Optimierung der Produktion und Aufarbeitung von Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase aus Bäckerhefe

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Zielsetzung

3 Theoretische Grundlagen
3.1 Die Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase
3.1.1 Eigenschaften der Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase
3.1.2 Die beiden Coenzyme Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP+) und Adenosintriphosphat (ATP) sowie Mg2+-Ionen als Cofaktoren
3.1.3 Die Methode der Glucosebestimmung mit Hilfe von Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase
3.2 Charakterisierung des Mikroorganismus Bäckerhefe
3.2.1 Allgemeine Betrachtung und Physiologie von Hefen sowie taxonomische Einordnung von S. cerevisiae
3.2.2 Stoffwechsel von S. cerevisiae
3.3 Allgemeiner Ablauf des Praktikums zur Herstellung der Enzyme G6P-DH und HK
3.4 Theoretische Grundlagen der Satz-, Zulauf- und kontinuierlichen Kultivierung
3.4.1 Allgemeine Betrachtungen zur Satz-, Zulauf- und kontinuierlichen Kultivierung
3.4.2 Gleichungen zur Berechnung der Prozesskenngrößen der Satz-Kultivierungen und der kontinuierlichen Zellkulturen
3.5 Praxis der Kultivierung und Aufarbeitung von S. cerevisiae in der Industrie und Vergleich mit der Kultivierung im Studentenpraktikum
3.6 Theoretische Grundlagen der Membranmikrofiltration
3.6.1 Allgemeine Charakterisierung der Membranmikrofiltration
3.6.2 Einsatz und Eigenschaften der Membranmikrofiltration
3.7 Theoretische Grundlagen des Zellaufschlusses mit einer Kugelmühle
3.7.1 Allgemeine Charakterisierung und Einsatz der Kugelmühle
3.7.2 Wichtige Parameter bei der Kugelmühle
3.8 Theoretische Grundlagen der Zentrifugation
3.8.1 Allgemeine Charakterisierung und Einsatz der Zentrifugation
3.8.2 Einflussparameter bei der Zentrifugation
3.9 Theoretische Grundlagen der Ionenaustauschchromatographie
3.9.1 Allgemeine Charakterisierung der Ionenaustauschchromatographie
3.9.2 Einsatz der Ionenaustauschchromatographie

4 Material und Methoden
4.1 Mikroorganismus, Chemikalien und Nährmedium
4.2 Materialien und Methode bei der Vorkultivierung und Kultivierung von S. cerevisiae
4.3 Materialien und Methode bei der Überdruckfiltration
4.4 Materialien und Methode beim Zellaufschluss mit der Kugelmühle
4.5 Materialien und Methode bei der Zentrifugation
4.6 Materialien und Methode bei der Anionenaustauschchromatographie
4.7 Bestimmung des Trockenbiomasseanteils der eingesetzten Presshefe
4.8 Bestimmung der Trockenbiomassekonzentration der kultivierten Hefe
4.9 Bestimmung der Glucosekonzentration in der Kulturbrühe
4.10 Bestimmung der Ethanolkonzentration in der Kulturbrühe
4.11 Enzymtests zur Bestimmung der G6P-DH- und HK-Aktivität
4.12 Bestimmung der volumenbezogenen Enzymaktivität von G6P-DH während der Kultivierung
4.13 Bestimmung der Proteinkonzentrationen des Rohextraktes und eluierter Fraktionen mit Bradford-Reagenz

5 Ergebnisse des Herstellungsprozesses von G6P-DH und HK
5.1 Ergebnisse der Vorkultivierungen und der Kultivierungen
5.1.1 Messgrößen der ersten Satz-Kultivierung (Satz-1)
5.1.2 Messgrößen der zweiten Satz-Kultivierung (Satz-2)
5.1.3 Messgrößen der ersten Satz-Kultivierung mit impulsweiser Zufütterung (IZ-Satz-1)
5.1.4 Messgrößen der zweiten Satz-Kultivierung mit impulsweiser Zufütterung (IZ-Satz-2)
5.1.5 Messgrößen der Zulauf-Satz-Kultivierung mit nachfolgender kontinuierlicher Prozessführung (IZ-Satz-Konti)
5.1.6 Messgrößen der kontinuierlichen Kultivierung (Konti-1) sowie Säureverbrauch und zudosierte Antischaummittelvolumen aller Kultivierungen
5.1.7 Charakteristische Prozesskenngrößen der Kultivierungen im Vergleich
5.2 Ergebnisse der Fest/Flüssig-Trennung mit einer Filtrationsanlage
5.2.1 Fest/Flüssig-Trennung mit Papierfiltern
5.2.2 Fest/Flüssig-Trennung mit Membranfiltern
5.3 Ergebnisse des Zellaufschlusses mit der Kugelmühle
5.3.1 Vorversuche mit und ohne Sand
5.3.2 Vorversuche mit Sand mit Hilfe eines klassischen Versuchsplans
5.3.3 Ergebnisse des Faktorenversuchsplans
5.4 Ergebnisse der Zentrifugation
5.5 Ergebnisse der Anionenaustauschchromatographie
5.5.1 Anionenaustauschchromatographie mit Proteinlösung aus Trockenhefe mit Hilfe eines linearen Gradienten (Chroma-1)
5.5.2 Anionenaustauschchromatographie mit Proteinlösung aus kultivierter Hefe mit Hilfe eines linearen Gradienten (Chroma-2)
5.5.3 Anionenaustauschchromatographie mit Proteinlösung aus Presshefe mit Hilfe eines Stufengradienten (Chroma-3)
5.5.4 Anionenaustauschchromatographie mit Proteinlösung aus kultivierter Hefe mit Hilfe eines Stufengradienten (Chroma-4)
5.6 Ergebnisse und Diskussion der Lagerung von G6P-DH und HK

6 Diskussion der Ergebnisse der Teilverfahren des Herstellungsprozesses
6.1 Diskussion der Ergebnisse der Vorkultivierungen und der Kultivierungen
6.2 Diskussion der Ergebnisse der Mikrofiltration
6.3 Diskussion der Ergebnisse des Zellaufschlusses
6.4 Diskussion der Ergebnisse der Zentrifugation
6.5 Diskussion der Ergebnisse der Chromatographieversuche
6.6 Gesamtbilanz des Prozesses in Bezug auf G6P-DH
6.7 Ergebnisse und Diskussion des selbst hergestellten Glucosetestes im Vergleich mit dem Glucosetest von Roche

7 Vorschlag zur Durchführung eines Praktikums

8 Kostenvergleich des zweiten selbst hergestellten Glucosetestes mit dem gekauften Glucosetest von Roche

9 Zusammenfassung und Ausblick

10 Chemikalien- und Verbrauchsmaterialienliste sowie Geräteliste
10.1 Chemikalien- und Verbrauchsmaterialienliste
10.2 Geräteliste

11 Literaturverzeichnis

12 Verzeichnis der Symbole und Indizes

13 Abkürzungsverzeichnis

14 Abbildungsverzeichnis

15 Tabellenverzeichnis

16 Antrag auf Ausgabe des Diplomthemas

17 Erklärung

18 Anhang
18.1 Versuchsanleitung zur Durchführung des Praktikums
18.2 Musterprozess mit Prozesskenngrößen in Kurzform
18.3 Definition der Enzymaktivität
18.4 Rohdaten und Datenblätter

1 Einleitung

Diese Diplomarbeit entstand im Rahmen meiner Ausbildung im Studiengang Medizintechnik, Fachrichtung Biotechnologie, die ich von Oktober 1996 bis Mai 2002 an der Fachhochschule Jena absolvierte.

In der Zeit meines Studiums gab es einen Aufschwung der Biowissenschaften, darunter auch der Biotechnologie. Insgesamt gibt es zur Zeit ca. 1200 Biotechnologieunternehmen in Deutschland [Mietzsch, A.; 2001] und der Trend zur Unternehmensgründung ist steigend. Zu Recht wird die Biotechnologie als eine der Schlüsseltechnologien des 21. Jahrhunderts bezeichnet. Unter anderem erhofft man sich von ihr die Linderung und Heilung von bislang unheilbaren Krankheiten wie z.B. von Chorea Huntington, Mukoviszidose und Krebs.

„Unter Biotechnologie versteht man die Herstellung oder Veränderung von chemischen Verbindungen mit Hilfe lebender Organismen oder Teilen von Organismen im Rahmen industrieller Verfahren. Darunter fallen beispielsweise die Herstellung und Konservierung von Nahrungs- und Genussmitteln wie Brot, Sauerkraut, Käse, Bier und Wein aber auch von Arzneimitteln wie Antibiotika (z.B. Penicilline), Vitaminen, Blutprodukten (z. B. Serumalbumin, Blutgerinnungsfaktoren, Immunoglobuline). Weiterhin zählen zur Biotechnologie die Produktion von chemischen Vor- und Zwischenprodukten wie Zitronensäure, Aminosäuren oder Ethylalkohol und die Herstellung von Enzymen“ [Folienserie des Fonds der Chemischen Industrie, 1996].

Enzyme gehören chemisch betrachtet zu den Proteinen und wirken als biochemische Katalysatoren, das heißt, sie beschleunigen eine chemische Reaktion. Sie sind an nahezu allen Umsetzungen im Stoffwechsel von Organismen beteiligt. Durch ihre hohe Substratspezifität hat ihre Bedeutung in enzymatischen Analysenmethoden stark zugenommen.

Folgende Enzyme werden unter anderem mit Hilfe der Biotechnologie mittlerweile industriell gewonnen.

Tabelle 1 : Wichtige industrielle Enzyme [Folienserie des Fonds der Chemischen Industrie, 1996]

Enzym Rohstoffe Anwendung

Protease Bacillus Waschmittel-, Mehl-Zusätze, Getränke-

Aspergillus industrie, Käseherstellung, Medizin

a - Amylase Bacillus Stärkeverzuckerung, Textil- und Papier-

Aspergillus verarbeitung, Back- und Maischprozesse,

Pankreas Verdauungshilfe

Glucose-Isomerase Streptomyces Stärkesirup-Herstellung

Lipase Candida sp. Fettspaltung, Verdauungsförderung

Peroxidasen Pilz, Pflanzen Textilbleiche, Polymerisationen

Penicillin-Amidasen E. coli Antibiotika-Herstellung

Glucose-6-phosphat E. coli Glucosebestimmung

Dehydrogenase

Hexokinase S. cerevisiae Glucosebestimmung

2 Zielsetzung

Das Ziel dieser Diplomarbeit war es, ein Verfahren zur Herstellung der Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase (G6P-DH) und Hexokinase (HK) aus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) für die Anwendung zur Glucoseanalytik innerhalb eines Studentenpraktikums zu optimieren.

G6P-DH und HK werden z.B. zur quantitativen Glucosekonzentrationsbestimmung in Kulturbrühen oder zur Ermittlung des Blutzuckergehaltes und des Zuckergehaltes in Lebensmitteln eingesetzt.

In dem Studentenpraktikum sollen G6P-DH und HK von den Studierenden selbständig aus Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) gewonnen werden, um damit den Einkauf dieser Enzyme einzusparen. Die isolierte G6P-DH und HK soll dann zur Glukosekonzentrationsbestimmung in der im folgenden Praktikum benutzten Kulturbrühe eingesetzt werden. Die Messung der Glucosekonzentration einer Zellkultur ist notwendig, um den Substratverbrauch und damit den Substratausbeutekoeffizienten zu ermitteln.

Weiterhin soll den Studierenden ein Vefahren zur Herstellung und Aufarbeitung von Enzymen im Rahmen ihrer Ausbildung vermittelt werden.

Für das Praktikum werden Geräte verwendet, die der Fachhochschule Jena bereits zur Verfügung standen.

Zu beachten war, dass bei der Optimierung Aufwand und Kosten der Versuche in einem vernünftigen Verhältnis zu dem Nutzen in Beziehung standen. Um das Verfahren zu optimieren wurde es zunächst mit aus der Literatur oder empirisch gewonnenen Parametern durchgeführt. Dann wurde versucht den oder die „bottlenecks“ zu beseitigen. Hierzu wurden nacheinander die Stellen, die den größten Verlust an Enzym verursachten, optimiert. Dabei durfte jedoch das ideale Kosten-Nutzen-Verhältnis nicht aus den Augen verloren werden.

Vor Beginn der eigentlichen Versuche wurden die Optimierungsrandbedingungen festgelegt. Dies waren zum einen die Anzahl der Versuche, die so niedrig wie möglich gehalten werden sollten, um ein geringes Kosten-Nutzen-Verhältnis zu erreichen. Zum anderen spielt die Dauer der Versuche im Rahmen des Praktikums eine Rolle. Für die einzelnen Versuche steht nur eine begrenzte Zeit zur Verfügung. Weiterhin ist es wichtig, dass die einzelnen Schritte und Verfahren von den Studierenden soweit wie möglich selbständig durchgeführt werden können, um einen höheren Lerneffekt zu gewährleisten. Kann der Student die Aufgabe nicht allein durchführen, muss das wissenschaftliche Hochschulpersonal dies tun.

Nachdem die Optimierungsrandbedingungen festgelegt wurden, konnten bei denjenigen Verfahrensschritten, wo es sinnvoll erschien, die hierbei wesentlichen Parameter mit Hilfe einer faktoriellen Versuchsplanung optimiert werden.

Die Diplomarbeit ist in sechs Kapitel unterteilt. Im 3. Kapitel der Arbeit werden die theoretischen Grundlagen der Enzyme G6P-DH und HK und des Mikroorganismus Bäckerhefe sowie der einzelnen Teilverfahren des Herstellungsprozesses dargestellt. Auf die verwendeten Materialien und Methoden wird im 4. Kapitel eingegangen. Das 5. Kapitel beschreibt die Ergebnisse der Versuche der einzelnen Teilverfahren. Im 6. Kapitel werden diese Ergebnisse zusammen mit einem selbst hergestellten Glucosetest diskutiert. Mit einem Vorschlag zur Durchführung eines Praktikums beschäftigt sich der 7. Abschnitt. Im 8 Kapitel wird ein Kostenvergleich zwischen selbst hergestelltem und gekauftem Glucosetest angestellt.

3 Theoretische Grundlagen

3.1 Die Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase

3.1.1 Eigenschaften der Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase

G6P-DH und HK sind Biokatalysatoren, das heißt, sie beschleunigen chemische Reaktionen ohne das chemische Gleichgewicht zu verändern, wobei sie nicht verbraucht werden und am Ende der Reaktion unverändert vorliegen. Sie setzen die Aktivierungsenergie der Reaktion herab, so dass eine thermodynamisch mögliche Reaktion bei Zimmertemperatur ablaufen kann. Enzymkatalysierte Reaktionen laufen um den Faktor 108-1020 mal schneller ab als nichtkatalysierte Reaktionen [Schlee, D./ Kleber, H.-P.; 1991]. Ihre Wirkungsweise beruht darauf, dass eine katalytische Reaktion am aktiven Zentrum des Enzymmoleküls, das aus bestimmten Teilen der Polypeptidkette durch eine besondere Faltung entsteht, stattfindet. Dabei wird das Substrat am aktiven Zentrum durch Wasserstoff-Brücken, Ionenanziehung und kovalente Wechselwirkungen gebunden. Emil Fischer beschrieb vor ca. 100 Jahren, dass Enzym und Substrat räumlich wie Schlüssel und Schloss zusammenpassen [Karlson, P. et al.; 1994].

Die Aktivität eines Enzyms kann, muss aber nicht spezifisch gegenüber einem einzigen Substrat sein. G6P-DH (EC 1.1.1.49) wirkt hochspezifisch (absolute Substratspezifität), da es nur Glucose-6-phosphat in Gluconat-6-phosphat umsetzt. Weniger spezifisch reagiert HK (EC 2.7.1.1) (relative Substratspezifität), das mehrere Monosaccharide (Hexosen) wie Glucose, Fructose und Mannose mit Hilfe des Coenzyms ATP in die entsprechenden Monosaccharid-6-phosphate umwandelt.

Beide Proteine gehören zu den intrazellulären, konstitutiv gebildeten Enzymen, die nicht ins Nährmedium ausgeschleust werden [Silva, D.P. /Pessoa, A. et al.; 1994].

G6P-DH wurde Anfang der 30er Jahre von O. Warburg erstmals aus Erythrozyten und Hefe isoliert. Es kommt in allen Eukaryonten und einigen Bakterien vor und katalysiert im Pentose-Phosphat-Zyklus die erste biochemische Reaktion, indem es Glucose-6-phosphat in Gluconolacton-6-phosphat (6-Phospho-gluconolacton) umsetzt. Dieses wird wiederum durch Hydratisierung in Gluconat-6-phosphat (6-Phospho-gluconat) umgewandelt.

G6P-DH zählt zur Klasse der Oxidoreduktasen, die bei einer katalytischen Reaktion Wasserstoff und Elektronen übertragen. Es besitzt NADP-frei ein Molekulargewicht von 102 kDa [Yue, R.H. et al.; 1967] und besteht aus 2 Untereinheiten. Sein isoelektrischer Punkt liegt beim NADP-freien Enzym bei 6,05 [Roche Diagnostics GmbH, 2001]. Heute wird G6P-DH überwiegend aus Saccharomyces cerevisiae, aus Leuconostoc mesenteroides oder aus rekombinanten E. coli -Zellen gewonnen. In dieser Diplomarbeit wird nur das Enzym aus Bäckerhefe betrachtet, da es eine größere Substrataffinität zu Glucose-6-phosphat besitzt als das Enzym aus Leuconostoc mesenteroides [Fritz, U.; 1999].

HK gehört zu den Transferasen, die Gruppenübertragungen katalysieren, und besteht aus 485 Aminosäuren [Internet, Swiss Prot: Protein Data Bank; 2001]. Es wird hauptsächlich aus S. cerevisiae gewonnen und transferiert in der Glykolyse (Embden-Meyerhof-Abbauweg) im ersten Schritt eine Phosphatgruppe von ATP auf Glucose.

HK besitzt ein Molekulargewicht von 57 kDa in Citrat/Phosphatpuffer. Es kann unter anderen Pufferbedingungen Dimere bilden [Roche Diagnostics GmbH; 2001]. Sein isoelektrischer Punkt beträgt 4,7 [Gerhartz, W.; 1990]. Bei der HK aus Saccharomyces cerevisiae können 3 verschiedene Enzymformen (Isoenzyme: P I, P II und Glucokinase) auftreten.

3.1.2 Die beiden Coenzyme Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP+) und Adenosin­triphosphat (ATP) sowie Mg2+-Ionen als Cofaktoren

Coenzyme sind niedermolekulare Verbindungen, die bei enzymatisch katalysierten Reaktionen eine Übertragungsrolle spielen. Sie werden im Gegensatz zu Enzymen während der Reaktion chemisch verändert und sind somit nicht als Cokatalysatoren anzusehen, sondern als Cosubstrate. Jedoch unterscheiden sie sich von den Substraten dadurch, dass sie in einem kurzen Zyklus, das heißt meist in einem Reaktionsschritt, regeneriert werden. Coenzyme treten in 2 unterschiedlichen Formen auf. Wenn sie dauerhaft binden, werden sie als prosthetische Gruppe bezeichnet, wenn sie nur vorübergehend reversibel und nicht-kovalent mit dem Enzym reagieren, gelten sie als eigentliche Cosubstrate. Coenzyme können auch als Carrier (Transportmittel) auftreten. Bei der Glucoseanalytikmethode mit G6P-DH und HK wirken NADP+ (EC 1.1.1.119) und ATP als solche Coenzyme im Sinne von Cosubstraten [Fritz, U. ;1999].

Damit der Glucosetest mit den Enzymen G6P-DH und HK funktioniert, brauchen die Enzyme zur größtmöglichen Aktivitätsentwicklung ferner Magnesium-Ionen in einer Konzentration zwischen insgesamt 4 und 10 mmol/l, die auch als Cofaktoren bezeichnet werden [Fritz, U.; 1999].

3.1.3 Die Methode der Glucosebestimmung mit Hilfe von Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase

Das Verfahren der enzymatischen Glucosebestimmung beruht auf einem gekoppelten optischen Test. Zuerst wird die D-Glucose durch das Enzym HK unter Bildung von ADP aus ATP zu Glucose-6-phosphat (G6P) phosphoryliert. Dann wird G6P durch das Enzym G6P-DH oxidiert und NADP+ wird als Protonenakzeptor zu NADPH reduziert. Die gebildete Menge an NADPH ist der zu messenden Glucosemenge direkt proportional [Lottspeich, F./Zorbas, H.; 1998]. Unten sind die entsprechenden Reaktionsgleichungen angegeben.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die durch die Reduktion entstandenen Strukturunterschiede zwischen NADP+ und NADPH ergeben eine Änderung der Lichtabsorption im nahen UV-Bereich. NADPH zeigt bei 260 nm und bei 340 nm ein Absorptionsmaximum. NADP+ weist bei 340 nm fast keine Absorption auf [Weide, H.; Pàca, J.; Knorre, W. A.; 1991].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1 : Absorptionsspektren von NADP+ und NADPH [Fritz, U.; 1999]

Wird nun mit einem Spektralphotometer die Extinktion bei einer Wellenlänge von 340 nm über einen be-stimmten Zeitraum (ca. 10-30 min) gemessen, kann über die NADPH-Zu- bzw. Abnahme die Glucose-konzentration bestimmt werden. Mit Hilfe der unten stehenden Formel des Testkites Gluco-quant, Nummer 1447513 (Roche Diagnostics GmbH) kann die Glucosekonzentration ermittelt werden:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Unter der Extinktion wird hierbei der Logarithmus aus dem Verhältnis von einfallendem Licht zu durchgelassenem Licht verstanden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.2 Charakterisierung des Mikroorganismus Bäckerhefe

3.2.1 Allgemeine Betrachtung und Physiologie von Hefen sowie taxonomische Einordnung von S. cerevisiae

Als Mikroorganismus zur Herstellung der Enzyme G6P-DH und HK wurde Bäckerhefe, lat. Saccharomyces cerevisiae (wörtlich übersetzt „Zuckerpilz“) (Abbildung 2), gewählt. Hefen spielen in der Biotechnologie eine äußerst wichtige Rolle. Sie werden zur Backhefe-, Wein- und Ethanolherstellung benutzt. Weiterhin werden viele Enzyme wie zum Beispiel Invertase, G6P-DH, HK oder die rekombinanten Proteine Insulin, Albumin und Interferon aus ihnen gewonnen.

Hefen sind 5-10 µm groß, rund oder oval und besitzen eine feste Zellwand. Ihre Vermehrung erfolgt asexuell durch Knospung (Sprossung) oder sexuell durch Teilung. Die Zellen leben einzeln oder in kleinen Gruppen. Sie können aerob oder anaerob wachsen, auch auf einfachsten Substraten (z.B. Zucker und Kohlenwasserstoffe, plus Stickstoff). Sie gedeihen ebenfalls bei sehr hohen osmotischen Drücken und können dadurch den Verderb zuckerhaltiger Produkte verursachen. Hefen wachsen noch bei niedrigen pH-Werten, wo Bakterien wenig Konkurrenz für sie darstellen. Weiterhin können sie als Sprosszelle oder Hyphe wachsen. Diese Fähigkeit wird als Dimorphismus bezeichnet [Wainwright, M.; 1992].

Die Hefen zählen zu den Eukaryonten und zu den bis jetzt bestuntersuchtesten Mikroorganismen. Sie gehören zu den Pilzen und die meisten, darunter auch S. cerevisiae, werden zur Abteilung der Ascomycota (Schlauchpilze) gerechnet. Hefen sind weiterhin mit sehr wenigen Ausnahmen nicht pathogen für den Menschen [Sonnleitner, B.; 1997].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2 : S. cerevisiae im Lichtmikroskop, aufgenommen mit einem Zeiss Axioskop mit einer CCD-Kamera [Internet; 2001]

3.2.2 Stoffwechsel von S. cerevisiae

S. cerevisiae greift zur Energiegewinnung auf die Atmung oder die Gärung zurück. Sie kann je nach Verfügbarkeit von Sauerstoff zwischen anaerobem und aerobem Abbau des Substrates wechseln (fakultativer Aerobier). Deshalb benutzt die Fermentationsindustrie S. cerevisiae auch für zwei verschiedene Produktionsprozesse, zum einen anaerob zur Umwandlung von Zuckern zu Ethanol und aerob zur Erzeugung von Biomasse [Muttzall, K.; 1993]. Der aerobe Abbauweg ist für die Hefe energetisch weitaus günstiger und führt zu wesentlich höheren Biomasseausbeuten. Der Vorgang verläuft schematisch nach folgender biotransformatorischen Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Prozess der Atmung läuft hierbei folgendermaßen ab:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Dabei werden pro Mol Glucose 38 Mol ATP gewonnen. Dies bedeutet eine Energieausbeute von 40 %. Bei der aeroben Kultivierung entstehen pro kg Glucose 540 g Hefe-Trockenmasse (YX/S = 0,54) mit 8 % Asche [Mutzall, K.; 1993].

Bei ungenügender Versorgung der Hefezellen mit Sauerstoff schalten die Zellen sofort auf den anaeroben Abbau der Glucose (Gärung) und bilden Ethanol. Dieser Effekt wird auch nach dem Entdecker Pasteur (1861) als Pasteur-Effekt bezeichnet.

Bei der anaeroben alkoholischen Gärung, die schematisch nach der Gleichung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abläuft, werden je mol Glucose nur 2 Mol ATP für die Zelle gewonnen. 92 % der freien Enthalpie verbleiben im Stoffwechselprodukt Ethanol, etwa 6 % werden als Reaktionswärme abgegeben. Für das Zellwachstum verbleiben nur 2,1 %. Damit ist das anaerobe Wachstum ein sehr unökonomischer Prozess für die Zelle.

Der Ausbeutekoeffizient für das Produkt Ethanol YE/S beträgt bei der Gärung 0,47. Ein Teil des Substrates wird nicht zu Ethanol, sondern zu Biomasse und Nebenprodukten, umgesetzt. Für YX/S ergibt sich hierbei der Wert 0,075 [Muttzall, K.; 1993].

Weiterhin können Hefen bei genügender Versorgung mit Sauerstoff auch auf Ethanol als Substrat wachsen. Diese Affinität zu zwei verschiedenen Substraten wird als Diauxie bezeichnet.

Es ergeben sich bei Ethanol als Substrat folgende stöchiometrischen Verhältnisse:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Ausbeutekoeffizient (YX/E) hierbei beträgt 0,7 [Muttzall, K.; 1993].

Darüber hinaus wird bei ausreichender Versorgung mit Sauerstoff bei hohen Glucosekonzentrationen (über 0,1 g/l) nicht nur Biomasse, sondern auch Ethanol, gebildet. Dieser Sachverhalt wird auch Crabtree-Effekt genannt [Brammer, U.; 1990].

Die Umsatzgleichung hierfür lautet:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.3 Allgemeiner Ablauf des Praktikums zur Herstellung der Enzyme G6P-DH und HK

Um intrazelluläre Enzyme aus Mikroorganismen zu gewinnen, muss der Mikroorganismus, in diesem Fall die Bäckerhefe, zuerst in Zellkultur vermehrt werden. Dies geschieht bei der industriellen Herstellung von Enzymen zumeist submers in einem Bioreaktor. Danach folgen mehrere Aufarbeitungsschritte wie z. B. eine erste Fest/Flüssigtrennung, ein Zellaufschluss, eine weitere Fest/Flüssigtrennung und eine Feinreinigung der Enzyme. Der Ablauf des Herstellungsprozesses der beiden Enzyme im Studentenpraktikum mit den der Fachhochschule zur Verfügung stehenden Geräten ist im folgenden Grundfließbild dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3 : Grundfließbild des Herstellungsprozesses der Enzyme G6P-DH und HK im Studentenpraktikum

3.4 Theoretische Grundlagen der Satz-, Zulauf- und kontinuierlichen Kultivierung

3.4.1 Allgemeine Betrachtungen zur Satz-, Zulauf- und kontinuierlichen Kultivierung

Am Anfang des Herstellungsprozesses von G6P-DH und HK steht die Kultivierung von S. cerevisiae. Drei häufig angewandte Prozessführungen in der Biotechnologie zur Gewinnung von Enzymen und Biomasse sind die Satz-, Zulauf- und kontinuierliche Kultivierung.

Eine Satz-Kultivierung ist eine Betriebsweise bei der während des Zellkulturprozesses weder Substrat noch Biomasse zu- oder abgeführt werden. Zur Zeit t = 0 wird im Fermenter die sterilisierte Nährlösung mit einer Reinkultur von Mikroorganismen beimpft und anschließend unter optimalen Wachstums-bedingungen gehalten. Dabei werden bei aeroben Prozessen Sauerstoff, wenn notwendig Lauge oder Säure zur Regelung des pH-Wertes und gegebenenfalls Antischaummittel hinzugegeben. Nach Beendigung der Kultivierung wird entleert und gereinigt, wonach der Bioreaktor für die nachfolgende Charge zur Verfügung steht. Durch den Stoffwechsel der Zellen ändern sich die Biomasse- und Metabolitkonzentrationen und die Substratzusammensetzung ständig. Obwohl sich bei der Satz-Kultivierung eine niedrige Produktivität ergibt und der Zellkulturprozess von der vorgelegten Substrat-konzentration abhängig ist, werden viele industrielle Bioprozesse im Satz-Betrieb ausgeführt, da die relativ einfache, robuste und flexible Apparatur und die minimale erforderliche Prozessregelung günstige Prozesskosten ermöglichen und der Einsatz von frischem Impfgut für jede Charge das Infektionsrisiko auf niedrigem Niveau hält.

Einige Nachteile des Satz-Betriebes können beim sog. Zulauf-Betrieb verringert werden. Hierbei wird im Anschluss an eine Kultivierungsphase im Satz-Betrieb beim Erreichen einer gewünschten minimalen Substratkonzentration frisches steriles Substrat stoßweise oder kontinuierlich zugegeben. Im Vergleich zum Satzprozess wird, falls keine Wachstumsinhibition durch Stoffwechselprodukte auftritt, im gleichen Zeitraum eine höhere Endbiomassekonzentration und damit eine höhere Produktivität erreicht, da der Mikroorganismus nicht die Übergangsphase zur stationären Phase durchläuft, in der das Substrat limitierend wirkt.

Bei einer kontinuierlichen Kultivierung wird dem Fermenter Substrat mit andauernder Zufuhrrate F (t) zugegeben und gleichzeitig wird ein ebenso großer Strom von der Kulturbrühe entfernt. Es wird vereinfachend davon ausgegangen, dass der Fermenterinhalt durch gleichmäßige Verteilung von Substrat und Biomasse homogen gemischt ist. Dadurch ist die Zusammensetzung des Produktstromes aus dem Bioreaktor identisch mit dem Fermenterinhalt. Mit dem Produktstrom verlässt neben Biomasse auch nicht umgesetztes Substrat den Bioreaktor, was nachteilig ist und dadurch umgangen werden kann, dass das Substrat zurückgeführt wird [Muttzall, K.; 1993].

3.4.2 Gleichungen zur Berechnung der Prozesskenngrößen der Satz-Kultivierungen und der kontinuierlichen Zellkulturen

Im nächsten Abschnitt werden die Gleichungen aufgeführt, die zur Berechnung der Prozesskenngrößen der Kultivierungen notwendig sind. Bei einem unstrukturierten Modell, in dem die Wachstums-geschwindigkeit der Zellen proportional zur Zellmasse ist, ergibt sich im Satz-Betrieb aus der Gleichung für die Wachstumsgeschwindigkeit:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

durch Integration das folgende Wachstumsgesetz:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Gleichung zeigt das Prinzip des exponentiellen oder logarithmischen Wachstums auf. Solch ein ungebremstes Wachstum ist nur für ein begrenztes Intervall möglich, da durch äußere Einflüsse (z.B. Substratverbrauch, gebildete Hemmstoffe, Beeinträchtigung des Stofftransportes durch zu hohe Biomassekonzentration) nach einiger Zeit die Wachstumsrate abnimmt und sich schließlich ein Stillstand des Wachstums einstellt.

Die Auflösung der obigen Gleichung nach der spezifischen Wachstumsrate liefert:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Für den Satz-Betrieb gilt bei optimaler Sauerstoffsättigung die Monod-Kinetik, mit:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei ist die spezifische Wachstumsrate rX einer homogenen Kultur konstant und maximal, solange die erforderlichen Nährstoffe (Substrat, Nährsalze, Spurenelemente) im Überschuss vorliegen. Ist die Verfügbarkeit eines Substrates begrenzt (limitierendes Substrat), so verringert sich die spezifische Wachstumsrate gemäß der Gleichung [11]. Wenn das gesamte Substrat verbraucht ist und auch keine alternativen Nährstoffe zur Verfügung stehen, wird rX = 0, das Wachstum kommt zum Stillstand.

Der Substratverbrauch im Satz-Betrieb kann über die spezifische Substratverbrauchsrate ermittelt werden:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Zeitdauer bis zum Verbrauch des Substrates errechnet sich aus:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Ertragskoeffizient (Ausbeutekoeffizient) im Satzbetrieb wird aus dem Verhältnis der spezifischen Wachstumsrate zur spezifischen Substratverbrauchsrate bestimmt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Im kontinuierlichen Betrieb ergibt sich die zeitliche Zunahme der Biomasse im Reaktor aus der Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Für den Gleichgewichtszustand eines kontinuierlich betriebenen Rührkesselfermenters bei dX/dt = 0 gilt somit:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Gleichung für die Verdünnungsrate D, die aus dem Quotienten von Zuflussvolumenstrom zu Arbeitsvolumen des Bioreaktors ermittelt wird, lautet:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Auch die Substratkonzentration ist im Gleichgewichtszustand konstant, so dass X für rX = D berechnet wird durch:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Substratverbrauchsrate im kontinuierlichen Betrieb setzt sich zusammen aus:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Für die Produktbildungsrate bei wachstumsgekoppelter Produktbildung gilt die Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Damit ergibt sich für kP:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.5 Praxis der Kultivierung und Aufarbeitung von S. cerevisiae in der Industrie und Vergleich mit der Kultivierung im Studentenpraktikum

In der industriellen Produktion wird im Zulaufverfahren gearbeitet, um möglichst viel Hefe zu gewinnen. Da die Biomasseausbeuten von der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit der Hefe abhängen und sich die höchsten Ausbeuten bei Werten um rX < 0,2 h-1 ergeben, wird durch substratlimitierte Bedingungen im Zulaufverfahren die Wachstumsgeschwindigkeit reduziert. Nach der Monod-Gleichung werden Wachstumsgeschwindigkeiten unter rx = 0,2 h-1 bei einer Substratkonzentration S unter 0,1 g/l erzielt (rX,max = 0,43 h-1; KS = 0,2 g/l). Bei höheren Glucosekonzentrationen (über 0,1 g/l) wird die Glucose, die nicht veratmet werden kann, auch bei Anwesenheit von Sauerstoff, von den Hefezellen in Ethanol umgesetzt.

Backhefe wird als Massenprodukt kostengünstig produziert. Der Preis liegt hierbei um 1,53 Euro/kg (27-28 % Trockenbiomasse). Da zur Erzeugung von 1 kg Hefetrockenmasse fast 2 kg Glucose benötigt werden, muss aus Kostengründen von einer preisgünstigen Kohlenstoffquelle ausgegangen und eine durch aerobe Kultivierung maximale Biomasseausbeute angestrebt werden. Daher wird in der Praxis ausschließlich Melasse als Kohlenstoffquelle eingesetzt. Die darin enthaltene Saccharose wird im Fermenter durch extrazelluläre Hefeenzyme (Invertase) schnell zu Fructose und Glucose hydrolisiert, die dann von den Hefezellen aufgenommen und umgesetzt wird. Melasse enthält ungenügend Stickstoff und Phosphor, so dass Ammoniumsulfat oder –nitrat und Mono- oder Diammoniumphosphat zugesetzt werden müssen. Die Melasse wird verdünnt, so dass sie fließfähig wird (ca. 50 % Trockenbiomasse), mit Ammoniak und Phosphaten versetzt, mit Schwefelsäure auf pH = 4,35­-5 eingestellt, in einer Klär-zentrifuge vom Schlamm befreit und im Durchlauferhitzer sterilisiert.

Bei der Hefevermehrung geht man von ausgewählten Reinzuchthefen aus, die in mehreren Stufen unter aseptischen Bedingungen zur sogenannten Stellhefe vermehrt werden (4 Stufen bis zum Inokulum). Die letzte Vermehrungsstufe zur Versandhefe erfolgt in belüfteten, nicht aseptischen Fermentern von 50 bis 200 m3 Inhalt. Man impft mit etwa 10-15 % Inoculum von der gewünschten Endbiomassekonzentration. Die anfängliche Biomassekonzentration liegt bei etwa 5-10 g/l. Während der typischen Kultivierungszeit von 12 bis 15 Stunden bei 30–33 °C vermehrt sich die Hefe-Impfmenge um etwa das 6–12-fache auf ca. 30–70 g/l. Nach Beendigung des Substratzulaufes muss die Hefe noch 1 bis 2 Stunden unter anaeroben Bedingungen reifen, um dadurch die Triebkraft bei der späteren anaeroben Gärung im Teig zu erhöhen.

Nach beendeter Gärung wird die Hefe mit Hilfe von Zentrifugen als „Hefesahne“ mit etwa 20 % Trocken-biomasse abgetrennt, ein- bis zweimal mit Wasser gewaschen und wiederum zentrifugiert. Zur Hefe-konzentration werden Düsenseparatoren mit 6–12 Düsen von 0,4–2,2 mm Durchmesser verwendet, da der Feststoffgehalt für selbstentleerende Zentrifugen zu hoch ist. Das Hefekonzentrat wird auf 4–6 °C gekühlt, in Filterpressen auf etwa 27-28 % Trockenbiomasse konzentriert, zu Strängen gepresst und verpackt. Die schonende Trocknung der granulierten Hefe erfolgt im Wirbelbett, nur selten im Sprühtrockner. Für spezielle Anwendungen wird die Hefe auch gefriergetrocknet [Muttzall, K; 1993] (Abbildung 4).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4 : Schema der Backhefeproduktion [Muttzall, K; 1993]

Im Gegensatz zum industriellen Prozess kann die Zellkultur im Studentenpraktikum nicht im Zulauf-Betrieb erfolgen, da der Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 2 Litern und einem Füllvolumen von 3,2 Litern für diese Prozessführung zu klein ist. Um jedoch ebenfalls hohe Ausbeuten zu erreichen wird mit Hilfe einer Satz-Kultivierung mit impulsweiser Zufütterung eine bestimmte Konzentration an Biomasse erzeugt, die dann mit einer kontinuierlichen Kultivierung aufrecht gehalten wird. Weiterhin wird als Kohlenstoffquelle im Praktikum Glucose verwendet. Glucose benötigt im Gegensatz zu Melasse keine Vorbehandlung und ist um einen Prozess zu optimieren ein geeignetes, genau definiertes Substrat.

Ferner wird im Praktikum nur eine Vorkultivierung durchgeführt und mit einer geringeren Menge an Inokulum beimpft, da dieses für genügend Trockenbiomasse zur Gewinnung der beiden Enzyme ausreicht.

3.6 Theoretische Grundlagen der Membranmikrofiltration

3.6.1 Allgemeine Charakterisierung der Membranmikrofiltration

Nach der Kultivierung muss die Hefefeuchtbiomasse von der Kulturbrühe abgetrennt werden. Während in der Industrie Zentrifugen (z. B. Teller- oder Düsenseparatoren oder Dekanter) eingesetzt werden, steht für das Praktikum eine Überdruckfiltrationsanlage zur Verfügung. Diese basiert auf dem Prinzip der statischen Membranmikrofiltration mit Überdruck. Hierbei trennt eine Membran die Biomasse durch eine von außen treibende Kraft von der Kulturbrühe (Fest/Flüssig-Trennung).

Nach einem Vorschlag der European Society of Membrane Science and Technology werden als Mikrofiltration Membranverfahren mit einer Trenngrenze im Bereich von 0,02 bis 10 µm bezeichnet. Die Trenngrenze liegt dabei zwischen der Ultrafiltration und der konventionellen Filtration [Ripperger, S.; 1992] (Abbildung 5).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5 : Trenngrenzenbereiche von Filtrations- und Membranverfahren [Ripperger, S.; 1992]

3.6.2 Einsatz und Eigenschaften der Membranmikrofiltration

Die Membranmikrofiltration spielt in der Biotechnologie vor allem bei der Abtrennung der Proteinlösungen von den aufgeschlossenen Zellen (Debris) eine wichtige Rolle. Sie kann aber auch zur Abtrennung der Feuchtbiomasse von der Kulturbrühe eingesetzt werden.

Die Mikrofiltration wurde zunächst als reine Oberflächenfiltration entwickelt. Hierbei werden die Stoffe, die die Membran nicht passieren, an der äußeren Oberfläche des Filtermediums abgetrennt und bilden den Filterkuchen, der bei der Membranfiltration oft als Deckschicht bezeichnet wird.

Zwei grundsätzliche Verfahren der Mikrofiltration können unterschieden werden :

1. die statische Mikrofiltration (Dead-End-Filtration)
2. die dynamische Mikrofiltration (Crossflow- Filtration)

Auf die Crossflow- oder Tangentialfiltration wird hier nicht eingegangen, da sie nicht im Studenten-praktikum verwendet wird. Interessierte Leser werden auf das Buch von Ripperger, S. [Mikrofiltration mit Membranen, 1992] hingewiesen, in der die Crossflow-Filtration näher erläutert wird.

Bei der statischen Filtration wächst, entsprechend der Kuchenfiltration in konventionellen Filtrations-apparaten, die Dicke der Schicht aus abgetrennten Stoffen an der Oberfläche der Membran mit der Zeit an, so dass der Gesamtfiltrationswiderstand zunimmt. Es kommt ein Zeitpunkt, bei dem auch bei hohen Drücken nur noch eine geringe Flüssigkeitsmenge die Deckschicht durchströmt. Dann muss die Filtration abgebrochen und die Membran gereinigt oder gegen eine neue ausgetauscht werden (Abbildung 6). Diese diskontinuierliche Verfahrensweise ist nur bei Lösungen mit niedrigem Trübstoffgehalt vorteilhaft, da nur dann wirtschaftliche Filtrationsintervalle möglich sind [Ripperger, S.; 1992].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6 : Prinzip der Membranmikrofiltration mit Überdruck: p1: Eingangsdruck, p2: Ausgangsdruck, L: Höhe des Filterkuchens und A: Filterfläche

3.7 Theoretische Grundlagen des Zellaufschlusses mit einer Kugelmühle

3.7.1 Allgemeine Charakterisierung und Einsatz der Kugelmühle

Um das Enzym zu gewinnen, müssen die Zellen aufgeschlossen werden. Die Desintegration erfolgt mit einer Kugelmühle. Hierbei wird mit mehreren Mahlkörpern, zum Beispiel aus Hartglas, Edelstahl oder Mineraliengestein (Achat), durch schnelles Drehen der Mahlbehälter um die eigene Achse die Wand der Hefezelle zerrieben.

Die Mahlkörper, die sich im Innern eines horizontal gelagerten, rotierenden Hohlzylinders befinden, werden bei der Desintegration durch die Zentrifugalkraft auf eine gewisse Höhe mitgenommen, prallen auf das zu zerkleinernde Gut und zerreiben dieses. Da die Zentrifugalkraft ab einem gewissen Wert die Mahlwirkung aufhebt, kann die Drehzahl und damit die Fallhöhe nicht beliebig erhöht werden (Abbildung 7).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7 : Bewegung der Mahlkugeln in einer Kugelmühle: a) beim Grobmahlen, b) beim Feinmahlen mit j: Ablösungswinkel, FR : Radialkomponente der Gewichtskraft, FZ : Fliehkraft und n: Drehzahl [Hemming, W.; 1993]

Allgemein ist die Zerkleinerung eine weit verbreitete und eine sehr energieaufwendige verfahrenstechnische Grundoperation. Bei der Nassmahlung, die im Studentenpraktikum vorgesehen ist, können Energieeinsparungen von 12-38% gegenüber der Trockenmahlung erreicht werden [Delle, F.; 1994].

Technisch wird die Zerkleinerung mit losen Mahlkörpern in Kugelmühlen bereits seit ca. 150 Jahren verwendet [Delle, F.; 1994].

Am häufigsten in der Verfahrenstechnik eingesetzt werden Kugelmühlen in der Erzaufbereitung und in der Zementindustrie. Aber auch bei der Herstellung von Pigmenten, in der chemischen, pharmazeutischen und der keramischen Industrie kommen Kugelmühlen zum Einsatz. Entsprechend der vielfältigen Einsatzgebiete gibt es Kugelmühlen in fast allen Baugrößen, von Antriebsleistungen bis 8 MW und Durchsätzen bis zu 400 t/h und mehr bis hin zu kleinen Labormengen mit Füllmengen von nur wenigen Gramm [Leluschko, J.; 1985]. Vor allem kleinere Kugelmühlen, als die verwendete, werden in der Biotechnologie im Labormaßstab eingesetzt. Die in diesem Praktikum benutzte Kugelmühle findet in der Biotechnologie weniger Anwendung. Das liegt daran, dass mit Rührwerkskugelmühlen bessere Aufschlussergebnisse erzielt und ein höherer Durchsatz erreicht werden kann [Pittroff, M.; 1993].

3.7.2 Wichtige Parameter bei der Kugelmühle

Einer der wichtigsten Parameter bei der Mahlung in Kugelmühlen ist die Mahlkörpergröße. Die optimale Mahlkörpergröße verringert sich mit zunehmender Mahlgutfeinheit.

Weiterhin spielt die Mahlkörperdichte beim Zerkleinerungsprozess eine Rolle. Höhere Mahlkörperdichten führen zu größeren Zerkleinerungsgeschwindigkeiten.

Der Mahlkörperfüllgrad liegt in der Regel zwischen 30 % und 40 % des Mühlenvolumens und hat auf den Zerkleinerungsverlauf nur einen geringen Einfluss.

Die Zerkleinerungsleistung hängt darüber hinaus deutlich von der Mühlendrehzahl n ab. Eine höhere Drehzahl verkürzt die Mahldauer und erhöht den Feinanteil.

Ferner spielt beim Mahlvorgang die Mühlenauskleidung eine Rolle. So z. B. ist die Mahlung mit glatten Mühlenwänden günstig, da die dort auftretenden Rollbewegungen als zusätzliche Zerkleinerungseffekte genutzt werden können [Delle, F.; 1994].

Bei der für das Herstellungsverfahren von G6P-DH und HK eingesetzten Kugelmühle sind die Drehzahl, die Anzahl der Mahlkugeln und die Dauer des Mahlvorganges (Desintegrationszeit) die Optimierungsparameter. Obwohl durch die steigende Drehzahl die Kollisionshäufigkeit der Mahlkörper und die Schergeschwindigkeit zunimmt, erhöht sich im gleichem Maße die notwendige Antriebsleistung, der Verschleiß der Mahlkörper und die Temperatur. Vor allem die Temperatur sollte nicht zu sehr steigen, damit die Enzyme nicht denaturieren.

3.8 Theoretische Grundlagen der Zentrifugation

3.8.1 Allgemeine Charakterisierung und Einsatz der Zentrifugation

Die Zentrifugation ist eine der ältesten Techniken zur Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen. Sie basiert auf der Bewegung von Teilchen in einem flüssigen Medium durch Zentrifugalkräfte. Der zentrale Bestandteil einer Zentrifuge ist der Rotor, der zur Aufnahme der Probenbecher dient und durch einen Motor zu hoher Umdrehungsgeschwindigkeit angetrieben wird. Es gibt verschiedene Bauausführungen der Rotoren wie z. B. Festwinkelrotoren und Vertikal- oder Schwingbecherrotoren, die in verschiedenen Größen und Materialien erhältlich sind (Abbildung 8).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 8 : Rotoren für die Zentrifugen. Festwinkelrotor, Vertikalrotor und Ausschwingrotor bei Beladung [Lottspeich, F./Zorbas, H.; 1998]

Sie erlauben Trennungen von wenigen Mikrolitern bis zu einigen Litern und können je nach Aufgabenstellung mit verschiedenen, einstellbaren Rotationsgeschwindigkeiten betrieben werden. Für Arbeiten mit biologischen Materialien werden oft kühlbare Zentrifugen verwendet [Lottspeich, F./Zorbas, H.; 1998].

Die Zentrifugation wird meist zur Abtrennung der Biomasse von der Kulturbrühe eingesetzt. Dabei werden z. B. Tellerseparatoren, Düsenseparatoren oder Dekanter verwendet. Diese Apparate haben den Vorteil, dass sie neben der Verarbeitung großer Stoffströme auch kontinuierlich arbeiten können. Nachteilig sind die hohen Energie- und Investitionskosten.

Zentrifugen können aber auch nach dem Zellaufschluss zur Abtrennung der Zellbruchstücke von der Proteinlösung wie im Studentenpraktikum vorgesehen benutzt werden. Hierbei muss mit hohen Umdrehungsgeschwindigkeiten (³ 10000 min-1) gearbeitet werden, um sicher zu stellen, dass sich keine Zelldebris in der Proteinlösung befinden. Gegebenenfalls ist eine Filtration anzuschließen.

3.8.2 Einflussparameter bei der Zentrifugation

Das physikalische Prinzip der Zentrifugation ist eine Trennung nach Größe und Dichte. Bei der Zentrifugation wird durch Benutzung eines Zentrifugalfeldes eine Beschleunigung des Absetzvorganges um das 103-104- fache gegenüber der Sedimentation erreicht.

Die Sinkgeschwindigkeit von festen Teilchen unter dem Einfluss einer Zentrifugalbeschleunigung B

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

ergibt sich aus der Gleichung [23].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Es ist dabei die Bedeutung der beiden Parameter Dichtedifferenz zwischen Trägerflüssigkeit und abzuscheidender Partikel sowie Partikeldurchmesser zu erkennen. Je kleiner die Dichtedifferenz bzw. der Partikeldurchmesser, umso geringer ist die Sinkgeschwindigkeit und umso schwieriger wird die Abscheidung.

Eine weitere charakteristische Größe der Zentrifugation ist die Schleuderziffer Z, die das Verhältnis aus Zentrifugalbeschleunigung zu Erdbeschleunigung angibt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.9 Theoretische Grundlagen der Ionenaustauschchromatographie

3.9.1 Allgemeine Charakterisierung der Ionenaustauschchromatographie

Nach der Abtrennung der Hefezellbruchstücke von der Proteinlösung mit der Zentrifuge folgt eine Feinreinigung der Enzyme mit Hilfe einer Anionenaustauschchromatographie. Die Chromatographie-verfahren, zu denen die Ionenaustauschchromatographie zählt, gehören aus verfahrenstechnischer Sicht zu den Adsorptions- und Desorptionsverfahren und können zur Trennung von komplexen Stoffgemischen verwendet werden, da sich unterschiedliche Komponenten eines Fluid-Gemisches unterschiedlich gut an die Oberfläche von Feststoffen, den Adsorbentien, anlagern. Die Adsorptionsverfahren nutzen also nicht die unterschiedliche Löslichkeit der Komponenten in einer weiteren Flüssigkeit zur Stofftrennung, sondern die unterschiedlichen Anlagerungseigenschaften an eine feste Oberfläche. Das Prinzip der Chromatographie basiert darauf, dass Komponenten mit einer starken Affinität zur Festphase länger zurückgehalten werden als Komponenten mit einer geringen Affinität. Die Komponenten verlassen die Chromatographiesäule in einem für sie typischen Volumen, wodurch der Trenneffekt erreicht wird. Dies wird im Chromatogramm dokumentiert. Hierbei wird die optische Dichte der eluierten Komponenten als Peak gegen die Zeit oder das Elutionsvolumen aufgezeichnet. Es wird eine schlanke symmetrische Peakform im Chromatographieverfahren angestrebt (Abbildung 9).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 9 : Chromatogramm mit t0: Totzeit, tR1: Retentionszeit der Substanz 1, tR2: Retentionszeit der Substanz 2, w: Peakbreite, w1/2 : Halbwertsbreite, h: Peakhöhe [Lottspeich, F./Zorbas, H.; 1998]

Bei der Ionenaustauschchromatographie trägt die stationäre Phase (das Adsorbens) positive oder negative elektrische Ladungen an ihrer Oberfläche. Die Ladungen sind zuerst durch bewegliche Gegenionen neutralisiert. Nach der Aufgabe der Probe konkurrieren die Ionen der mobilen Phase und die ionischen Zielmoleküle um einen Platz auf dem Adsorbens. Bei der Anlagerung der Zielmoleküle werden die Gegenionen von der stationären Phase verdrängt und die Zielmoleküle bleiben an der elektrisch geladenen Gruppe, die auf einer Matrix, z.B. einem Harz oder einem Polymer (Agarose, Cellulose, Dextran) befestigt ist, hängen. Als Adsorbentien gibt es z. B. Kationenaustauscher, die negativ geladene Austauschergruppen an der Matrix besitzen und Anionenaustauscher, bei denen sich positiv geladene Austauschergruppen an der Matrix befinden [Witte, V. C.; 1999].

3.9.2 Einsatz der Ionenaustauschchromatographie

In der Biotechnologie werden oft Ionenaustauscher zur Proteinaufarbeitung eingesetzt. Hierbei nutzt man die Zwitterioneneigenschaft (Ampholytcharakter) der in den Proteinen enthaltenden Aminosäuren aus. Jedes Protein besteht aus einer für dieses Protein typischen Aminosäurensequenz. Die Aminosäuren nehmen je nach pH-Wert überwiegend den Charakter eines positiv oder negativ geladenen Ions an. Weiterhin besitzt jedes Protein einen für dieses Protein typischen isoelektrischen Punkt. Dieser ist der pH-Wert, bei dem das Protein keine Netto-Ladung trägt, somit neutral ist. Dadurch ist es möglich Proteine durch Veränderung des pH-Wertes zunächst an ein geladenes Adsorbens anzulagern und später bei geändertem pH-Wert wieder abzulösen. Nach erfolgter Anlagerung an die Matrix lassen sich die gebundenen Proteine ggf. auch durch die Ionen einer Salzlösung vom Adsorbens verdrängen.

Bei der Ionenaustauschchromatographie werden folgende Verfahrensschritte durchlaufen (Abbildung 10):

1. Equilibrieren des Säulenmaterials (der Festphase)
2. Aufgabe der Rohlösung, d. h. des Eduktes, auf die Festphase
3. Waschen des Säulenmaterials
4. Eluieren der Wertstoffe vom Säulenmaterial
5. Regenerieren des Säulenmaterials

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 10 : Prinzip der Anionenaustauschchromatographie [Fritz, U.; 1999]

Weiterhin besteht eine Feinreinigung in der Industrie nicht nur aus einem Chromatographieschritt, sondern es werden mehrere unterschiedliche Chromatographieverfahren wie zum Beispiel zusätzlich Gelfiltration oder Hydrophobe Interaktionschromatographie zur Proteinreinigung hintereinander durchgeführt. Ferner können mehrere Chromatographieschritte eines Chromatographieverfahrens aufeinander folgen. Für das Praktikum ist aus Kosten- und Zeitgründen nur eine einmalige Anionenaustauschchromatographie geplant.

4 Material und Methoden

4.1 Mikroorganismus, Chemikalien und Nährmedium

Für die Vorkultur und die Kultivierung wurde Presshefe aus dem Einzelhandel eingesetzt. Die Presshefe stammte von der Firma Lindenmeyer GmbH & Co aus Heilbronn/Neckar. Es wurde der Stamm VDH 2 verwendet. Die Presshefe wurde in Quadern zu 42 g Frischgewicht mit einem Anteil von 28 % Trockenbiomasse im Handel gekauft.

Alle verwendeten Chemikalien wurden in Analysenqualität bezogen (Chemikalien- und Verbrauchsmaterialienliste siehe Abschnitt 10.1). Zur Herstellung von Puffern und Lösungen wurden die Chemikalien in Reinstwasser gelöst. Die verwendeten Enzyme stammten von der Firma Roche Diagnostics GmbH. Die Enzyme G6P-DH und HK im Glucosetestkit besaßen eine volumenbezogene Aktivität von ³15 U/ml und ³ 8,3 U/ml. Die G6P-DH-Lösung für die Erstellung der Kalibriergeraden zur Ermittlung einer unbekannten G6P-DH-Aktivität hatte eine volumenbezogene Aktivität von 700 U/ml.

Als Chromatographieadsorbens diente der starke Anionenaustauscher Source 30 Q der Firma Pharmacia Biotech. Dieser besteht aus monodispersen Polystyren/Divinylbenzenkugeln mit einem Durchmesser von 30 µm, auf denen N(CH3)3+-Ionen vorhanden sind.

Als Nährmedium für die Vorkulturen und die Kultivierung des Mikroorganismus wurde ein Komplexmedium, dessen Zusammensetzung einem Praktikum im Studiengang Umweltbio-verfahrenstechnik der Fachhochschule Jena entnommen wurde [Kühn, K.; 2001], verwendet. Es enthielt folgende Bestandteile in den angegebenen Konzentrationen:

D-Glucose : 30,0 g/l

Pepton : 3,5 g/l

Hefeextrakt : 3,0 g/l

KH2PO4 : 2,0 g/l

(NH4)2SO4 : 1,0 g/l

MgSO4 * 7 H2O : 1,0 g/l

Als Kohlenstoffquelle wurde Glucose gewählt. Da Bäckerhefe Stickstoff enthält, musste der Nährlösung dieses Hauptelement bei der Kultivierung in Form von Ammoniumsulfat zugefügt werden. Darüber hinaus benötigt Hefe noch Phosphor und die Nebenelemente Kalium und Magnesium. Auch Spurenelemente in geringen Mengen sind notwendig. Diese mussten nicht extra hinzugefügt werden, sondern waren im Trinkwasser, mit dem das Nährmedium angesetzt wurde, bereits vorhanden.

Neben den Makro-und Mikroelementen braucht S. cerevisiae als Wachstumsfaktoren Biotin (Vitamin H), Inositol und Pantothensäure, die sich im Komplexmedium im Pepton und im Hefeextrakt befanden [Dellweg, H.; 1987].

4.2 Materialien und Methode bei der Vorkultivierung und Kultivierung von S. cerevisiae

Zur Kultivierung von S. cerevisiae wurde ein Bioreaktor mit Doppelmantel des Typs Z61103CT04 der Firma Applikon verwendet (Abbildung 11 und 12). Der Fermenter besteht aus Borosilikatglas und besitzt ein maximales Füllvolumen von 3,2 l. Das Arbeitsvolumen beträgt 2 Liter. Zu diesem Bioreaktor gehört die Mess-, Steuer- und Regeleinheit Bio Controller ADI 1030 und die Bio Console ADI 1035 der gleichen Firma. Der Bioreaktor setzt sich aus folgenden Einzelteilen zusammen:

- Kopfplatte und Anbauten aus rostfreiem Edelstahl SS 316
- Abluftkühler (an der Kopfplatte montierbar)
- Septum zur Antischaummittelzugabe
- Dreierstutzen für Säure-, Lauge- und Substratzufuhr
- Ernterohr für den Abfluss im kontinuierlichen Betrieb
- Begasungsrohr zur Belüftung
- Probenahmefläschchen (Fassungsvermögen: 30 ml)
- Rührwelle des Bioreaktors (oberhalb des Deckels von einem Elektromotor angetrieben)
- Rührwerk (zwei 6-Blatt-Rührer mit einem Durchmesser von 4,5 cm, die in einem Abstand von 2*dR = 9 cm zu montieren sind [Höra, W.; 1999])
- Glasmantel mit einem Mantelvolumen von 1,3 Litern zur Temperierung

Weiterhin können eine pH-Sonde und eine Sauerstoffsonde (Clark-Elektrode) am Bioreaktor befestigt sowie ein Pt-100 Temperaturfühler in eine Tasche der Kopfplatte eingeführt werden.

An die Bioconsole können 4 Schlauchpumpen geschraubt werden (für den Satz-Prozess zur Zufuhr von Lauge und Säure wurden die Pumpen P1 und P2 und für den Zulauf von Nährlösung im kontinuierlichen Betrieb zusätzlich Pumpe P4 eingesetzt). Im oberen linken Teil der Console befinden sich 2 Schwebekörperdurchflußmessgerätmesser, die bei Begasung an eine Luft- oder Sauerstoffversorgung angeschlossen werden. Mit ihnen kann der Volumenstrom von Luft und reinem Sauerstoff bestimmt werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 11 : Bioreaktor des Typs Z61103CT04 der Firma Applikon mit Bio Console und Bio Controller während einer kontinuierlichen Kultivierung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 12 : Verfahrensfließbild der Kultivierung im kontinuierlichen Betrieb

Zuerst wurden für die Kulivierungen zwei Vorkulturen angesetzt. Dazu wurden zwei 250 ml Erlenmeyerkolben, in denen sich jeweils 100 ml Nährlösung nach dem Rezept von Abschnitt 4.1 befanden mit 5,7 g Presshefe steril unter der Sicherheitswerkbank HS 12 der Firma Heraeus Instruments beimpft. Für die Satz-Kultivierungen mit impulsweiser Zufütterung und die kontinuierlichen Zellkulturen wurde eine Glucosekonzentration von 50 g/l gewählt. Die Erlenmeyerkolben wurden vor der Beimpfung bei 121°C und 180 kPa Dampfdruck 20 min im Autoklaven 2540 ELV der Firma Systec Gmbh Labor- Systemtechnik autoklaviert. Die Menge an Inokulum betrug 10 % des gesamten Arbeitsvolumens (2 Liter) im Kultivierungsgefäß. Nach der Beimpfung der Nährlösungen, wurden die Erlenmeyerkolben in den Schüttelinkubator 3033 der Gesellschaft für Labortechnik mbH (GFL) gestellt und bei 30 °C und 150 min-1 zwölf bis dreizehn Stunden geschüttelt. Die Vorkultivierung der zweiten Satz-Kultivierung (Satz-2) dauerte 6 Stunden.

Für die Satz-Kultivierungen wurden 1,8 l Nährlösung (für die Satz-Kultivierungen mit impulsweiser Zufütterung und für die kontinuierlichen Kultivierungen: 1,9 l) nach dem Rezept von Abschnitt 4.1 angesetzt und in den fertig montierten Bioreaktor gegossen. Dann wurde eine Zweipunktkalibrierung der pH-Sonde (siehe Anhang) durchgeführt. Weiterhin wurde ein Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,2 µm auf der Begasungsöffnung befestigt. Nach der Vorbereitung des Bioreaktors zur Autoklavierung, wurde der Fermenter mit der Kühlschlange des Abluftkühlers zweimal im Autoklaven bei 121°C und 180 kPa Dampfdruck, 20 min lang autoklaviert.

Am nächsten Tag erfolgte die Kalibrierung der pO2-Sonde (siehe Anhang). Während des Entgasens und Begasens des Bioreaktors konnten die Trockenbiomassekonzentrationen und die Glucose-konzentrationen der Vorkulturen bestimmt werden. Anschließend wurden die Temperierschläuche abgeklemmt und der Fermenter unter der Sicherheitswerkbank beimpft. Weiterhin wurden hierbei die Kühlschlange des Abluftkühlers eingebaut und der Pileusball zur Probenahme befestigt. Danach wurde der Bioreaktor auf der Arbeitsfläche zur Kultivierung gerüstet. Nach dem Anschluss des externen Schwebekörperdurchflussmessgerätemessers an den Fermenter, wurde mit Luft begast. Zur pH-Regelung wurden 0,1 M H2SO4 und 1 M KOH verwendet. Als Antischaummittel wurde Sonnenblumenöl zudosiert. Die Substratzulaufnährlösung wurde bei der ersten Satz-Kultivierung mit impulsweiser Zufütterung durch die Filtrationseinheit FP-050 der Firma Schleicher und Schuell mit einem Membranfilter der Porengröße 0,2 µm der Firma Sartorius zugeführt. Bei der weiteren Satz-Kultivierung mit impulsweiser Zufütterung und bei der Zulauf-Satz-Kultivierung mit anschließender kontinuierlicher Prozessführung sowie bei der kontinuierlichen Kultivierung wurden die Zulauflösungen bei 121 °C und 180 kPa 20 min autoklaviert.

Kurz nach Beimpfung des Bioreaktors wurde die Anfangstrockenbiomassekonzentration und die Anfangsglucosekonzentration bestimmt. Schließlich wurden in Abständen von 30 min die Trockenbiomasse- und Glucosekonzentrationen gemessen. Die Glucosekonzentrationen der Kulturbrühe der zweiten Satz-Kultivierung wurden in Abständen von einer Stunde mit einem selbst hergestellten Glucosetest ermittelt. Weiterhin wurden bei der zweiten Satz-Kultivierung und der zweiten Satz-Kultivierung mit impulsweiser Zufütterung der Ethanolgehalt der Lösung stündlich bestimmt. Die volumenbezogenen Enzymaktivitäten von G6P-DH wurden bei den Satz-Kultivierungen mit impulsweiser Zufütterung, der Zulauf-Satz-Kultivierung mit anschließender kontinuierlicher Prozessführung und der kontinuierlichen Kultivierung in Abständen von 30 min ermittelt.

Nach der Beimpfung des Bioreaktors mit den Vorkulturen wurden der pH- und der Temperatursollwert sowie die Drehzahl eingestellt. Für den pH-Wert der ersten drei Zellkulturen wurde 4,8, für den pH-Wert der letzten drei Kultivierungen 4,7 gewählt (Muttzall, K.; 1993: pH = 4,1; Bellgardt, K.-H.; 1984: pH = 5).

Für die Temperatur wurden bei allen Kultivierungen 30 °C als zugehöriger Wert der Regelgröße gewählt (Muttzall, K.; 1993: T = 32,5 °C; Bellgardt, K.H.; 1984: T = 30 ° C).

Die Drehzahl wurde zu Beginn der gesamten Zellkulturen auf 700 min-1 eingestellt. Sie wurde bei der ersten Kultivierung konstant gehalten. S.cerevisiae ist relativ scherunempfindlich. Bei einer Drehzahl von 700 min-1 ist noch keine Zerstörung der Zellen zu erwarten [Höra, W.; 1999].

Der pO2-Wert sollte so hoch wie möglich sein. Es wurde bei allen Zellkulturen darauf geachtet ihn zwischen 50 % und 80 % zu halten. Er wurde manuell an einem Belüftungsventil eingestellt (Tabelle 2).

Tabelle 2 : Kultivierungsbedingungen aller durchgeführten Zellkultivierungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Messgrößen pH und Temperatur wurden von der Kontrolleinheit des Fermenters geregelt. Die Werte für pH, Temperatur und pO2 wurden während der ersten Satz-Kultivierung in Abständen von 15-90 min notiert. Bei den weiteren Kultivierungen wurden diese Messgrößen online von einem Rechner im Abstand von 60 Sekunden aufgenommen und von diesem gespeichert. Der Lauge- und Säureverbrauch wurde während der Kultivierungen in Abständen von 15-90 min mit einer Waage bestimmt.

Außerdem wurden jeweils zwei Ausstriche kurz nach Beginn der Zellkultur und zwei Ausstriche am Ende des Bioprozesses auf Nährlösung mit Agar-Agar als Sterilitätstest durchgeführt. Die Zusammensetzung der Nährlösung entsprach dem Kulturmedium plus 15 g/l Agar-Agar. Es erfolgte eine Inkubation der beimpften Platten 3-5 Tage im Trockenschrank bei 30 °C.

Nach dem Ende der Kultivierung wurde die Kulturbrühe geerntet und bei +4 °C im Kühlschrank in Flaschen gelagert, damit sich die Hefezellen auf dem Boden des Gefäßes absetzen konnten. Vor der anschließenden Filtration wurde ein Teil des Überstandes abgegossen und der andere Teil zu einer homogenen Suspension aufgeschüttelt.

4.3 Materialien und Methode bei der Überdruckfiltration

Zur Abtrennung der Feuchtbiomasse von der Kulturbrühe wurde die Überdruckfiltrationsanlage BM0299-1A der Firma Schleicher und Schuell verwendet. Sie besteht aus einer Filtrationseinheit mit einem Füllvolumen von 2 Litern und einer Membranvakuumpumpe, die über einen Druckschlauch miteinander verbunden sind (Abbildung 13).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 13 : Filtrationsanlage BM0299-1A der Firma Schleicher und Schuell mit Vakuum-Druckpumpe und Filtrat

Für die Filtration standen Papierfilter und Membranfilter zur Verfügung. Die Papierfilter bestanden aus Zuschnitten (148´210 cm) mit einer undefinierten Porengröße von 4-7 µm der Firma Schleicher und Schuell.

Weiterhin waren 5 verschiedene Membranfilter aus unterschiedlichen Materialien mit verschiedenen Porengrößen zum Vergleich vorhanden (Tabelle 3).

Tabelle 3 : Charakterisierung 5 unterschiedlicher Membranfilter

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach der Montage der Filtrationseinheit, wurde die Membranvakuumpumpe eingeschaltet und am Manometer der notwendige Überdruck eingestellt. Mit einem 600 ml Glasbecher wurde das Filtrat aufgefangen. Nachdem kein Filtrat mehr ablief, wurde die Filtrationseinheit demontiert. Daraufhin wurde der Filterkuchen mit einem Löffel vom Membranfilter in einen Mahlbecher der Kugelmühle geschabt. Danach wurde die Filtrationseinheit wieder zusammengebaut und der Vorgang wiederholt.

4.4 Materialien und Methode beim Zellaufschluss mit der Kugelmühle

Zum Aufschluss der Hefezellen wurde die Labor-Planeten-Mühle „pulverisette 5“ der Firma Fritsch eingesetzt. Die Kugelmühle besteht aus einer Trägerscheibe, auf der 4 Mahlbecher frei beweglich um die eigene Achse befestigt sind. Die Mahlbecher bestehen aus Achat und haben ein Füllvolumen von 500 ml. Die Mahlkugeln haben einen Durchmesser von 20 mm und sind ebenfalls aus Achat (Abbildung 14).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 14 : geöffnete Kugelmühle „pulverisette 5“ der Firma Fritsch mit zwei eingespannten Mahlbechern

Nach dem Umfüllen des Filterkuchens aus der Filtrationseinheit in den Mahlbecher der Kugelmühle, wurde Spielsand dazugegeben. Dieser wurde vorher gewaschen, 24 Stunden bei 105 °C nach DIN ISO 14461 getrocknet, 45 Minuten im Exsikkator abgekühlt und abschließend für einige Versuche mit Analysesieben unterschiedlicher Siebweiten der Firma Fritsch gesiebt. Dann wurden Hefe und Sand miteinander vermischt und NaH2PO4-Pufferlösung (Puffer A) dazugegossen. Ferner wurden die Mahlkugeln in den Mahlbehälter gegeben und dieser mit Inhalt und Deckel gewogen und in die Kugelmühle eingesetzt. Zur Vermeidung einer Unwucht wurde in einen gegenüberliegenden Mahlbecher Wasser gefüllt, so dass sich die gleiche Masse wie bei dem Mahlbehälter mit Hefe ergab. Die Kugelmühle wurde geschlossen und nach der Eingabe der entsprechenden Parameter über die Folientastatur gestartet. Nach dem Mahlvorgang wurde die Kugelmühle geöffnet und der Mahlbecher mit Hefe herausgenommen. Daraufhin wurde die Aufschlusssuspension mit Puffer A verdünnt, gemischt und schließlich weiter verarbeitet.

Zur Optimierung der Kugelmühle wurde ein 2n-Faktorenversuchsplan aufgestellt, bei dem die Einflussfaktoren Mahldauer, Drehzahl und Anzahl der Mahlkörper (Mahlkörperfüllgrad) bezüglich der Zielgröße volumenbezogene Enzymaktivität von G6P-DH optimiert wurden.

Einflussfaktoren für den Zellaufschluss mit der Kugelmühle:

a) Mahldauer t [min]
b) Drehzahl n [min-1]
c) Anzahl der Mahlkugeln m [-]

(Mahlkörperfüllgrad]

Zielgröße: volumenbezogene Enzymaktivität von G6P-DH [U/ml]

Für einen 2n-Faktorenversuchsplan werden bei 3 Einflussfaktoren plus Mittelwert 9 Versuche durchgeführt. Da die Versuche in Doppelbestimmung ausgeführt wurden, mussten 18 Versuche unternommen werden. Das diesbezügliche Versuchsschema ist in der unteren Tabelle zu sehen.

Tabelle 4 : Versuchsschema des 2n –Faktorenversuchsplanes

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Weiterhin sollte ein lineares Modell mit den einzelnen Effekten aufgestellt werden:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Gesucht waren hierbei a0-a7.

4.5 Materialien und Methode bei der Zentrifugation

Zur Abtrennung des Sandes und der Zellbruchstücke von der Proteinlösung wurde die Laborzentrifuge Biofuge 28 RS der Firma Heraeus Sepatech verwendet. Die Zentrifuge enthält den Festwinkelrotor HFA 14,94, der eine maximale Umdrehungsgeschwindigkeit von 14500 min-1 erreicht und 6 Kunststoffbehälter aufnehmen kann. Jeder Becher hat ein Füllvolumen von 75 ml (Abbildung 15).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 15: Zentrifuge Biofuge RS 28 der Firma Heraeus Sepatech im geöffneten Zustand

Nach der Desintegration der Hefezellen wurde die mit Pufferlösung A verdünnte Aufschlusssuspension aus dem Mahlbehälter in zwei Zentrifugenbecher gefüllt. Die Öffnungen der Becher wurden jeweils mit Parafilm verschlossen, damit während der Zentrifugation keine Suspension aus den Behältern treten konnte. Es musste darauf geachtet werden, dass beide Becher mit Inhalt und Parafilm gleich schwer waren, um eine Unwucht in der Zentrifuge zu vermeiden. Dann wurden die Behälter gegenüberliegend in den Rotor eingesetzt, der Deckel des Rotors und der Zentrifuge geschlossen und diese gestartet. Nach der Zentrifugation wurde die Proteinlösung von den festen Bestandteilen in einen Messzylinder abgegossen.

4.6 Materialien und Methode bei der Anionenaustauschchromatographie

Zur Feinreinigung der Enzyme wurde eine Niederdruckchromatographie der Firma Pharmacia Biotech benutzt (Abbildung 17). Als Chromatographieprinzip wurde eine Anionenaustauschchromatographie gewählt. Die Anlage besteht aus der Säule XK 16/20 (innerer Durchmesser: 16 mm, äußerer Durchmesser: 30 mm, Länge: 20 cm), dem Fraktionssammler mit integrierter Steuereinheit GradiFracTM 50, der Pumpe HiLoad Pump P-50, der Steuereinheit UV 1 und der Detektionseinheit Monitor UV 1, die mit UV-Licht einer Wellenlänge von 280 nm arbeitet [Fritz, U.; 1999]. Zur Chromatographieanlage zählen weiterhin ein 6 ml Mixer, der den Elutionsgradienten mischt und der Schreiber REC 102, der das Chromatogramm und den Elutionsgradienten aufzeichnet. Die Strömungsrichtung und damit der Betriebsmodus erfolgt über 3-und 4-Wege-Ventile (V1 bis V4: siehe Abbildung 16).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 16 : Schematische Darstellung der Chromatographieanlage mit dem GradiFracTM 50 System und der XK 16/20 Säule sowie dem durch Pfeile gekennzeichneten Suspensionstrom [Fritz, U.; 1999]

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Abbildung 17 : Chromatographieanlage der Firma Pharmacia Biotech mit Säule XK 16/20, Pumpe HiLoad-Pump P50, Gradi-FracTM 50, Steuereinheit UV 1, Detektionseinheit UV 1, Mixer und Schreiber REC 102

Für den Chromatographievorgang wurden folgende Puffer verwendet:

1. Equilibrierungs- und Waschpuffer (Pufferlösung A): : 1 Liter 50 mM NaH2PO4, pH = 6,0
2. Elutionspuffer (Pufferlösung B) : 200 ml 1 M NaCl
3. Lösung für Cleaning in Place (CIP) : 200 ml 1 M NaOH
4. Lösung zur Lagerung der Säule : Ethanol, 20 Vol-%

Zu Beginn des Chromatographieprozesses wurde die Säule mit 200 ml Puffer A equilibriert. Dann wurde die Probe (14-20 ml) aufgetragen. Der weitere Chromatographieprozess bestand aus einem Waschvorgang mit 100 ml Puffer A. Danach wurde die Säule je nach Versuch mit unterschiedlichen Volumina an Puffer B (140-200 ml) eluiert. Das Eluat wurde zu 10 ml Fraktionen in den Reagenzgläsern aufgefangen. Der vorletzte Schritt war eine Reinigung der Schläuche und der Säule mit 100 ml NaOH-Lösung. Zum Schluss wurden diese in 20 prozentiger Ethanollösung eingelagert. Hierzu wurden 100 ml verdünnter C2H5OH-Lösung verwendet.

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