugegeben und in die Platte der Gelapparatur gegossen. Die in Probenpuffer aufgenommene DNA wurde auf die Taschen geladen und die Elektrophorese in 1x TAE-Puffer bei 1-6 V/cm durchgeführt. Als Referenz diente der DNA-Größenstandard 1kb-DNA-Ladder.

Nach der Elektrophorese konnte die DNA auf einer UV-Durchlichtplatte sichtbar gemacht werden. Mit dem Alpha ImagerTM 1220-System konnte das entstehende Bild anschließend dokumentiert werden.

[...]