Alkaloide aus dem Aphrodisiakum Catuaba

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung und Problemstellung

2. Drogenmaterial und Methoden
2.1 Drogenmaterial
2.2 Methoden
2.2.1 Dünnschichtchromatographie
2.2.2 Säulenchromatographie
2.2.3 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
2.2.4 Massenspektrometrie
2.2.5 Kernresonanzspektroskopie
2.2.6 Infrarotspektroskopie

3. Isolierung der Alkaloide aus dem Produkt ´Catuaba`
3.1 Darstellung der Arbeitsschritte
3.2 Auftrennung der Alkaloidfraktion mittels Säulenchromatographie
3.3 Dünnschichtchromatographische Überprüfung der Säulenfraktionen
3.4 Reinigung und Isolierung der zwei Hauptalkaloide mittels HPLC

4. Strukturaufklärung der zwei Hauptalkaloide Alkaloid 1 (WS 2) und Alkaloid 2 (WS 1)
4.1 Massenspektrometrie und Infrarotspektroskopie
4.2 NMR-Spektroskopie

5. Dünnschichtchromatographische Überprüfung verschiedener Catuaba Handelsmuster

6. Zusammenfassung

7. Literaturverzeichnis

1. Einleitung und Problemstellung

Catuaba ist das Pseudonym für eine brasilianische Rindendroge mit langer Tradition in der südamerikanischen Ethnomedizin.

Erst in den letzten Jahren tauchte diese Droge auch vermehrt im europäischen Raum auf – einerseits durch das Boomen der Ethnomedizin, andererseits durch Wirkungsbeschreibungen, die dieser Droge potenzsteigernde und aphrodisierende Wirkung zuschreiben. Im Internet findet man unzählige Firmen, die diese aphrodisierende Droge in Tee- oder Kapselform anbieten, ohne detaillierte Informationen über die Herkunft und Stammpflanze zu besitzen.

Bisherige Recherchen im Rahmen von Diplomarbeiten [1,2,4] lassen vermuten, daß unter dem Namen ´Catuaba` nicht nur eine Stammpflanze zu verstehen ist, sondern daß damit verschiedene Pflanzen sogar aus unterschiedlichen Familien gemeint sind. Marques [3] nennt in seiner Arbeit beispielsweise folgende Pflanzen, die unter dem Namen `Catuaba´ in Brasilien verwendet werden: Anemopaegma arvense (Bignoniaceae ), Erythroxylum catuaba (Erythroxylaceae ), Erythroxylum vacciniifolium (Erythroxylaceae) , Phyllanthus nobilis (Euphorbiaceae ), Pouteria subgenus Micropholis sp. (Sapotaceae) , Secundatia floribunda (Apocynaceae ), Tetragastria catuaba (Buseraceae) , Tommadenia violaceae (Apocynaceae) , Trichilia sp. (Meliaceae) . Dementsprechend fehlen auch hinsichtlich der Isolierung gezielte Hinweise auf einzelne Stoffgruppen, die ein Fokussieren auf bestimmte Inhaltsstoffe er möglichen. Im Rahmen dreier vorangegangener Diplomarbeiten [1,2,4] konnten ätherisches Öl, Gerbstoffe vom Catechintyp (10%), die freien Monosaccharide Glucose, Fructose, Galaktose und Arabinose, sowie das Disaccharid Saccharose, Chlorogensäure, Kaffeesäure und Alkaloide detektiert werden. Außerdem enthält die Droge intensiv färbende rotbraune Inhaltsstoffe unbekannter Struktur. Diese Stoffe scheinen nicht stabil zu sein, da es beim Stehenlassen der Droge in Lösung (gekühlt und ungekühlt) zu einer Farbvertiefung kommt.

Basische Stickstoffverbindungen wie Betain, ß-Alanin, Cholin und andere konnten dünnschichtchromatographisch ausgeschlossen werden, da sie um vieles polarer als die isolierten Verbindungen waren.

Die Alkaloide wurden nach dünnschichtchromatographischen Auftrennungs-methoden unter Verwendung von Dragendorff- Reagenz nachgewiesen.

Die Aufgabestellung folgender Diplomarbeit bestand darin, die Alkaloidfraktion aufzutrennen und die gereinigten Einzelkomponenten mit Hilfe der NMR und GC-MS strukturell aufzuklären. Außerdem sollte der Extraktionsweg der Alkaloide in Hinblick auf die Optimierung der Ausbeute nochmals überprüft werden. Der Grund für das Interesse an den Alkaloiden liegt einerseits in einem möglichen pharmakologischen Effekt dieser Stoffe, andererseits in der relativ leichten Greifbarkeit.

Zusätzlich sollte die dünnschichtchromatographische Überprüfung verschiedener am Markt befindlicher Catuaba Spezialitäten bezüglich ihrer Alkaloid- muster erfolgen. Diese Handelsmuster wurden via Internet und Großhändler bestellt. Die Proben sollten parallel dazu von botanischer Seite am Institut für Pharmakognosie der Universität Wien mikroskopisch untersucht und verglichen werden.

2. Drogenmaterial und Methoden

Im folgenden Kapitel sind genaue Angaben zum Drogenmaterial, sowie zu den im Laufe der Isolierungsarbeiten verwendeten Methoden (DC, SC, HPLC, GC-MS, NMR) angeführt.

2.1 Drogenmaterial

Für die Isolierungsarbeiten verwendeten wir die als Anemopaegma mirandum deklarierten Chargen der Spezialität ´Catuaba Casca` aus Curitiba, Brasilien (Tabelle 1), da uns hier die größte Menge an Totodroge zur Verfügung stand. Die Deklaration dieser Droge als Anemopaegma mirandum hält den bisherigen Ergebnissen zufolge nicht Stand, da ein mikroskopischer Vergleich nicht mit den botanischen Beschreibungen von Anemopaegma [5] übereinstimmt. Durch Knüpfen von Kontakten nach Brasilien konnte ein Stück Rinde, die als Trichilia catigua im botanischen Institut Sao Paolo bestimmt wurde, erworben werden. Dieses Rindenstück weist ähnliche Merkmale wie die untersuchte Droge auf, möglicherweise handelt es sich bei unserer Droge um eine Pflanze der Gattung Trichila (Meliaceae), die auch von Marques [3] als eine der unter Catuaba laufenden Stammpflanzen angeführt wird. Da mikroskopische Untersuchungen von Rinden und das Zuordnen zu Pflanzenfamilien durch das Fehlen von charakteristischen Merkmalen oft schwierig sind, kann man aber noch keine eindeutige Aussage darüber treffen. Es ist nicht leicht, Vergleichsmaterial aus Brasilien zu bekommen, weil sich die Firmen weigern, ihre Sammelplätze bekanntzugeben.

Tabelle 1: Handelsmuster von ´Catuaba` bezogen aus Brasilien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 Chromatographische und spektroskopische Methoden

In diesem Kapitel sind die Methoden zusammengestellt, die während der vor liegenden Arbeit zum Einsatz kamen. Es sind dies einerseits chromato graphische Methoden wie Dünnschichtchromatographie zur Überprüfung der Fraktionen sowie zum Nachweis der Alkaloide, Säulenchromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zur Fraktionierung der Extrakte, andererseits spektroskopische Methoden zur Strukturaufklärung (Massenspektrometrie und Kernresonanzspektroskopie).

2.2.1 Dünnschichtchromatographie (DC)

Für die vorliegende Arbeit wurden mehrere verschiedene dünnschicht chromatographische Systeme getestet, wobei das Fließmittel Toluol-Aceton-Methanol-konz.Ammoniak (45+45+7+3) am geeignetsten war (Abbildung 4). Als stationäre Phase wurden Kieselgelfertigplatten verwendet. Zur Detektion wurde einerseits die Löschung unter UV-Licht bei 254nm überprüft, andererseits wurden die Platten mit Dragendorff-Reagenz und 6 N Ameisensäure besprüht. Dragendorff-Reagenz färbt Alkaloide orange an, was sich durch die 6 N Ameisensäure noch intensivieren läßt, da das Dragendorff-Reagenz nur im sauren Milieu seine charakteristische Färbung zeigt und die 6 N Ameisensäure die restlichen Ammoniakrückstände auf der Platte neutralisiert.

Als weiteres Reagenz wurde manchmal auch Anisaldehydreagenz eingesetzt, der genauere Verwendungszweck wird bei den betreffenden Dünnschicht- chromatogrammen angegeben. Obwohl uns schon ein geeignetes Fließmittelgemisch aus vorhergegangenen Diplomarbeiten [2] Toluol-Aceton-Methanol-konz.Ammoniak (45+45+7+3) vorlag, probierten wir noch andere mobile Phasen aus, um die Auftrennung noch zu verbessern. Das Weglassen der Ammoniakkomponente führte aber immer zu Chromatogrammen mit starkem Tailing und manche Fraktionen wanderten überhaupt nicht.

Der konzentrierte Ammoniak ist also für eine gute dünnschicht-chromatographische Auftrennung und auch für die Säulenchromatographie essentiell (Abbildung 4).

Als Vergleich dienten wahlweise die Alkaloide Emetin, Brucin, Chinin und Coffein.

Die allgemeinen Parameter zur Dünnschichtchromatographie sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2: Allgemeine Parameter für die Dünnschichtchromatographie

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.2 Säulenchromatographie

Die Auftrennung der Substanzgemische erfolgte an mehreren Kieselgelsäulen unterschiedlicher Größe. Um einer möglichen Zersetzung der Substanzen entgegenzuwirken, wurden die Säulen lichtgeschützt und kühl verwahrt. Die gesammelten Fraktionen wurden zur Trockene gebracht und kühl gelagert. Als stationäre Phase wurde Kieselgel 60 verwendet, welches zuvor in Dichlormethan aufgeschlämmt wurde. Auch bei der Säulenchromatographie war ein Zusatz von konz. Ammoniak notwendig, um zu einer vernünftigen Auftrennung zu kommen. Als Fließmittel kamen Gemische von Dichlomethan, Methanol und konz. Ammoniak zum Einsatz, wobei steigende Anteile an Methanol die Polarität erhöhten. Die genauen Parameter für die Säulensysteme sind bei den betreffenden Arbeitsschritten zusammengestellt.

2.2.3 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die Auftrennung der durch Säulenchromatographie vorgereinigten Fraktionen erfolgte mittels HPLC im analytischen Maßstab. Diese Methode ist schonend und erlaubt das Arbeiten im unteren Milligrammbereich. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendete Gerätekonfiguration ist in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3: Gerätekonfiguration für die HPLC

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.4 Massenspektrometrie

Für die Messungen standen uns zwei Methoden zur Verfügung. Die Analysen wurden mit Hilfe der Elektronenstoßionisation (EI) und der chemischen Ionisation (CI) vorgenommen. Die Bedingungen für die Massenspektrometrie sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4: Bedingungen für die Massenspektrometrie

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.5 Kernresonanzspektroskopie (NMR)

Die NMR-Untersuchungen wurden an einem Varian 400 MHz-Gerät mit Aceton als Lösungsmittel und TMS als internem Standard am Institut für pharma- zeutische Chemie der Universität Graz durchgeführt.

2.2.6 Infrarotspektroskopie (IR)

Die Proben wurden mit diffuser Reflexion vermessen. Dafür wurde zuerst ein Substanzträger aus KBr wie folgt hergestellt: KBr für IR (Merck) wurde in einer Kugelmühle sehr fein gemahlen und in eine sogenannte Micro Sample Cup eingefüllt und danach in den Trockenschrank (40°C) gestellt. Nach der Messung eines Leerwertes (background) wurde die zu vermessende Substanz in so viel Dichlormethan in Lösung gebracht, daß 2µl Lösung ungefähr 5-10µg der Verbindung auf das KBr Pulver in der Micro Sample Cup aufgetragen werden konnten. Das Spektrum wird vom Computer durch Abzug des Untergrundes berechnet. Die Gerätedaten sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5: Gerätedaten für die IR-Spektroskopie

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3. Isolierung der Alkaloide aus dem Produkt ´Catuaba`

Für die Isolierung der Alkaloide standen uns vorgereinigte Fraktionen aus einer vorangegangenen Diplomarbeit [2] zur Verfügung. Es sollte zunächst das dünnschichtchromatographische System verbessert werden und anschließend die Auftrennung der Alkaloidgemische erfolgen.

Abbildung 1: Dünnschichtchromatogramm des Drogenextraktes mit Fließmittel

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Auf dem Chromatogramm (Abbildung 1) ist erkennbar, daß mehrere Substanzzonen der Bahn 1 (Droge) mit den Rf - Werten 0,23; 0,25; und 0,43; 0,45 überlappen. Um polare und apolare Anteile zu trennen wurde eine Säulenchromatographie durchgeführt. Dazu verwendeten wir zunächst eine Pasteurpipette, die mit Watte und 1g Kieselgel gefüllt war. Das Kieselgel wurde vorher mit dem Fließmittel aufgeschlämmt.

Wir entschieden uns, ausgehend von einem Mischungsverhältnis Dichlormethan-Methanol (99+1) die Polarität der mobilen Phase für die Säulen chromatographie langsam durch schrittweise Erhöhung des Methanol-Anteils zu steigern.

Tabelle 6: Säulenchromatographievorversuch mit kleiner Menge von Alkaloidfraktion 1 (Tabelle 7)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Auf diese Art konnte eine bessere Auftrennung der überlappenden Substanzzonen (Rf = 0,23; 0,25; und 0,43; 0,45) erreicht werden, und wir entschieden uns, diesen Vorversuch in den semipräparativen Maßstab zu übertragen (Kapitel 3.2).

3.1 Darstellung der Arbeitsschritte

Die aus der Arbeit von M. Kaniak [2] zur Verfügung stehenden Fraktionen wurden wie folgt, aus der Droge isoliert: Etwa 50 g pulverisierte Droge wurden mit 20 % Natronlauge befeuchtet und 1 Stunde am Wasserbad in einer zu-gedeckten Kristallisierschale bei 35°C erhitzt. Dann wurde die rotbraune Masse mit etwas Chloroform in einen Rundkolben gespült und mit insgesamt 250 ml Chloroform 5 Minuten geschüttelt. Weiters filtrierten wir in einen Rundkolben, wobei eine tief rotbraune Flüssigkeit resultierte. Diese Chloroformphase wurde 5 mal mit jeweils 250 ml 2N Salzsäure ausgeschüttelt und die 5 Fraktionen durch ein Faltenfilter filtriert, wobei sofort ein Farbumschlag nach gelb erfolgte. Danach wurde mit konzentriertem Ammoniak alkalisiert und ein pH Wert von 8 eingestellt, wobei die Farbe von gelb nach orange überging (es waren etwa 160 ml konz. Ammoniak für 1250 ml nötig). Die ver einigten wäßrigen Phasen wurden 6 mal mit insgesamt 1400 ml Chloroform ausgeschüttelt, getrennt gesammelt und zur Trockene eingeengt. Aus den 6 Ausschüttelungen resultierten die Extrakte 1 bis 6. Die Extrakte 1 und 2 , 3 und 4, sowie 5 und 6 wurden vereinigt, worauf drei Alkaloidfraktionen (Tabelle 7) übrigblieben.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Alkaloidisolierung der Proben

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Diese drei Alkaloidfraktionen bildeten schmutzig weiße Kristalle mit charakteristischem, intensivem Geruch. Im Hinblick auf die Optimierung der Ausbeute wurde die bereits auf die eben beschriebene Weise extrahierte Droge nochmals nach folgender Art extrahiert: Der Rückstand der ersten Behandlung wurde mit konzentrierter Natronlauge befeuchtet und mit 250 ml Chloroform unter Rückfluß auf 100 °C erhitzt. Es wurde durch einen Faltenfilter filtriert, wobei eine weinrote Flüssigkeit resultierte. Dann wurde 5 mal mit 250 ml 2N Salzsäure ausgeschüttelt, was eine Farbänderung nach schmutzig gelb bewirkte. Es wurde mit konzentriertem Ammoniak auf pH 9 alkalisiert und 4 mal mit ins gesamt 1400 ml Chloroform ausgeschüttelt. Darauf wurde die Chloroformphase zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wog 21 mg und zeigte ein gelbes Öl (Tabelle 8). Zur Überprüfung wurden 10 µl der wärmebehandelten Droge auf eine DC Platte aufgetragen, um festzustellen ob sich noch Alkaloide darin befanden. Aus der Abbildung 3 kann man eindeutig erkennen, daß sich noch geringe Mengen an Alkaloiden darin befanden.

Abbildung 3: Dünnschichtchromatographische Überprüfung der wärme-behandelten Droge

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Da schon bei der vorhergegangen Diplomarbeit ein Teil der 44 mg schweren Alkaloidfraktion aus Tabelle 7 verbraucht wurden, und wir noch 15 mg als Vergleich aufbewahrten, kamen im Endeffekt 30 mg zur Weiterverarbeitung, die mittels Säulenchromatographie getrennt wurden (siehe Kapitel 3.2).

3.2 Auftrennung der vereinigten Alkaloidfraktionen 1,2,3 mittels Säulen- chromatographie

Aus den dünnschichtchromatographischen Vorversuchen (Abbildung 4) zeigte sich eine zufriedenstellende Trennung der Alkaloide bei Verwendung eines Mehrkomponentenfließmittels bestehend aus Dichlormethan, Methanol und konz. Ammoniak.

Abbildung 4: Gegenüberstellung verschiedener Fließmittelsysteme für die Dünnschichtchromatographie

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In Abbildung 4 kann man erkennen, daß Aceton zu wenig polar ist und die orange gefärbten Alkaloide am Start bleiben. Das Dichlormethan-Methanol Gemisch zeigt zwar, daß die Alkaloide wandern, doch die Zonierung ist nicht optimal. Das Toluol-Aceton-Methanol-konz.Ammoniak Fließmittelgemisch hingegen zeigt eine vernünftige Auftrennung der Alkaloide mit scharfer Zonierung.

Dieses Fließmittel verwendeten wir stets für die Überprüfung entsprechender Fraktionen. Für die Säulenchromatographie jedoch kam diese Zusammen-setzung vor allem wegen der schweren Flüchtigkeit von Toluol nicht in Frage. Wir bedienten uns daher des Dichlormethan-Methanol Systems und stellten fest, daß konzentrierter Ammoniak notwendig ist, um zu einer besseren Auftrennung zu gelangen (siehe Kapitel 3.1). Es wurden 20 µl konzentrierter Ammoniak für 200 ml Gemisch (Dichlormethan, Methanol) zugesetzt. Bei der Zusammensetzung des Dichlormethan–Methanol Gemisches begannen wir mit reinem Dichlormethan und erhöhten in der Folge schrittweise die Polarität der mobilen Phase durch Anheben des Methanol Anteils (Tabelle 9).

30 mg der vereinigten Alkaloidfraktionen 1,2,3 (Tabelle 7) wurden in Dichlormethan gelöst und auf eine 60 cm lange Säule, gefüllt mit Kieselgel 60 (0,063-0,2 mm), aufgetropft. Diese Säule mit 0,5 cm Durchmesser wurde durch Füllen mit Watte und Kieselgel, das zuvor aufgeschlämmt wurde, vorbereitet. Nach Durchspülen mit 100 ml Dichlormethan wurde der Hahn geschlossen und die in Dichlormethan gelöste Alkaloidfraktion aufgebracht. Überschichtet wurde zusätzlich mit etwas Seesand, der ein Aufwirbeln des Trägermaterials am Start verhindern sollte. Nun konnte die Elution der Verbindungen begonnen werden.

In Tabelle 9 sind die Elutionsmischungen den gesammelten Fraktionen gegenübergestellt und die säulenchromatographische Aufarbeitung zusammen­gefasst.

Tabelle 9: Säulenchromatographische Aufarbeitung der Alkaloidfraktion (Tabelle 7+8)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Es wurde ein sehr fein abgestimmter Gradient eingesetzt und eine geringe Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase gewählt, da vier Verbindungen einen ähnlichen Rf -Wert zeigten (Rf -Werte 0,23; 0,25; und 0,43; 0,45 siehe Abbildung 1).

3.3 Dünnschichtchromatographische Überprüfung der Säulenfraktionen

Jede dritte Fraktion wurde im Rotationsverdampfer zur Trockene gebracht, in etwas Dichlormethan angelöst und mittels Dünnschichtchromatographie überprüft. Dazu wurden Kieselgelplatten verwendet und als mobile Phase diente ein Gemisch aus Toluol-Aceton-Methanol-konz. Ammoniak (45+45+7+3).

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