Nachweis von Erythropoietin-Missbrauch im Sport

Breidbach, Andreas

Nachweis von Erythropoietin-Missbrauch im Sport

Am Beispiel der Dopingkontrollen während der Olympischen Winterspiele Salt Lake City 2002

von Andreas Breidbach (Autor:in)

Chemie - Biochemie

Zusammenfassung

Inhaltsangabe:Einleitung:
Diese Arbeit beschreibt die Methodik der Erythropoietin (EPO)-Dopingkontrollanalytik am Beispiel der Olympischen Winterspiele Salt Lake City 2002 (SLC2002) und wertet die dort gesammelten Daten aus. Es wurde bei einem Athleten und zwei Athletinnen ein Missbrauch von Darbepoetin alfa (Aranesp Ô) nachgewiesen, ein zu der Zeit erst seit kurzem erhältliches Nachfolgeprodukt von rekombinanten, humanem EPO (rhEPO).
Humanes EPO, ein Glykoprotein mit 165 Aminosäuren, einem Sauerstoffund drei Stickstoff-gebundenen Kohlenhydratresten, ist ein Hormon, dass die Bildung der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) im menschlichen Körper steuert. Sein Molekulargewicht beträgt ca. 30 kDa mit einem Kohlenhydratanteil von 30-40 %. Die Existenz dieses Hormons ist bereits 1906 postuliert worden. Seit 1948 wird es Erythropoietin genannt. 1957 wurde als Hauptbildungsort im erwachsenen Menschen die Niere ausgemacht. 1977 ist dann mit der Isolierung von wenigen Milligramm EPO aus dem Urin von Patienten mit aplastischer Anämie ein Meilenstein in der EPO-Forschung erreicht worden. Acht Jahre später, 1985, wurde das EPO-Gen erfolgreich kloniert.
Seit 1988 ist rhEPO für die Behandlung von Anämie als Folge von Nierenversagen erhältlich. Die Verfügbarkeit von rhEPO hat seitdem wesentlich zur Verbesserung der Lebensqualität von Menschen mit Nierenversagen beigetragen. Inzwischen wird rhEPO auch in vielen anderen Gebieten als Behandlungsmittel eingesetzt.
Auch im gesunden Menschen kann rhEPO die Anzahl der Erythrozyten erhöhen. Dies macht es zu einem potenten Dopingmittel, da die Ausdauerleistungsfähigkeit durch diese Erhöhung verbessert wird. Aus diesem Grund hat 1990 das Internationale Olympische Komitee rhEPO in die ?Liste der verbotenen Substanzen? aufgenommen. Aber bis zum Jahre 2000, als zwei unterschiedliche Nachweisverfahren veröffentlicht wurden, war ein Missbrauch von rhEPO nicht nachweisbar.
Das eine dieser zwei Verfahren beruhte auf den Veränderungen im roten Blutbild, die durch die Anwendung von rhEPO verursacht werden. Damit ist es ein indirektes Verfahren, da nur Wirkungen gemessen werden. Das andere Verfahren beruht auf dem Erkennen von rhEPO im Urin durch isoelektrische Fokussierung eines Urinkonzentrates mit nachfolgendem Immunoblotting, was ein direktes Verfahren darstellt und einem indirekten vorzuziehen ist. Beide Verfahren sind bei SLC2002 eingesetzt worden und werden hier beschrieben.
Es wird gezeigt, dass ein erster, schneller […]

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

ID 4097

Breidbach, Andreas:

Nachweis von Erythropoietin-Missbrauch im Sport, am Beispiel der Dopingkontrollen

während der Olympischen Winterspiele Salt Lake City 2002

Hamburg: Diplomica GmbH, 2005

Zugl.: Deutsche Sporthochschule Köln, Dissertation / Doktorarbeit, 2004

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Diplomica GmbH

http://www.diplom.de, Hamburg 2005

Printed in Germany

Lebenslauf

Name Andreas Breidbach

geboren 23.05.1964 in Köln

Schulbildung:

1970-1974 Grundschule Gr. Griechenmarkt, 50676 Köln

1974-1980 Theodor-Heuss-Realschule, Euskirchener Str., 50935 Köln

1980-1982 Gewerbliche Schule II, Perlengraben 101, 50676 Köln

1982-1983 Fachoberschule für Ernährung und Hauswirtschaft Weins-

bergstr, 50823 Köln

Studium:

1984 Einsemestriges Studium (General Chemistry, General Phy-

sics, College Algebra, Butchery) am BHC College, Boston, MA,

USA

1986-1991 Studium der Lebensmittelchemie an der BUGH Wuppertal

1995-2000 Promotionsvorbereitendes Studium DSHS Köln

2002-2003 Promotionsvorbereitendes Studium DSHS Köln

Beruflicher und wissenschaftlicher Werdegang:

1980-1982 Ausbildung zum Fleischergesellen: Metzgerei P. Becker, Je-

suittengasse 117, 50737 Köln

1983-1984 Grundwehrdienst

1985 Beschäftigung als Meat-Cutter: Butcher Block, Boston, MA,

USA

1985-1986 Beschäftigung als Fleichergeselle: Metzgerei W. Breidbach,

Blaubach 4, 50676 Köln

1992 Wiss. Hilfskraft am Institut für Biochemie, DSHS Köln

1992-2000 Wiss. Angestellter am Institut für Biochemie, DSHS Köln

1995 Zweiwöchiger Aufenthalt in Harare/ Zimbabwe zur Inbetrieb-

nahme eines temp. Dopingkontrolllabors und Ausbildung lo-

kaler Wissenschaftler anlässlisch der All African Games 1995

2000 Dreiwöchige Mitarbeit im Australian Sport Drug Testing La-

boratory, Sydney, anlässlich der Olymp. Sommerspiele 2000

2001-2002 Staff Research Associate III: Paul Ziffren Olympic Analytical

Laboratory, University of California, Los Angeles, CA, USA

2002 Leitung des Arbeitsbereiches Erythropoietin im temp. Doping-

kontrollabor Salt Lake City anlässlich der Olymp. Winterspie-

le 2002

Seit 2003 Staff Research Associate III-Supervisor: Paul Ziffren Olympic

Analytical Laboratory, UC Los Angeles, CA, USA

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt die Methodik der Erythropoietin (EPO)-Dopingkon-

trollanalytik am Beispiel der Olympischen Winterspiele Salt Lake City 2002

(SLC2002) und wertet die dort gesammelten Daten aus. Es wurde bei einem

Athleten und zwei Athletinnen ein Missbrauch von Darbepoetin alfa (Arane-

spTM) nachgewiesen, ein zu der Zeit erst seit kurzem erhältliches Nachfolge-

produkt von rekombinanten, humanem EPO (rhEPO).

Humanes EPO, ein Glykoprotein mit 165 Aminosäuren, einem Sauerstoff-

und drei Stickstoff-gebundenen Kohlenhydratresten, ist ein Hormon, dass die

Bildung der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) im menschlichen Körper

steuert. Sein Molekulargewicht beträgt ca. 30 kDa mit einem Kohlenhydra-

tanteil von 3040 %. Die Existenz dieses Hormons ist bereits 1906 postuliert

worden. Seit 1948 wird es Erythropoietin genannt. 1957 wurde als Hauptbil-

dungsort im erwachsenen Menschen die Niere ausgemacht. 1977 ist dann mit

der Isolierung von wenigen Milligramm EPO aus dem Urin von Patienten mit

aplastischer Anämie ein Meilenstein in der EPO-Forschung erreicht worden.

Acht Jahre später, 1985, wurde das EPO-Gen erfolgreich kloniert.

Seit 1988 ist rhEPO für die Behandlung von Anämie als Folge von Nie-

renversagen erhältlich. Die Verfügbarkeit von rhEPO hat seitdem wesentlich

zur Verbesserung der Lebensqualität von Menschen mit Nierenversagen bei-

getragen. Inzwischen wird rhEPO auch in vielen anderen Gebieten als Be-

handlungsmittel eingesetzt.

Auch im gesunden Menschen kann rhEPO die Anzahl der Erythrozyten

erhöhen. Dies macht es zu einem potenten Dopingmittel, da die Ausdauer-

leistungsfähigkeit durch diese Erhöhung verbessert wird. Aus diesem Grund

hat 1990 das Internationale Olympische Komitee rhEPO in die ,,Liste der ver-

botenen Substanzen" aufgenommen. Aber bis zum Jahre 2000, als zwei un-

terschiedliche Nachweisverfahren veröffentlicht wurden, war ein Missbrauch

von rhEPO nicht nachweisbar.

Das eine dieser zwei Verfahren beruhte auf den Veränderungen im roten

Blutbild, die durch die Anwendung von rhEPO verursacht werden. Damit ist

es ein indirektes Verfahren, da nur Wirkungen gemessen werden. Das andere

Verfahren beruht auf dem Erkennen von rhEPO im Urin durch isoelektri-

sche Fokussierung eines Urinkonzentrates mit nachfolgendem Immunoblot-

ting, was ein direktes Verfahren darstellt und einem indirekten vorzuziehen

ist. Beide Verfahren sind bei SLC2002 eingesetzt worden und werden hier

beschrieben.

Es wird gezeigt, dass ein erster, schneller und einfacher Bluttest 133 ver-

dächtige Proben identifizierte. 72 Blut- und Urinproben wurden daraufhin

eingehender untersucht. Danach bestand nur noch bei 25 Blutproben ein Ver-

dacht auf aktuellen Missbrauch, der aber durch den Urintest bei allen außer

fünf Proben von drei Athleten/innen entkräftet wurde.

iii

Abstract

This work describes the methodology of the erythropoietin (EPO) doping con-

trol analyses at the Winter Olympics Salt Lake City 2002 (SLC2002) and eva-

luates the data obtained there. For three athletes a misuse of darbepoetin alfa

(AranespTM) was detected. At the time AranespTM, which is an analog of recom-

binant human erythropoietin (rhEPO), had only been commercially available

for a short period of time.

Human EPO, a glycoprotein of 165 amino acids, one oxygen- and two

nitrogen-linked carbohydrate moieties, is a hormone, that regulates the pro-

duction of red blood cells (erythrocytes) in the human body. Its molecular

weight is ca. 30 kDa with a carbohydrate fraction of 3040%. The existence

of this hormone had been postulated as early as 1906 and it was named ery-

thropoietin in 1948. In 1957 its main production site in the adult human was

recognized as the kidney. A milestone in EPO research occured 1977 with the

isolation of a few milligrams of EPO from urine of patients with aplastic ane-

mia. Eight years later, 1985, the EPO gene was successfully cloned.

Since 1988 rhEPO has been availble for the treatment of anemia due to

renal failure. The availability of rhEPO has improved the quality of life of

patients with kidney failure significantly since then. Meanwhile rhEPO is

being used as a treatment in many other areas.

Recombinant hEPO also increases the number of erythrocytes in healthy

humans. This makes it a potent means of doping, since an increase in ery-

throcytes improves endurance performance. Because of this, the Internatio-

nal Olympic Committee added rhEPO to its "list of prohibited substances"

in 1990. However, misuse was not detectable until 2000 when two different

detection methods were published.

One of the two methods is based on changes in red blood cell parameters

caused by rhEPO administration. This makes it an indirect method, because

secondary effects are measured. The other method is based on the recognition

of rhEPO in urine by isoelectric focusing of urine concentrates followed by

immuno blotting, which is a direct and more preferable method. Both methods

were used during SLC2002 and are described herein.

It will be shown that an initial, quick, and simple blood test produced

133 suspicious samples. 72 blood and urine samples then underwent more

sophisticated testing. Afterwards, 25 blood samples were still suspicious for

current misuse, but the urine test was negative for all but five samples from

three athletes.

Danksagungen

Hiermit möchte ich Dr. Don H. Catlin und dem Paul Ziffren Olym-

pic Analytical Laboratory der Universität von Kalifornien, Los Ange-

les, dafür danken, dass sie mir die Möglichkeit gegeben haben, wäh-

rend der Olympischen Winterspiele in Salt Lake City 2002 die EPO-

Analytik zu leiten.

Meinen Mitarbeitern Inna Tregub, Henry Truong, Jeffrey Gorzek

und Anni Ramseyer gehört Dank, weil ohne sie diese Daten nicht in

dieser Form hätten gesammelt werden können.

Danken möchte ich auch dem Direktor der Medizinischen Kommis-

sion des IOC, Dr. Patrick Schamasch, und den internationalen Verbän-

den FIS, ISU, IBU, für die Erlaubnis, die in Salt Lake City gesammel-

ten Daten für diese Arbeit verwenden zu dürfen.

Ralf Meutgens und meine Frau Sabine Nießen haben Dank verdient

für ihre wertvollen Tipps beim Korrekturlesen dieser Arbeit.

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Wilhelm Schänzer, der es mir

ermöglicht hat, diese Arbeit zu schreiben. Ohne seinen Ansporn und

Unterstützung wäre diese Arbeit immer noch nicht geschrieben.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

1.1 Humanes Erythropoietin . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.1.1 Geschichtlicher Überblick . . . . . . . . . . . . . .

1.1.2 Molekularbiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.1.3 Leistungssteigernde Wirkung . . . . . . . . . . . .

1.1.4 Nachweisbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2 EPO-Tests bei Olympischen Spielen . . . . . . . . . . . .

1.3 ,,Paul Ziffren Olympic Analytical Laboratory" . . . . . . .

1.4 Ziel dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2 Experimenteller Teil

2.1 Direkter Nachweis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1.2 Der uEPO-Test nach Lasne . . . . . . . . . . . . .

2.2 Indirekter Nachweis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2.2 Der Bluttest nach Parisotto . . . . . . . . . . . . .

2.3 Der kombinierte Blut/ Urin-Test . . . . . . . . . . . . . .

2.3.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.3.2 Durchführung des kombinierten Test während

der Winterspiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.4 Untersuchte Sportler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.5 Vergleichswerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.6 ,,Zweite-Generation Bluttest" . . . . . . . . . . . . . . . .

2.7 Isoformenprofile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.8 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3 Ergebnisse

3.1 Blut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2 Urin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2.1 Qualitätskontroll-Urinproben . . . . . . . . . . . .

vii

3.2.2 Athleten-Urinproben . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3 Kombinierter Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3.1 ,,Normale" Profile . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3.2 ,,Unnormale" Profile . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3.3 ,,Saure" Profile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3.4 ,,Keine" Profile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4 Diskussion

4.1 ,,Vor-Ort-Screening" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.2 ,,ON model score" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.3 Der Urintest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.4 Blut vor Urin: Sinn und Notwendigkeit . . . . . . . . . .

4.4.1 ,,Zweite-Generation"-Bluttest . . . . . . . . . . . .

4.4.2 Trainings- oder Wettkampfkontrollen . . . . . . .

4.5 Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Anhang A

Glossar

109

viii

Abbildungsverzeichnis

1.1 Aminosäuresequenz von hEPO . . . . . . . . . . . . . . .

1.2 Tertiär-Struktur von hEPO . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1 EPO-Isoformenmuster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2 Densitogramm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.3 Laseroptik des ADVIA 120 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Histogramme: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.1 Hämatokritwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2 Retikulozyten-Hämatokritwerte . . . . . . . . . . . . . . .

3.3 Prozent Makrozytenwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.4 Hämoglobinwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.5 Prozent Retikulozytenwerte . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.6 sEPO-Konzentrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.7 sTfR-Konzentrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.8 ,,ON model scores" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.9 ,,OFF model scores" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.10 uEPO-Isoforme von Athleten . . . . . . . . . . . . . . . .

3.11 Isoformenprofile der Qualitätskontroll-Urinproben . . . .

3.12 Isoformenprofile der Athleten-Urinproben . . . . . . . . .

Tabellenverzeichnis

3.1 Charakteristische Größen von allen Athleten . . . . . . .

3.2 Charakteristische Größen von den Athleten mit ,,norma-

len" Profilen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3 Median und alle Werte für die Athleten mit ,,unnorma-

len" Pofilen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.4 Median und alle Werte für die Athleten mit ,,sauren" Po-

filen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.5 Median und alle Werte für die Athleten ohne detektier-

bare Profile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Kapitel 1

Einleitung

1.1 Humanes Erythropoietin

Humanes Erythropoietin (hEPO)

, ein Glykoprotein mit 165 Amino-

säuren, einem Sauerstoff- und drei Stickstoff-gebundenen Kohlenhy-

dratresten, steuert die Bildung der roten Blutkörperchen (Erythro-

zyten) im menschlichen Körper. Sein Molekulargewicht beträgt ca.

30 kDa mit einem Kohlenhydratanteil von 3040 %.

1.1.1 Geschichtlicher Überblick

Bereits 1906 haben Carnot und Deflandre

die Existenz eines Hormons

postuliert, das die Erythropoese steuert und welches sie ,,Hémopoïétin"

nannten. Dieses Postulat basierte auf der Beobachtung, dass in Kanin-

chen, denen man Serum eines anämischen Kaninchens injizierte, die

Anzahl der Erythrozyten bis zu 40 % anstieg. Weil die Aktivität die-

ses Hormones auf die Bildung von roten Blutkörperchen beschränkt

ist, wurde 1948 von Bonsdorff und Jalavisto

der Begriff ,,Erythropoie-

tin" (EPO) eingeführt. In den 50er Jahre wurde durch eine Reihe neu-

er Beobachtungen und Versuche die Existenz von EPO gestützt. 1957

dann zeigten Jacobson et. al.,

das die Niere der Hauptbildungsort für

EPO ist. Man wusste inzwischen, dass Menschen mit aplastischer An-

ämie sehr große Mengen EPO im Urin ausscheiden und solche mit

Nierenversagen bei niedrigen Serum-EPO-Konzentrationen sehr stark

anämisch sind. Dieses Wissen führte dazu, dass intensiv an der Isolie-

rung und Aufreinigung von EPO gearbeitet wurde. 1977 wurde dieser

Meilenstein von Miyake et. al.

erreicht. Dieses aus 2500 Litern Urin

Für Bedeutung von Abkürzungen siehe Glossar (S. 109)

KAPITEL 1. EINLEITUNG

Abbildung 1.1: Die Aminosäuresequenz von humanem Erythropoietin

von Patienten mit aplastischer Anämie isolierte Erythropoietin, ins-

gesamt nur wenige Milligramm, bildete die Basis für die erfolgreiche

Klonierung des EPO-Gens im Jahr 1985.

1.1.2 Molekularbiologie

Das menschliche EPO-Gen, das in Chromosom 7 zu finden ist, kodiert

insgesamt 193 Aminosäuren. Post-translational werden aber durch ei-

ne Endopeptidase die ersten 27 Aminosäuren, eine hydrophobe Se-

quenz, und durch eine Carboxypeptidase das C-terminale Arginin ent-

fernt. Die Glykosylierung findet ebenfalls post-translational an den Po-

sitionen Asparagin 24, 38 und 83 (Stickstoff-Bindung) sowie Serin 126

(Sauerstoff-Bindung) (Abb.1.1) statt. Zwei Disulfid-Brücken zwischen

Cystein 7/161 und 29/33 stabilisieren die korrekte Faltung des Glyko-

proteins (Abb.1.2).

Anders als die anderen Mitglieder der Cytokin-Superfamilie wird

hEPO hauptsächlich in einem Organ, der Niere, gebildet. Zu einem

geringen Teil wird hEPO auch noch in der Leber produziert, die das

Hauptorgan der fetalen EPO-Produktion ist. Die EPO-Bildung wird

1.1. HUMANES ERYTHROPOIETIN

Abbildung 1.2: Die tertiäre Struktur von humanem Erythropoietin

durch einen klassischen Rückkopplungsmechanismus gesteuert. Sau-

erstoffmangel (Hypoxie) im betreffenden Gewebe aktiviert einen Sau-

erstoff-Sensor, der seinerseits das EPO-Gen aktiviert, was zu einer ver-

stärkten Produktion führt. Es existieren keine Speicher, sondern hEPO

wird jeweils

de novo gebildet.

Sauerstoffüberschuss (Hyperoxie) hat

die gegensätzliche Wirkung und vermindert die hEPO-Produktion.

Da hEPO, wie eingangs erwähnt, ein Glycoprotein ist, muss rhEPO

durch Säugetierzellen, denen das menschliche EPO-Gen eingepflanzt

wurde, exprimiert werden. Weder Bakterien- noch Hefezellen besitzen

den notwendigen Enzymapparat, der für die Glykolysierung notwendig

ist. Und ohne diese Glykolisierung ist die

in vivo-Aktivität äußerst ge-

ring. Da sie durch das gleiche Gen kodiert werden, besitzen endogenes

und rekombinantes hEPO ein identisches Aminosäure-Grundgerüst.

Aber die gebundenen Kohlenhydratketten sind nicht identisch, son-

dern folgen zelllinien-spezifischen Mustern. Sie sind entweder un-,

einfach-, zweifach- oder dreifach-verzweigt, was dann als mono-, bi-,

tri- oder tetra-antennär bezeichnet wird. Das trifft aber nur auf die drei

N-gebundenen Ketten zu. Die O-gebundene kann maximal bi-antennär

sein. Jede dieser Antennen kann eine oder zwei Laktosamin-Gruppen

enthalten und mit einem Sialinsäure-Rest abschließen.

Daraus folgt

das ein EPO-Molekül vier (vier mono-antennäre) bis 14 (drei tetra- plus

eine bi-antennäre) Kohlenhydrat-Antennen besitzt, die mit 0 bis 14

Sialinsäure-Resten besetzt sein können.

Aufgrund dieser Vielfalt ist

KAPITEL 1. EINLEITUNG

EPO kein wohldefiniertes Molekül, sondern besteht aus einer Vielzahl

unterschiedlicher Spezien. Diese Vielfalt wird als

Mikroheterogenität

bezeichnet und ist Glykoproteinen eigen.

Seit 1988 ist rhEPO als Medikament auf dem Markt. Die zwei

großen Produzenten, Amgen (Epoetin alfa, USA) und Roche (vorm.

Boehringer-Mannheim, Epoetin beta, Schweiz) exprimieren aus CHO-

Zellen, das sind Zellen aus den Ovarien chinesischer Hamster (CHO -

engl.: Chinese Hamster Ovary). Aber auch Nierenzellen von Babyham-

stern (BHK - engl.: Baby Hamster Kidney) und humane Zellen kom-

men in der großtechnischen Produktion zum Einsatz. Da die Moleküle

mit dem höchsten Sialinsäuregehalt die höchste biologische Aktivität

haben,

werden sie bei der Isolierung aus dem Kulturmedium bevor-

zugt. Deshalb findet man in Epoetin alfa nur EPO-Moleküle mit 1014

Sialinsäure-Resten, in Epoetin beta nur solche mit 914 Resten.

In der Therapie von Patienten mit Nierenversagen hat der Einsatz

von rhEPO sehr viel zur Verbesserung der Lebensqualität beigetra-

gen, weil damit die Notwendigkeit von regelmäßigen Bluttransfusio-

nen mit den einhergehenden Risiken und Unannehmlichkeiten weg-

fiel. Aber auch auf vielen anderen Gebieten wird rhEPO als Therapeu-

tikum eingesetzt, z.B. zur Gewinnung von Eigenblutkonserven vor grö-

ßeren Operationen, in der Behandlung von entzündlichen Krankheiten

und in der Nachbehandlung von Krebspatienten.

1.1.3 Leistungssteigernde Wirkung

Die menschliche Ausdauerleistungsfähigkeit wird im wesentlichen

durch das Sauerstoffaufnahmevermögen limitiert.

Andere Faktoren

wie aerob-anaerobe Schwelle und Bewegungsökonomie spielen im Ver-

gleich nur eine untergeordnete Rolle.

Das Sauerstoffaufnahmever-

mögen hängt vom Herzminutenvolumen und der Sauerstofftransport-

kapazität des Blutes ab. Die Sauerstofftransportkapazität des Blutes

und folglich auch die Ausdauerleistungsfähigkeit steigt mit der Zahl

der Erythrozyten. Sie enthalten das Hämoglobin, welches den Sauer-

stoff auf dem Weg von der Lunge zum Zielgewebe bindet.

Eine Änderung der Erythrozytenzahl bzw. Hämoglobinkonzentrati-

on hat immer eine proportionale Änderung der Leistungsfähigkeit zur

Folge.

Und das ist unabhängig von den Ausgangswerten, was bedeu-

tet, dass hochtrainierte Ausdauersportler die gleichen relativen Ände-

rungen erfahren wie untrainierte Personen.

1.1. HUMANES ERYTHROPOIETIN

Da rhEPO die Ausdauerleistungsfähigkeit direkt positiv beein-

flusst, muss es als potenzielle Dopingsubstanz gesehen werden. Seit

1990 wird rhEPO deshalb auf der ,,Liste der verbotenen Substanzen"

des

Internationalen Olympischen Komitees (IOC) geführt.

1991 zeigten Eckblom und Berglund,

dass eine längere Behand-

lung mit rhEPO bei mittel bis gut trainierten Sportstudenten zu ei-

nem signifikanten Anstieg der Hämoglobinkonzentration (Hgb) und

des Hämatokrits (Hkt) führte. Damit verbunden war eine signifikan-

te Verbesserung der maximalen Sauerstoffaufnahme (VO

2 max

) und der

Belastungszeit bis zur Erschöpfung. Diese Ergebnisse waren vergleich-

bar mit Ergebnissen, die bei einem Teil der Probanden nach Reinfusion

von Blutkonserven erhalten wurden. Auch Casoni et al.,

Souillard et

al.

und Breidbach et al.

konnten einen signifikanten Anstieg von

Hgb und Hkt nachweisen. Die Verbesserung der VO

2 max

wurde dar-

überhinaus auch von Birkeland et al.

gemessen.

Der Missbrauch von rhEPO durch ,,gesunde" Athleten

birgt aber

nicht nur einen Verstoß gegen die Sportethik in sich, sondern auch eine

nicht unerhebliche Gesundheitsgefahr. Es kann zu einem unkontrol-

liertem Anstieg des Hkt kommen mit der damit verbundenen Gefahr

von Kreislaufkomplikationen, wie z.B. Thrombosen, da die Viskosität

des Blutes stark ansteigt. Außerdem ist ein signifikanter Anstieg des

Belastungsblutdruckes in der Literatur beschrieben.

1.1.4 Nachweisbarkeit

Zum Nachweis eines Erythropoietin-Missbrauchs werden grundsätz-

lich zwei verschiedene Wege unterschieden:

Indirekter Nachweis: im Blut werden die Konzentrationen von Ery-

thropoietin und anderer, von EPO beeinflusster Parameter ge-

messen. Sollten diese Konzentrationen außerhalb festzulegender

Bereiche liegen, ohne dass dafür eine hinreichende Erklärung ge-

funden werden kann, ist der Nachweis geführt.

Direkter Nachweis: im Urin wird das Vorhandensein von applizier-

tem, rekombinanten Erythropoietin nachgewiesen.

Die Begriffe Athlet, Sportler, Proband, etc., werden synonym für weibliche und

männliche Personen verwendet

KAPITEL 1. EINLEITUNG

Indirekter Nachweis

Der

indirekte Nachweis beruht auf dem Vergleich von gemessenen

Konzentrationen bestimmter Parameter mit Referenzbereichen für

diese Parameter. Die Methodik zur Bestimmung z.B. der EPO-Konzen-

tration im Blut existiert, seit versucht wurde dieses Hormon zu cha-

rakterisieren. Sie ist in den letzten Jahren ständig verbessert worden,

da sie von großer Bedeutung für Diagnose und Therapiesteuerung ist.

Allerdings kann damit immer nur die Gesamtkonzentration von endo-

genem und rekombinanten EPO zusammen gemessen werden.

Da die Beweiskraft eines indirekten Nachweises immer schwä-

cher ist als die eines direkten, und um die Wahrscheinlichkeit ,,falsch-

positiver" Nachweise zu vermindern, versucht man, mehrere Parame-

ter zu kombinieren. Deshalb wird, neben der EPO-Konzentration, auch

die Konzentration anderer Parameter, die mit EPO korrelieren, gemes-

sen. Zu den Parametern, die in diesem Zusammenhang diskutiert wer-

den, zählen:

17, 2025

· löslischer Transferrin-Rezeptor (sTfR)

· Ferritin (Ftn)

· Hämatokrit (Hkt)

· Gesamt-Hämoglobin

· Hämoglobin-Konzentration (Hgb)

· Erythrozytenzahl (ERY)

· Retikulozytenzahl (RET)

· Retikulozyten-Hämoglobin (rHgb)

· Retikulozyten-Hämatokrit (rHkt)

· Makrozytenanteil (MAKRO)

· Gesamt-Serumprotein

· -Globin mRNS

Der

lösliche Transferrinrezeptor ist ein Maß für die Rate der Neu-

bildung von Erythrozyten. Die unreifen Erythrozyten besitzen an der

Zellaussenseite Rezeptoren für Transferrin, das Protein, das Eisen im

1.1. HUMANES ERYTHROPOIETIN

Körper transportiert. Sobald Transferrin an seinen Rezeptor gebun-

den hat, wird der Rezeptor-Ligand-Komplex ins Zellinnere befördert,

das gebundene Eisen inkorporiert und dann das eisenfreie Apotrans-

ferrin und der Rezeptor, der dann löslich ist, ins Blut abgegeben. Je

höher die Bildungsrate, destso größer ist die Konzentration von sTfR

im Blut. EPO induziert eine höhere Erythrozytenbildungsrate und da-

mit eine Erhöhung der sTfR-Konzentration. Aber auch funktioneller

Eisenmangel und alle physiologischen Zustände, die eine erhöhte Bil-

dungsrate mit sich bringen, sorgen für einen Anstieg.

Ferritin ist ein Protein, das der Eisenspeicherung dient. Erhöhte

Erythrozytenbildungsraten bedingen einen erhöhten Eisenbedarf, was

zu einer Verarmung an Ferritin führt, wenn unzureichend Eisen sup-

plementiert wird. Da gleichzeitig sTfR ansteigt, kann der Quotient

sTfR/Ftn

längere Zeit erhöht sein.

Der

Hämatokrit ist ein Maß für das Verhältnis von zellulären zu

nicht-zellulären Blutbestandteilen. Ein Hkt von 45 bedeutet, dass das

Blut sich zu 45 % aus Blutzellen und zu 55 % aus Plasma zusammen-

setzt. Eine erhöhte Neubildung von Erythrozyten, wie sie durch Appli-

kation von rhEPO erreicht wird, führt zu einem Anstieg des Hkt.

Parallel dazu steigt auch das

Gesamt-Hämoglobin und die Hämo-

globinkonzentration. Zweiteres ist einfach zu messen, in dem in einer

kleinen Menge Blut die Menge an Hämoglobin bestimmt wird. Die Hä-

moglobinkonzentration hat aber wie der Hämatokrit nur wenig Aus-

sagekraft im Doping-Kontext wegen der leichten Manipulierbarkeit

dieser Werte (z.B. Infusion von Plasmaexpandern). Die Bestimmung

des Gesamt-Hämoglobins im Körper ist dagegen sehr viel aufwändiger

aber wesentlich aussagekräftiger, da dieser Wert nur schwer zu mani-

pulieren ist.

Die

Retikulozytenzahl, das Retikulozyten-Hämoglobin und der Re-

tikulozyten-Hämatokrit sind Größen, die ebenfalls Aufschluss über die

Blutbildungsrate geben. Ein Anstieg dieser Werte ist ein erster Indi-

kator für eine gesteigerte Erythropoese. Retikulozyten sind junge Ery-

throzyten, die noch Reste von Zellorganellen, wie den Zellkern und da-

mit RNS, enthalten.

Makrozyten sind Erythrozyten, die ein Volumen größer als 120 fL

haben. Bei einer erhöhten Blutbildungsrate steigt die Zahl der

Makro-

zyten relativ zur Erythrozytenzahl.

Gesamt-Serumprotein stellt die Konzentration aller Proteine im

Serum dar. Dieser Parameter wird zur Normalisierung benutzt, z.B.

könnte die sTfR-Konzentration durch Dehydratation des getesteten

Athleten erhöht sein. Da aber gleichzeitig das

Gesamt-Serumprotein

KAPITEL 1. EINLEITUNG

auch anstiege, wäre nach der Normalisierung der Einfluss des Hydra-

tationszustandes eliminiert.

Ebenfalls ein Indikator der Blutbildungsrate ist die

-Globin

mRNS. Hämoglobin besteht aus vier Untereinheiten, beim Erwachse-

nen sind das zwei - und zwei -Globine. Jede dieser Globin-Ketten

bindet eine Häm-Gruppe. Eine Erhöhung der Expression des -Globins

hat auch eine Erhöhung der ,,Messenger"-Ribonukleinsäure (mRNS)

zur Folge.

Alle oben genannten Indikatoren der Blutbildungsrate folgen un-

terschiedlichen Pharmakokinetiken und erlauben so unterschiedliche

Retrospektivitäten bezüglich eines EPO-Missbrauches. Die Messme-

thodik für diese Parameter existiert schon seit geraumer Zeit, weshalb

bis zum Jahr 2000 der Hauptaugenmerk auf dem indirekten Nachweis

lag.

Es gibt aber ein entscheidendes Problem: Die Abnahme von Blut zu

Dopingkontrollzwecken ist noch rechtlich umstritten. Zur Zeit werden

von vier internationalen Sportverbänden regelmäßig Blutkontrollen

im Wettkampf durchgeführt. Das sind der Internationale Radsportver-

band (UCI), der Internationale Skiverband (FIS) im Bereich Nordisch,

die Internationale Biathlon- (IBU) und die Internationale Schlittschuh

Union (ISU) im Bereich Eisschnelllauf. Diese Kontrollen stellen aber

keine Dopingkontrollen dar, sondern sind in den jeweiligen Wettkampf-

bestimmungen reglementiert. Nur Athleten, die unterhalb festgelegter

Grenzwerte liegen, werden für den jeweiligen Wettkampf zugelassen.

Ein Überschreiten der Grenzwerte hat nur sehr kurze Sperren zur Fol-

ge, meist für den jeweiligen Wettkampf und bis die Grenzwerte wieder

unterschritten sind.

Zwar werden z.B. vom internationalen Leichtathletikverband

(IAAF) und der ISU auch Blutproben in der Trainingskontrolle ent-

nommen, aber immer in Verbindung mit einer Urinprobe. Und die

Ergebnisse der Blutprobe dienen dann auch nur der Unterstützung

des Ergebnisses der Urinprobe.

Direkter Nachweis

Der

direkte Nachweis wird durch die Glykosylierung des EPO-

Moleküls erst ermöglicht, aber durch die damit verbundene Mikro-

heterogenität auch erheblich erschwert. Als reines Polypeptid wären

endogenes und rekombinantes EPO nicht zu unterscheiden, da die

Aminosäuresequenzen identisch sind. Erst durch die Glykosylierung,

die zelllinien-spezifischen Mustern folgt, entsteht ein Unterschied

1.2. EPO-TESTS BEI OLYMPISCHEN SPIELEN

zwischen endogenem und rekombinantem EPO. Durch die Mikrohete-

rogenität ist dieser Unterschied aber diffuser Natur. Außerdem sind

die Mengen an EPO in der Zirkulation sehr niedrig, was die heutige

Analysentechnik an ihre Grenzen führt.

Wide et al.

haben mittels freier Zonen-Elektrophorese, einer Tech-

nik, die Substanzen aufgrund von unterschiedlichen elektrischen Mo-

bilitäten trennt, 1995 als erste gezeigt, dass ein direkter Nachweis ge-

führt werden kann. Die eingesetzte Methodik war aber sehr arbeits-

und zeitintensiv und in dieser Form für die Dopinganalytik nicht prak-

tikabel. Bisher sind diese Ergebnisse auch nicht verifiziert worden.

2000 ist dann von Lasne/de Ceaurriz

eine Methode, die auf iso-

elektrischer Fokussierung beruht, veröffentlicht worden. Bei der iso-

elektrischen Fokussierung (IEF) wird EPO in seine Isoforme aufge-

trennt. Durch eine signifikante Verbesserung des klassischen Western-

Blots, die von Lasne ,,Double-blotting"

genannt wurde, wurde es mög-

lich mit praktikablen Urinmengen aussagekräftige Isoformen-Muster

zu erhalten. Das Isoformen-Muster von endogenem EPO ist von dem

des rekombinanten Produkts unterscheidbar. Allerdings besteht ein

beträchtliches Maß an Überlappung zwischen den zwei Isoformen-

Mustern. Aber mit Erfahrung und/oder dem Einsatz von verschiedenen

Kenngrößen ist eine sichere Unterscheidung möglich.

Diese Methode ist wesentlich praktikabler für die Dopinganalytik

als die von Wide et al., aber immer noch weit entfernt von den klas-

sischen Methoden, die meist auf Gaschromatographie/ Massenspektro-

metrie

3032

beruhen und durch weitgehende Automatisierung einen ho-

hen Probendurchsatz ermöglichen.

1.2 Der Einsatz des EPO-Tests bei Olympi-

schen Spielen

Nach dem Wettkampfausschluss eines kompletten Teams wegen EPO-

Missbrauches im Jahr 1998 von der weltweit größten Radsportveran-

staltung ,,Tour de France"

3335

wurde auch die breite Öffentlichkeit auf

EPO aufmerksam. Die Bemühungen, einen funktionierenden Nach-

weis zu entwickeln, wurden daraufhin intensiviert.

Im Jahr 2000 war es dann so weit, dass ein Test eingeführt wur-

de. Wenige Monate vor Beginn der Olympischen Spiele in Sydney

2000 hatte das IOC namhafte Experten zu einem Treffen in Lausan-

ne eingeladen. Dort hat eine australische Gruppe um Robin Parisotto

KAPITEL 1. EINLEITUNG

einen auf Blut basierenden, indirekten Nachweis und eine französische

Gruppe um Françoise Lasne

einen auf Urin basierenden, direkten

Nachweis präsentiert. Auf Rat der anwesenden Experten wurde dann

ein kombinierter Test, für den Blut und Urin untersucht wurden, bei

den Spielen in Sydney eingesetzt.

Der Test ist so gestaltet, dass zuerst eine Blutprobe untersucht

wird. Durch den Einsatz automatischer Analysatoren kann eine große

Anzahl von Blutproben in relativ kurzer Zeit untersucht werden. Nur

von solchen Blutproben, bei denen die Berechnung eines sogenannten

,,ON model scores"

einen erhöhten Wert liefert, wird dann die zuge-

hörige Urinprobe untersucht. Durch dieses ,,Screening" sollte erreicht

werden, dass unverdächtige Proben schon vor dem aufwändigen Urin-

test herausgefiltert werden. Der Nachweis des EPO-Missbrauches ist

dann geführt, wenn das Isoformen-Muster aus dem Urintest dem von

rhEPO entspricht. Bei keiner der getesteten Blut/Urin-Proben in Syd-

ney 2000 war dies der Fall.

Bei den olympischen Winterspielen 2002 in Salt Lake City (SLC

2002) wurde vom IOC ein ähnliches Protokoll zum Nachweis eines

EPO-Missbrauches vorgegeben (siehe Anhang A, Abschnitt: ,,Blood Te-

sting Programme", sowie die dazu gehörigen Tabellen 4a und 4b). Das

,,Screening" mittels Blutproben wurde neu gestaltet. Alle Ausdauer-

athleten/innen sollten auf erhöhte Hämoglobinkonzentration und Re-

tikulozytenzahl getestet werden. Athleten, bei denen ein Verdacht auf

EPO-Missbrauch entstand, sollten am Tag des nächsten Wettkamp-

fes erneut getestet werden. Zusätzlich sollten bis zu 20 % der Star-

ter/innen am Tage ihres Wettkampfes getestet werden. Von den drei in-

ternationalen Verbänden, FIS (Bereich Ski/Nordisch), IBU (Biathlon)

und ISU (Bereich Eisschnelllauf), wurden direkt an den Wettkampfs-

tätten insgesamt 1222 Blutproben gemessen. Davon zeigten 133 Pro-

ben einen Retikulozytenanteil über dem Grenzwert von 2.0 % und 8 ei-

ne erhöhte Hämoglobinkonzentration (Hgb). Zu 77 dieser Proben wur-

de dann eine Urinprobe gesammelt und mit der Blutprobe gemäß dem

Protokoll, das in Sydney 2000 verwendet wurde, untersucht. In keiner

dieser Proben konnte rhEPO nachgewiesen werden, trotz ungewöhn-

lich hoher Werte des ,,ON model scores".

Aber bei drei Athleten wurde der Missbrauch des erst seit Dez. 2001

auf dem nordamerikanischen Markt befindlichen Nachfolgeproduktes

von rhEPO, Darbepoitin alfa (AranespTM, AMGEN), nachgewiesen. Al-

lerdings sind diese Athleten nicht im ,,Screening" der internationalen

Verbände aufgefallen, sondern nach einer gezielten Kontrolle durch

das IOC.

1.3. ,,PAUL ZIFFREN OLYMPIC ANALYTICAL LABORATORY"

1.3 ,,Paul Ziffren Olympic Analytical Labo-

ratory"

Die Untersuchungen auf den Missbrauch von rhEPO und anderen ver-

botenen Substanzen fanden in einem, eigens für die olympischen Win-

terspiele eingerichtetem, Labor in Salt Lake City statt. Dieses Labor

wurde vom ,,Paul Ziffren Olympic Analytical Laboratory" (PZOAL) der

Universität von Californien in Los Angeles (UCLA) unter der Leitung

von Dr. Don H. Catlin betrieben. PZOAL wurde anlässlich der olympi-

schen Sommerspiele 1984 in Los Angeles gegründet, um die dort abge-

nommenen Dopingproben zu analysieren und ist seitdem vom IOC für

Dopinganalytik akkreditiert. Im April 2001, 10 Monate vor Beginn der

Spiele, wurde ich eingestellt, um die nötigen Voraussetzungen für eine

erfolgreiche Durchführung des EPO-Tests zu schaffen. Ich war verant-

wortlich für die Anschaffung der notwendigen Geräte und die Ausbil-

dung meiner Mitarbeiter, sowie die Implementierung, Durchführung

und Auswertung des EPO-Testverfahrens, auch und gerade während

SLC 2002.

1.4 Ziel dieser Arbeit

Die Wettkampfstätten in SLC 2002 lagen alle auf über 1500 m ü. N.N.

Die daraus resultierende Hypoxie kann kurzfristig zu einem Anstieg

der Retikulozytenzahl und damit langfristig zu einem Anstieg der Hä-

moglobinkonzentration führen.

In dieser Arbeit soll anhand der in SLC 2002 gesammelten Daten

gezeigt werden, dass die erhöhten ,,ON model scores" auf diese Höhen-

lage und nicht auf EPO-Missbrauch zurückzuführen sind. Auf dieser

Grundlage soll dann der Nutzen und Sinn von Blutkontrollen in die-

sem Kontext diskutiert werden, für den speziellen Fall einer Umge-

bung wie in SLC 2002.

Aufgrund der Pharmakodynamik und -kinetik von rhEPO wäre der

Test auf Missbrauch am wirkungsvollsten, wenn er als unangemeldete

Trainingskontrolle durchgeführt würde. Die Vorgabe des IOC, einen

kombinierten Blut/Urin-Test durchzuführen, erschwert aber die an-

gemessene Durchführung von Trainingskontrollen erheblich. Deshalb

soll auch für die generelle Kontrolle eines EPO-Missbrauches der Sinn

von Blutproben diskutiert werden.

Kapitel 2

Experimenteller Teil

2.1 Direkter Nachweis

2.1.1 Grundlagen

Da rhEPO

aus Zellen exprimiert wird, denen das menschliche EPO-

Gen eingebaut wurde, ist die Aminosäuresequenz identisch mit der des

endogenen, menschlichen EPOs. Die Glykosylierung erfolgt durch en-

zymatische Prozesse und ist deshalb abhängig vom Zelltyp und den

Umgebungsbedingungen. Der aufälligste Unterschied ist der Verzwei-

gungsgrad der Kohlenhydrate und damit die mögliche maximale An-

zahl an Sialinsäureresten.

Ein anderer Grund für den Unterschied zwischen rekombinantem

und endogenem EPO ist die Art und Weise, wie das exprimierte rhE-

PO aus dem Zellkultur-Medium gewonnen wird. Dabei werden bewusst

die Moleküle mit einem hohen Sialinsäuregehalt bevorzugt. Das beein-

flusst das Verhalten von rhEPO während der Elektrophorese, da die

Sialinsäurereste leicht ionisierbare, funktionelle Gruppen in den Koh-

lenhydratketten sind. Zwar enthält auch die Aminosäurekette ionisier-

bare Seitenketten, deren Effekt ist aber im Vergleich gering.

Die Ionisierbarkeit und die damit verbundene Ladung des Moleküls

macht man sich bei der Trennung durch Elektrophorese zu Nutze. Bei

einem bestimmten pH-Wert der Umgebung hat ein gegebenes EPO-

Molekül in Lösung eine ganz bestimmte, positive oder negative, La-

dung. Gleichzeitig hat es ein davon relativ unabhängiges Volumen. In

einem elektrischen Feld wird durch die Ladung eine Kraft erzeugt, die

das Molekül zur Elektrode mit der entgegengesetzten Polarität bewegt.

Für Abkürzungen siehe Glossar (S. 109)

KAPITEL 2. EXPERIMENTELLER TEIL

Durch die Bewegung wird gleichzeitig eine, der elektrischen Kraft ent-

gegengesetzte, Reibungskraft erzeugt, die proportional zum Molekül-

volumen ist. Die resultierende Nettokraft erzeugt eine Mobilität, die

für die gegebenen Umgebungsbedingungen spezifisch für ein Molekül

ist. Für die verschiedenen EPO-Moleküle bedeutet dies, dass bei geeig-

neter Wahl der Bedingungen eine Auftrennung im elektrischen Feld in

die unterschiedlichen Ladungen, z.B. unterschiedliche Anzahlen von

Sialinsäureresten, erfolgt.

Als erste zeigten Wide et al.

dies mit freier Zonenelektrophorese.

Dabei wurden in einem U-förmigen Glasrohr Serum- oder Urindialysa-

te im elektrischen Feld getrennt. Das Glasrohr war mit einer 0.1 %igen

Agararose-Suspension gefüllt, um Diffusionseffekte einzuschränken.

Nach erfolgter Trennung wurde der Glasrohrinhalt vorsichtig fraktio-

niert, um die Trennung nicht zu zerstören, und in den Fraktionen mit-

tels RIA die EPO-Konzentration bestimmt.

Ein anderer elektrophoretischer Modus, nämlich die isoelektrische

Fokussierung (IEF), ist von Lasne et al.

eingesetzt worden. Bei der

isoelektrischen Fokussierung wird der amphotere Charakter der EPO-

Moleküle genutzt. Da EPO, wie alle Proteine, sowohl saure als auch ba-

sische Gruppen besitzt, gibt es einen pH-Wert bei dem sich die Anzahl

positiver und negativer Ladungen gerade aufhebt, die Netto-Ladung

also Null ist. Dieser pH-Wert wird isoelektrischer Punkt (pI) genannt.

Wenn die Trennung in einem pH-Gradienten stattfindet, wird das Mo-

lekül so lange wandern, bis es zu seinem isoelektrischen Punkt kommt.

Dort wird seine Nettoladung und somit auch die elektrische Kraft

gleich Null und das Molekül bleibt stehen. Wird es durch Diffusion

vom isoelektrischen Punkt entfernt, erhält es wieder eine Nettoladung

und wird zum pI zurück transportiert. Dadurch kommt es zu einer Fo-

kussierung, da alle Moleküle mit dem gleichen pI sich idealer Weise

an einem Punkt versammeln. Da die Probenaufgabe aber eine gewisse

Ausdehnung hat und die Fokusierung nur in Richtung des elektrischen

Feldes, nicht aber quer dazu, erfolgt, erhält man Banden.

Im Falle von Epoetin alfa erhält man vier und von Epoetin beta fünf

starke Banden. Jede dieser Banden stellt ein Isoform dar und damit bei

rhEPO eine bestimmte Anzahl an Sialinsäureresten. Die Bande mit

dem niedrigsten pI-Wert repräsentiert das Isoform mit der maximalen

Anzahl von 14 Sialinsäureresten. Bei endogenem, humanem EPO er-

scheinen noch eine ganze Reihe von Banden mit niedrigeren pI-Werten

(s. Abb. 2.1, Bahn N).

2.1. DIREKTER NACHWEIS

Abbildung 2.1: Repräsentative EPO-Isoformen-Muster; der pH-Wert,

und damit auch der pI der einzelnen Banden, wird von oben nach unten

grösser; + Anode, - Kathode; S: Bahn mit Standards (je 2 fmol EPO-

BRP vier dunkle Banden nahe der Kathode und Aranesp vier

dunkle Banden nahe der Anode), N: Bahn mit nur endogenem EPO,

P: Bahn mit rekombinanten und endogenem EPO; die eingekreisten

Banden in Bahn N und P werden mit 0 indiziert.

Die isoelektrische Fokussierung findet in den meisten Fällen in ei-

nem Gel statt. Die Gelmatrix besteht entweder aus dem Polysaccharid

Agarose oder aus Polyacrylamid. Beide Substanzen bilden ein stabiles

Netzwerk mit einer wohl definierten und kontrollierbaren Porengrö-

ße. Durch Veränderung der Porengröße kann man Diffusionseffekte

und Mobilität des Analyten beeinflussen. Generell besitzen Agarose-

Gele größere Poren und werden deshalb vornehmlich zur Trennung

von großen Proteinen und DNA eingesetzt.

Bei Polyacrylamid-Gelen (PAG) ist die Porengröße von der Konzen-

tration des Acrylamids und dem Grad der Quervernetzung, die durch

die Zugabe von Bisacrylamid erreicht und gesteuert wird, abhängig

und lässt sich gut kontrollieren. Bei der isoelektrischen Fokussierung

wird in der Regel mit einem Acrylamid/ Bisacrylamid-Gesamtgehalt

(T) von 5 % und einem Bisacrylamid-Acrylamid-Verhältnis (C) von 3 %

gearbeitet. Der Grund hierfür ist, dass der vorherrschende Trenneffekt

die pH-Abhängigkeit der Netto-Ladung sein soll und nicht die Restrik-

tion der Mobilität durch zu kleine Poren.

Die Gele mit den notwendigen pH-Gradient können auf zwei Ar-

ten hergestellt werden. Die eine Art, die auch für die Herstellung der

KAPITEL 2. EXPERIMENTELLER TEIL

Gele für den EPO-Test eingesetz wird, ist die Zugabe von Ampholyt-

Lösungen. Bei diesen Ampholyten handelt es sich um Kopolymerisate

von Aminosäuren. Diese Kopolymerisate müssen folgende Bedingun-

gen erfüllen: Sie sollen eine Mischung von Molekülen mit wohldefi-

nierten pI-Werten sein, sie sollen eine möglichst hohe Pufferkapazität

haben und sie sollen eine gute Stromleitfähigkeit bei ihrem pI-Wert ha-

ben. Ampholyte sind von verschiedenen Herstellern für verschiedenste

pH-Bereiche erhältlich. Sie können entweder der Gel-Lösung vor der

Polymerisierung zugemischt werden oder aber der Rehydratationslö-

sung, mit der getrocknete, gewaschene, fertig polymerisierte, Gele re-

konstituiert werden. Ampholyt-IEF-Gele haben vor der Elektrophore-

se einen einheitlichen pH, der etwa in der Mitte des gewählten pH-

Bereiches liegt. Erst nach Anlegen eines elektrischen Stromes bildet

sich der pH-Gradient aus, der für die Fokussierung benötigt wird. Und

dies beschreibt den bedeutenden Nachteil: der pH-Gradient ist dyna-

misch und kann leicht durch Probenbestandteile beeinflusst werden.

Auch ist der Herstellungsprozess der Ampholyte nicht perfekt steuer-

bar, so dass bei verschiedenen Chargen der gleichen Ampholyt-Lösung

verschiedene Arten von Gradienten (linear, konkav, konvex) ausgebil-

det werden können. Der Vorteil dieser Herstellungsart ist, dass sie sehr

einfach ist und das die Fokussierungszeiten kürzer sind als bei den im

folgenden beschriebenen IPG-Gelen.

Die andere Art ist die Herstellung von Gelen mit immobilisier-

ten pH-Gradienten (IPG-Gel). Die Immobilisierung des pH-Gradienten

wird durch amphotere Acrylamid-Derivate erreicht, die kovalent an

die Gelmatrix gebunden sind. Es gibt verschiedene dieser Acrylamid-

Derivate, die wohl definierte Substanzen mit einem bestimmten pI-

Wert darstellen. Die Vor- und Nachteile kehren sich im Vergleich zum

Ampholyt-Gel um. Die Herstellung der Gele ist komplizierter und auf-

wändiger. Dafür aber ist der pH-Gradient, wie der Name schon sagt,

immobilisiert und kann durch äußere Einflüsse nicht verändert wer-

den. Und da sich die Acrylamid-Derivate immer wieder mit gleichblei-

bender Qualität herstellen und exakt mischen lassen, sind IPG-Gele

mit identischen pH-Gradienten sehr reproduzierbar verfügbar. Die Art

und die Weite des Gradienten lässt sich sehr genau kontrollieren.

Beide Arten von Gelen sind auch kommerziell erhältlich, allerdings

nicht immer mit den gewünschten pH-Gradienten und Abmessungen.

Da Proteine bei ihrem pI stark an Löslichkeit verlieren und zu Prä-

zipitation neigen, werden IEF-Gelen oft Substanzen zugegeben, die die

Löslichkeit verbessern. Eine dieser chaotropen Substanzen ist Harn-

stoff. Aber z.B. auch Sukrose kann diese Aufgabe erfüllen. Außerdem

2.1. DIREKTER NACHWEIS

hilft Sukrose durch Erhöhung der Viskosität den elektroendosmoti-

schen Fluss zu unterdrücken. Der elektroendosmotische Fluss ist ein

Phänomen, das Auftritt, wenn im elektrischen Feld die gegensätzli-

chen Ladungen der Gelmatrix und des darin enthaltenen Wassers da-

zu führen, dass das Wasser Richtung Kathode transportiert wird. Dies

führt zur Entwässerung des Gels und ist unerwünscht.

Nach der Trennung müssen die EPO-Isoformen noch detektiert

werden. Wegen der extrem kleinen Mengen an EPO in der Zirkula-

tion und dem großen Überschuss an anderen Substanzen muss die

Detektionsmethode hohe Ansprüche an Selektivität, Spezifizität und

Nachweisgrenze erfüllen. Die Methode der Wahl für die Detektion von

Proteinen nach Elekrophorese ist das Immunoblotting. Dabei werden

die Proteine aus dem Gel auf eine Membran transferiert. Dieser Trans-

fer kann durch ein Druckgefälle oder durch Anlegen eines elektrischen

Feldes orthogonal zum Gel erfolgen. Die letztere Variante heißt Elek-

troblotting und zeichnet sich durch eine hohe Transferrate aus. Beim

Elektroblotting von IEF-Gelen ergibt sich eine Besonderheit: Da die

Proteine sich an ihrem pI befinden und damit keine Ladung haben,

wären sie auch durch ein elektrisches Feld nicht zu transferieren. Des-

halb muss das Gel vor dem Transfer in einem Puffer equilibriert wer-

den. Bei diesem Schritt wird dann auch gleich ein großer Teil des z. B.

Harnstoffes entfernt, da er sich störend auf die Detektion auswirken

würde.

Die transferierten Proteine bleiben aufgrund hydrophober oder

elektrostatischer Wechselwirkungen an der Oberfläche der Membran

haften und sind so sehr gut für spezifische Antikörper zugänglich.

Beim klassischen Immunoblotting ist der primäre Antikörper spezi-

fisch auf den Analyten und nicht markiert. Auf diese Weise ist er durch

klassische immunologische Methoden zugänglich und es besteht nicht

die Gefahr eines Aktivitätsverlustes durch eine Markierung.

Ein sekundärer Antikörper, der in einer zweiten Tiergattung ex-

primiert wurde und gegen die Tiergattung des primären Antikörpers

spezifisch ist, ist markiert. Der sekundäre Antikörper bindet an den

primären und kann dann wegen seiner Markierung detektiert werden.

Diese Markierung kann ein Chromophor oder Fluorophor sein und

mit einem geeigneten Photometer kann dann sofort detektiert werden.

Oder die Markierung ist ein Enzym, dann wird ein Substrat umgesetzt,

das dann detektiert wird. Diese Variante hat eine Verstärkungswir-

kung. Der Nachteil dieser Varianten ist, dass die Chromophore, Fluo-

rophore und Enzyme in der Regel größere Moleküle sind, die die Akti-

vität des an sie gebundenen Antikörpers vermindern können.

KAPITEL 2. EXPERIMENTELLER TEIL

Darum hat sich eine weitere Variante durchgesetzt: Der sekundäre

Antikörper ist mit Biotin konjugiert, das ein relativ kleines Molekül

ist. Damit ist ein möglicher Aktivitätsverlust minimiert. Avidin bzw.

Streptavidin bindet sehr spezifisch an Biotin. Die Bindungskonstan-

te ist eine der stärksten in der Natur bekannten und steht nur wenig

hinter einer kovalenten Bindung zurück. Wenn nun das Chromophor,

Fluorophor oder Enzym mit Streptavidin konjugiert wird, kann es so

an den Antigen-primärer Antikörper-sekundärer Antikörper-Komplex

gebunden werden und für alle Bindungsschritte wurde eine maxi-

mal mögliche Aktivität erhalten. Als eine der empfindlichsten und

unkompliziertesten Markierungen hat sich das Enzym Meerrettich-

Peroxidase durchgesetzt. In Verbindung mit einem Luminol-Peroxid

haltigen Substratgemisch kann mittels der auftretenden Chemilumi-

neszenz bis in niedrigste Bereiche detektiert werden.

Der Ablauf der Detektion mit primärem Antikörper, sekun-

därem Antikörper, der mit Biotin konjugiert ist, einem Streptavidin-

Peroxidase-Konjugat und dann einer Substratinkubation erscheint zu

aufwändig und komplex. Aber alle Schritte wirken sich günstig auf die

Empfindlichkeit aus und schaffen eine große Flexibilität. Bei einem

anderen Antigen kann ein bestehendes System erhalten werden, es

muss nur der primäre Antikörper innerhalb der gleichen Tiergattung

angepasst werden. Bei einem markierten ersten Antikörper wäre dies

nicht so ohne weiteres möglich. Allerdings gibt es auch einen entschei-

denden Nachteil für die Detektion: wenn der sekundäre Antikörper

hohe Kreuzreaktivitäten mit den IgGs anderer Gattungen zeigt. Dann

kommt es zu einer wesentlichen Erhöhung des Untergrundes und

damit zu einer wesentlich höheren Nachweisgrenze.

Lasne

hat durch eine Modifikation der klassischen Methode die-

ses Problem sehr elegant gelöst. Der Antigen-primärer Antikörper-

Komplex wird im sauren Milieu gelöst und der primäre Antikörper

dann auf eine zweite Membran geblottet. Dadurch entsteht auf der

zweiten Membran ein Spiegelbild der Anordnung des Antigens auf der

ersten Membran, ohne dass die durch hydrophobe Wechselwirkungen

gebundenen Proteine mit transferiert werden. Da sich auf der zweiten

Membran nur der primäre Antikörper befindet, kann der sekundäre

Antikörper nicht mehr kreuzreagieren und der Untergrund, und da-

mit auch die Nachweisgrenze, sind sehr niedrig. Erst durch diese Mo-

difikation wurde die Detektion von endogenem EPO möglich, das aus

praktikablen Urinmengen von Athleten isoliert wurde.

Details

Seiten
Erscheinungsform: Originalausgabe
Erscheinungsjahr: 2004
ISBN (eBook): 9783832440978
ISBN (Paperback): 9783838640976
DOI: 10.3239/9783832440978
Dateigröße: 1.2 MB
Sprache: Deutsch
Institution / Hochschule: Deutsche Sporthochschule Köln – III
Erscheinungsdatum: 2005 (Februar)
Note: 1,0
Schlagworte: isoelektrische fokussierung hämatologie immuno blotting urin
Produktsicherheit: Diplom.de

Autor

Andreas Breidbach (Autor:in)